DE3702159A1

DE3702159A1 - Quantitative bestimmung von l-fucose

Info

Publication number: DE3702159A1
Application number: DE19873702159
Authority: DE
Inventors: Takeshi Sakai; Susumu Matsui; Sumiko Akiyoshi; Akira Obayashi
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1986-01-29
Filing date: 1987-01-26
Publication date: 1987-08-06
Also published as: JPS62175197A; DE3702159C2; US4927753A; JPH064038B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose in Probenlösungen durch Verwendung von L-Fucosedehydrogenase, die ihr optimales pH um den Neutralitätspunkt hat.

Die α-L-Fucosylgruppen, die an die nicht reduzierenden Enden oder Seitenketten von komplexen Glycochainen gebunden sind, welche von höheren Tieren stammen, spielen eine wichtige Rolle bei der Zellerkennung und der Immunantwort. Zum Beispiel dient diese Gruppe als antigene Determinante in den ABO und Lewis Blutgruppen, und Untersuchungen über die Beziehung zwischen der Glycochainstruktur der Blutgruppensubstanzen und der antigenen Spezifität haben in den letzten Jahren besondere Aufmerksamkeit gefunden. Außerdem werden maligne Veränderungen von Zellen in ausgeprägten Veränderungen in den betroffenen Glycochainen oder Glycolipiden reflektiert, und die mit Tumoren in Beziehung stehenden Glycolipide sind in vielen Fällen diejenigen, in welchen Veränderungen an den nicht reduzierenden Enden der Glycochaine erfolgten, welche dem betroffenen Gewebe angehören - ein Phänomen, das nahe mit der Differenzierung von Gewebe verwandt ist. Dies bedeutet, daß der Krebs eines inneren Organs von der Ansammlung von L-Fucose-haltigem Glycolipid begleitet ist, das spezifisch für dieses Organ ist. Da diese mit Krebs in Beziehung stehenden Glycochainantigene auch in das Blut freigesetzt werden, wird die strukturelle Analyse von Glycochainantigenen im Blut für die Diagnose von Krebs in inneren Organen benutzt. α-L-Fucosidase, ein Enzym, das auf die α-L-Fucosylgruppe in komplexen Glycolipiden unter Freisetzung von L-Fucose einwirkt, ist wirksam für die Analyse der Lage dieser Gruppe an verschiedenen Glycochainen. Der Grad der malignen Veränderungen kann abgeschätzt werden, wenn die enthaltene L-Fucose durch die Einwirkung dieses Enzyms oder durch chemische Behandlung bei 100°C für eine Stunde in Gegenwart von 0,1 N Trichloressigsäure freigesetzt und dann die freigesetzte L-Fucose quantitativ bestimmt wird. Der Gehalt an L-Fucose im Blut wird als Index für den Grad der malignen Veränderung angenommen, da es mit dem Fortschritt des Krebses abnimmt und zunimmt, wenn der Krebs sich als Ergebnis von Chemotherapie zurückbildet.

Es sind verschiedene Methoden zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose bekannt. Zu diesen gehören ein Verfahren, bei welchem eine Fraktion, die freie L-Fucose enthält, aus Probenlösungen durch Gelfiltration oder Ionenaustauschtechnik erhalten wird, worauf eine gaschromatographische Bestimmung erfolgt (Methods in Enzymology, 28, 738 (1972)) sowie ein Verfahren, das quantitaitv Acetaldehyd bestimmt, das durch Perjodatoxidation von L-Fucose gebildet ist (Journal of Biological Chemistry, 245, 1659 (1970)). Diese chemischen Prozesse sind sehr mühsam in der Durchführung und auch unzufriedenstellend hinsichtlich der Meßgenauigkeit. Die enzymatische Methode unter Verwendung einer L-Fucosedehydrogenase andererseits gewährleistet eine rasche und richtige Bestimmung von L-Fucose ohne Erfordernis für dessen Isolation aus den Probenlösungen. Diese enzymatische Methode hat jedoch auch einige Nachteile und Probleme wie oben erläutert. Es wurde mitgeteilt, daß L-Fucosedehydrogenase in den Zellen von Pullularia pullulans und in der Leber von Schweinen und Kaninchen vorliegt. Dieses Enzym, gleichgültig, ob es microbiellen oder tierischen Ursprungs ist, hat ein optimales Reaktions-pH in der Nähe von 10, was unerwünscht ist, da die wirksame Bestimmung von L-Fucose nicht ohne Schädigung von lebenden Zellen durchgeführt werden kann. Außerdem hat die oben erwähnte α-L-Fucosidase ihr optimales Reaktions-pH im sauren oder schwach sauren Bereich und übt wenig Einfluß bei einem pH-Wert in der Nähe von 10 aus. Es war daher unpraktisch, L-Fucose in einem komplexen Glycochain in einer Stufe durch Einwirkung von α-L-Fucosidase und L-Fucosedehydrogenase zu bestimmen. Statt dessen muß man ein umständlicheres Verfahren wählen, wobei α-L-Fucosidase zuerst auf eine Probenlösung im sauren oder schwach sauren Bereich zur Freisetzung von L-Fucose einwirken gelasen wird, worauf dann das Reaktionsgemisch alkalisch gemacht und L-Fucosedehydrogenase zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose einwirken gelassen wird.

Ziel dieser Erfindung ist eine rasche, einfache und billige Methode zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose, welche eine L-Fucosedehydrogendae verwendet, welche ihr optimales Reaktions-pH um den Neutralitätspunkt hat.

Nach ausführlichen Untersuchungen über solch eine quantitative Methode wurde nun gefunden, daß dieses Ziel durch Verwendung einer spezifischen L-Fucosedehydrogenase erreicht werden kann.

Kurz gesagt, bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose, das darin besteht, eine L-Fucosedehydrogenase, die ihr optimales Reaktions-pH um den Neutralitätspunkt hat, auf eine Probenlösung in Gegenwart oder Abwesenheit einer α-L-Fucosidase einwirken zu lassen und die Menge an so gebildetem reduzierten Nicotinamidadenindinucleotid zu messen.

Das Verfahren der Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß eine spezifische L-Fucosedehydrogenase, die ihr optimales Reaktions-pH um den Neutralitätspunkt hat, zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose verwendet wird, und daß die quantitative Bestimmung von L-Fucose unter Verwendung einer solchen spezifischen L-Fucosedehydrogenase in Gegenwart von Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) durchgeführt wird, gefolgt von der Messung der Zunahme in der UV-Absorption (logarythmische Extinktion) des reduzierten Nicotinamidadenindinucleotids (NADH) oder in Gegenwart von NAD, einem Tetrazoliumsalz (oxidierte Form) und Diaphorase oder Phenazinmethosulfat (oxidierte Form), gefolgt von der Bestimmung des gebildeten Formazanfarbstoffes.

Es können Probenlösungen für das Verfahren der Erfindung verwendet werden, welche freie L-Fucose und/oder L-Fucose enthalten, welche an Proben vom Körper gebunden sind.

Jede L-Fucosedehydrogenase, die ihr optimales Reaktions-pH um den Neutralitätspunkt hat, kann für das Verfahren der Erfindung verwendet werden. Ein typisches Beispiel ist das Enzym, das durch Züchtung von Corynebacterium sp. FS-0077 (FERM BP-1234) gebildet wird.

Im nachfolgenden sind die Eigenschaften der L-Fucosedehydrogenase beschrieben, die im Verfahren der Erfindung verwendet werden kann.

(1) Wirkung
Dieses Enzym oxidiert L-Fucose zu L-Fucono-δ-lacton, wie durch die folgende Reaktionsformel gezeigt wird: L-Fucose + NAD⁺ → L-Fucono-δ-lacton + NADH + H⁺
(2) optimales pH
Das optimale pH für dieses Enzym liegt im Bereich von etwa 7,5 bis 8,0.

Messung der Enzymaktivität:

Ein Gemisch von 1,0 ml an 30 mM L-Fucose, 1,8 ml an 200 mM Glycin-NaOH Pufferlösung (pH 8,0), 0,1 ml an 15 mM NAD und 0,1 ml an Enzymlösung mit einer geeigneten Konzentration (insgesamt 3,0 ml) wird bei 37°C 10 Minuten stehengelassen und die Absorption der erhaltenen Lösung bei 340 nm wird gemessen (OD _Probe). Getrennt wird ein entsprechendes Gemisch unter Verwendung von 0,1 ml destilliertem Wasser anstelle der Enzymlösung zubereitet und in der gleichen Weise wie oben behandelt, und die Absorption bei 340 nm wird in gleicher Weise gemessen (OD _Blindprobe)· Δ OD ₃₄₀(OD _Probe - OD _Blindprobe) wird berechnet und die Aktivität der L-Fucosedehydrogenase aus der folgenden Gleichung bestimmt: 6,22: Molekularer Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 nm
d: Optische Weglänge (cm)
df: Verdünnungsfaktor

Die Einwirkung der L-Fucosedehydrogenase auf L-Fucose in Gegenwart von NAD gibt L-Fucono-δ-lacton und NADH. Es kann jede bekannte Methode benutzt werden, um NADH zu bestimmen, z. B. die Messung des molekularen Extinktionskoeffizienten von NAD selbst bei 340 nm oder indem man ein Tetrazoliumsalz (wie Nitroblau-Tetrazolium und Indonitro-Tetrazolium) (in der oxidierten Form) und Diaphorase oder Phenazinmethosulfat (in der oxidierten Form) auf NADH einwirken läßt und dann die Absorption (logarythmische Extinktion) des so gebildeten Formazanfarbstoffes bei 540 bis 580 nm mißt.

Wenn man L-Fucose analysiert, das an Proben vom Körper gebunden ist, wird zuerst L-Fucose durch Einwirkung von α-L- Fucosidase auf die Probenlösung oder durch chemische Behandlung z. B. mit 0,1 N Trichloressigsäure bei 100°C für eine Stunde freigesetzt und die L-Fucosedehydrogenase läßt man dann auf die freie L-Fucose einwirken gefolgt von qualitativer Bestimmung der so gebildeten NADH nach der oben beschriebenen Methode.

Jede α-L-Fucosidase, die von Mikroorganismen (wie einer Spezies der genera Aspergillus, Clostridium oder Fusarium) oder aus Fischen und Schalentieren (wie Turbo cornutus und Charonia lampus) gewonnen ist, kann für die Zwecke der Erfindung verwendet werden. Da diese jedoch ihr optimales pH im sauren oder schwach sauren Bereich haben, ist die Verwendung von α-L-Fucosidase aus Corynebacterium sp. FS-0077 (FERM BP-1234) am vorteilhaftesten, die ihr optimales pH um den Neutralitätspunkt hat.

Es gibt keine speziellen Beschränkungen bezüglich der Art von Pufferlösung, die im Verfahren der Erfindung verwendet wird. Phosphat-, Tris-, Glycin- und Good's-Puffer können mit Vorteil verwendet werden, wobei der bevorzugte pH-Bereich von 6 bis 10, insbesondere bevorzugt von 7,5 bis 8,5, liegt.

Die L-Fucosedehydrogenase wird vorzugsweise in einer Menge von 0,2 bis 20 Einheiten, am bevorzugtesten von 1 bis 5 Einheiten, verwendet, während Diaphorase vorzugsweise in einer Menge von 0,5 bis 20 Einheiten, noch bevorzugter 1 bis 5 Einheiten, angewandt wird. Wenn man freie L-Fucose analysiert, sollten die Mengen an verwendetem Tetrazoliumsalz (oxidierte Form) und NAD wenigstens äquimolar zu der von L-Fucose sein. Wenn α-L-Fucosidase verwendet wird, um gebundene L-Fucose freizusetzen, sollte sie in einer Menge von 1 bis 50 Einheiten, vorzugswesie etwa 5 Einheiten, angewandt werden, und die Reaktion sollte vorzugsweise bei 20 bis 40°C für 2 bis 20 Minuten durchgeführt werden. In diesem Falle kann die Probenlösung auch L-Fucosedehydrogenase, Tetrazoliumsalz (oxidierte Form) und Diaphorase oder Phenazinmethosulfat (oxidierte Form) enthalten.

Das Verfahren zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose, das oben beschrieben ist, kann in den folgenden Reaktionformeln zusammengefaßt werden:

(a): α-L-Fucosidase
(b): L-Fucosedehydrogenase
(c): Diaphorase

Wie aus dem obigen ersichtlich ist, liefert die Erfindung ein neues Verfahren zur colorimetrischen Bestimmung von L- Fucose, das für die klinische Prüfung wertvoll ist und das sehr einfach, hochempfindlich und spezifisch ist. Außerdem kann die im Verfahren der Erfindung benutzte L-Fucosedehydrogenase in großen Mengen aus Mikroorganismen bei geringen Kosten erhalten werden.

Die folgenden Beispiele und die Figurenbeschreibung erläutern die Erfindung:

Fig. 1 ist eine Calibrierungskurve von Beispiel 1, welche die Beziehung zwischen der Menge an verwendeter L-Fucose und dem Unterschied in der Absorption (logarythmische Extinktion) bei 560 nm zeigt,

Fig. 2 ist eine Calibrierungskurve von Beispiel 2, welche die Beziehung zwischen der Menge an verwendeter L-Fucose und dem Unterschied Absoprtion bei 560 nm zeigt,

Fig. 3 ist eine Calibrierungskurve von Beispiel 3 und zeigt die Beziehung zwischen der Menge an verwendeter 2′-Fucosyllyctose und dem Unterschied in der Absorption bei 340 nm, und

Fig. 4 ist eine Calibrierungskurve von Beispiel 4, welche die Beziehung zwischen der Menge an verwendeter 2′-Fucosyllactose und dem Unterschied in der Absorption bei 560 nm zeigt.

Beispiel 1 (Bestimmung von L-Fucose)

Zur obigen Mischung (insgesamt 1,4 ml) wurden je 0,1 ml L-Fucoselösung (0; 0,025; 0,05; 0,075; 0,1; 0,125 und 0,15 mM Konzentration) zugegeben, und jede der erhaltenen Lösungen wurde bei 37°C 10 Minuten stehengelassen und dann die Absorption bei 560 nm gemessen. Wir in Fig. 1 gezeigt, war eine gute lineare Beziehung zwischen der Menge an verwendeter L-Fucose und der Zunahme der Absorption bei 560 nm zu beobachten.

Beispiel 2 (Bestimmung von L-Fucose)

Zur obigen Mischung (insgesamt 1,4 ml) wurden je 0,1 ml L-Fucoselösung zugegeben (0; 0,025; 0,05; 0,075; 0,1; 0,125 und 0,15 mM Konzentration), und jede der erhaltenen Lösungen wurde bei 37°C 10 Minuten stehengelassen und dann die Absorption bei 560 nm gemessen. Wie in Fig. 2 gezeigt, wurde eine gute lineare Beziehung zwischen der Menge an verwendeter L-Fucose und der Zunahme in der Absorption bei 560 nm festgestellt.

Beispiel 3 (Bestimmung von L-Fucose in 2′-Fucosyl-lactose)

Zur obigen Mischung (ingesamt 1,4 ml) wurden je 0,1 ml Lösung von 2′-Fucosyl-lactose aus menschlicher Milch zugefügt (0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 und 0,5 mM Konzentrationen), und jede der erhaltenen Lösungen wurde bei 37°C 10 Minuten stehengelassen. Wie in Fig. 3 gezeigt, wurde eine gute lineare Beziehung zwischen der Menge an verwendeter L-Fucosyl- lactose und der Zunahme in der Absorption bei 340 nm beobachtet.

Beispiel 4 (Bestimmung von L-Fucose in 2′-Fucosyl-lactose)

Zur obigen Mischung (insgesamt 1,4 ml) wurden je 0,1 ml Lösung von 2′-Fucosyl-lactose aus menschlicher Milch zugefügt (0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 und 0,5 mM Konzentrationen), und jede der erhaltenen Lösungen wurde bei 37°C 10 Minuten stehengelassen. Wie in Fig. 4 gezeigt, wurde eine gute lineare Beziehung zwischen der Menge an verwendeter 2′-Fucosyl- lactose und der Zunahme in der Absorption bei 560 nm festgestellt.

Wir oben ausführlicher erläutert, gestattet das Verfahren der Erfindung die raschere und einfachere quantitative Bestimmung von L-Fucose bei geringeren Kosten als herkömmliche Methoden und ist daher von großem Wert in der klinischen Prüfung.

Die folgenden Bezugsbeispiele bechreiben die Herstellung von L-Fucosedehydrogenase und α-L-Fucosidase, die bei der Durchführung der Erfindung benutzt werden können.

Bezugsbeispiel 1 (Herstellung von L-Fucosedehydrogenase)

Ein Züchtungsmedium (100 ml), das 0,5% Hefextrakt, 1,0% Pepton, 0,3% KH₂PO₄ und 0,1% MgSO₄ · 7H₂O enthält (pH 7,0) wurde in einen 500 ml Erlenmeyerkolben eingebracht und bei 120°C 20 Minuten lang sterilisiert. Dann wurde dieses Medium mit Corynebacterium sp. FS-0077 (FERM BP 1234) beimpft und bei 30°C 24 Stunden lang inkubiert, um eine Stammkultur zu liefern. Getrennt wurde ein Medium (15 Liter) angesetzt, das 0,1% L-Fucose, 0,5% Pepton, 0,3% KH₂PO₄, 0,1% MgSO₄ · 7H₂O und 0,01% (Vol./Vol.) eines Entschäumungsmittel enthielt (CB-422; Nippon Oils & Fats Co., Ltd.) und dessen ph 7,0 war und in einen 39-l Fermentationstopf gegeben und bei 120°C 20 Minuten lang sterilisiert. Nach Abkühlen wurden 100 ml der oben hergestellten Stammkultur in das Fermentationsgefäß gegeben und die Züchtung wurde bei 30°C 36 Stunden unter Belüftung (15 Liter/Min.) und Rühren 300 Upm) durchgeführt. Dann wurden die Mikrobenzellen durch Zentrifugieren gesammelt, in 500 ml eines 50 mM Phosphatpuffers (pH 8,0) suspendiert und durch Ultraschallbehandlung zerbrochen. Das erhaltene Gemisch wurde zentrifugiert, was 540 ml Überstand ergab. Seine L-Fucosedehydrogenase-Aktivität betrug 37,4 Einheiten/ml. Dieser Überstand wurde an DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia), das in eine Säule von 5,0 cm Durchmesser und 10 cm Länge gepackt und vorher mit 50 mM Phosphatpuffer ins Gleichgewicht gesetzt war, absorbiert und die Säule mit 100 mM Phosphatpuffer gewaschen und der absorbierte Teil mit 300 mM Phosphatpuffer eluiert, um die aktive Fraktion zu sammeln. Natriumchlorid wurde zur gesammelten Fraktion so zugesetzt, daß sich eine Salzkonzentration von 4 M ergab, und die erhaltene Lösung wurde an Phenyl-Sepharose CL-4B (Pharmacia), die in eine Säule von 2,5 cm Durchmesser und 20 cm Länge gepackt und vorher mit 100 mM Phosphatpuffer, der 4 M Natriumchlorid enthielt, ins Gleichgewicht gesetzt war, adsorbiert. Die Säule wurde mit 20 mM Phosphatpuffer, der 3 M Natriumchlorid enthielt, gewaschen, und der adsorbierte Teil wurde mit 20 mM Phosphatpuffer, des 1 M Natriumchlorid enthielt, eluiert, um die aktive Fraktion zu sammeln. Die gesammelte Fraktion wurde wieder an Phenyl-Sepharose CL-4B (Pharmacia), gepackt in einer Säule von 2,5 cm Durchmesser und 10 cm Länge, adsorbiert, und der adsorbierte Teil mit 50 mM Phosphatpuffer, der 2 M Natriumchlorid enthielt, eluiert, und das Eluat durch ein Kollodiummembran konzentriert. Das Konzentrat wurde der Gelfiltration durch Sepharose CL-6B, gepackt in eine Säule von 2,5 cm Durchmesser und 90 cm Länge, die vorher mit 100 mM Phosphatpuffer ins Gleichgewicht gesetzt war, unterworfen, und die gesammelte aktive Fraktion wurde wieder konzentriert, gefolgt von Gelfiltration durch eine Sephacryl S-200 Säule von 2,5 cm Durchmesser und 100 cm Länge (Pharmacia). nach Zugabe von EDTA als Stabilisator auf eine Endkonzentration von 1 mM wurde das Filtrat gefriergetrocknet, was 820 mg an gereinigtem Enzympulver ergab. Dieses Pulver hatte eine relative Aktivität von 8,41 Einheiten/mg und zeigte eine einzige Bande bei der Messung durch Scheibenelektrophorese an Polyacrylamidgel.

Bezugsbeispiel 2 (Herstellung von α-L-Fucosidase)

Ein Züchtungsmedium (100 ml), ds 0,5% Hefeextrakt, 1,0% Pepton, 0,3% KH₂PO₄ und 0,1% MgSO₄ · 7H₂O enthielt (pH 7,0) wurde in einen 500 ml Erlenmeyerkolben gegeben und bei 120°C 20 Minuten lang sterilisiert. Dieses Medium wurde mit Corynebacterium sp. FS-0077 (FERM BP-1234) beimpft und bei 30°C 24 Stunden lang inkubiert, um eine Stammkultur zu ergeben. Getrennt wurde ein Medium (5 Liter), das 0,1% L-Fucose, 0,5% Pepton, 0,3% KH₂PO₄, 0,1% MgSO₄ · 7H₂O und 0,01% (Vol./Vol.) eines Entschäumungsmittels (CB-442; Nippon Oils (Fats Co., Ltd.) enthielt (pH 7,0) in einem 30-l Fermentationstopf angesetzt und bei 120°C 20 Minuten lang sterilisiert. Nach Abkühlen wurden 100 ml der oben hergetellten Stammkultur in das Fermentationsgefäß gegeben, und die Züchtung wurde bei 30°C 40 Stunden lang unter Belüftung (15 Liter/Min.) und Rühren (250 Upm) durchgeführt. Dann wurden die Mikroorganismenzellen durch Zentrifugieren gesammelt, in 500 ml eines 50 mM Phosphatpuffers (pH 8,0) suspendiert und durch Ultraschallbehandlung zerbrochen. Das erhaltene Gemisch wurde zentrifugiert, was 550 ml Überstand ergab. Seine α-L-Fucosidase-Aktivität betrug 26 Einheiten/ml. Dieser Überstand wurde an DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia) adsorbiert, die in eine Säule von 5,0 cm Durchmesser und 10 cm Länge gepackt und vorher mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) ins Gleichgewicht gesetzt war, die Säule wurde mit 150 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) gewaschen und der adsorbierte Teil it 300 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) eluiert, um die aktive Fraktion zu sammeln. Die gesammelte Fraktion wurde durch Ultrafiltration konzentriert und entsalzt, und das Konzentrat wurde wiederum an DEAE-Sepharose, gepackt in einer Säule von 2,5 cm Durchmesser und 10 cm Länge und vorher mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) ins Gleichgewicht gesetzt, adsorbiert und in der gleichen Weise wie oben eluiert, um die aktive Fraktion zu sammeln. Zur gesammelten Fraktion wurde Natriumchlorid zugegeben, so daß sich eine Salzkonzentration von 4 M ergab, und die erhaltene Lösung wurde an Phenyl- Sepharose CL-4B (Pharmacia) adsorbiert, in eine Säule von 2,5 cm Durchmesser und 20 cm Länge gepackt, die vorher mit 100 mM Phosphatpuffer, der 4 M Natriumchlorid enthielt (pH 8,0) ins Gleichgewicht gesetzt war. Die Säule wurde mit 10 mM Phosphatpuffer, der 4 M Natriumchlorid enthielt (pH 8,0) gewaschen, und der adsorbierte Teil wurde mit 10 mM Phosphatpuffer, der 3 M Natriumchlorid enthielt, eluiert, um die aktive Fraktion zu sammeln. Die gesammelte Fraktion wurde durch ein Kollodiummembran konzentriert, und das Konzentrat wurde der Gelfiltration durch Sepharose CL-6B (Pharmacia), gepackt in eine Säule von 2,5 cm Durchmesser und 90 cm Länge, die vorher mit 100 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) ins Gleichgewicht gesetzt war, unterworfen. Nach Zugabe von ADTA als Stabilisator auf eine Endkonzentration von 1 mM wurde das Filtrat gefriegetrocknet, was 780 mg gereinigtes Enzympulver ergab. Dieses Pulver hatte eine relative Aktivität von 9,59 Einheiten/mg und zeigte eine einzige Bande, wenn sie durch Scheibenelektrophorese an Polyacrylamidgel gemessen wurde.

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose in einer Probenlösung, dadurch gekennzeichnet, daß man eine L-Fucosedehydrogenase, die ihr optimales pH um den Neutralitätspunkt hat, auf diese Probenlösung in Gegenwart oder Abwesenheit einer α-L-Fucosidase einwirken läßt und die Menge des so gebildeten reduzierten Nicotinamid-Adenin-dinucleotids mißt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die L-Fucose in der Probenlösung als freie L-Fucose und/ oder als an die Proben vom Körper gebundede L-Fucose vorliegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die L-Fucosedehydrogenase ein Enzym ist, das von einer Spezies der Genus Corynebacterium stammt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die α-L-Fucosidase ein Enzym ist, das von einer Spezies der Genus Corynebacterium stammt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung der L-Fucose bewirkt wird, indem man die Ultraviolett- Absorption des gebildeten reduzierten Nicotinamid- Adenin-dinucleotids mißt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung der L-Fuciose in Gegenwart von reduziertem Nicotinamid-Adenin-dinucleotid, einem Tetrazoliumsalz (oxidierte Form) und Diaphorase oder Phenazinmethosulfat (oxidierte Form) durchgeführt wird.

7. Zusammensetzung zur quantitativen Bestimmung von L-Fucose, enthaltend die folgenden Komponenten (A), (B), (C) und (D):

(A) eine L-Fucosedehydrogenase, die ihr optimales pH um den Neutralitätspunkt hat;
(B) Nicotinamid-Adenin-dinucleotid;
(C) ein Tetrazoliumsalz (oxidierte Form);
(D) Diaphorase oder Phenazinmethosulfat (oxidierte Form).

8. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch eine abgemessene Menge der Zusammensetzung nach Anspruch 7 sowie einer abgemessenen Menge einer annähernd neutralen Pufferlösung und einer abgemessenen Menge an α-L-Fucosidase.

9. Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl zwei Glycin/NaOH Puffer vom pH 8 und 8,5 als auch ein Phosphatpuffer von pH 8,5 und eine Trichloressigsäurelösung im Kit enthalten sind.

10. Kit nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Tetrazoliumsalz der Zusammensetzung nach Anspruch 7 Nitroblau-Tetrazolium in der oxidierten Form ist.

11. Kit nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß für Bezugsproben L-Fucoselösung einerseits und 2′-Fucosyl-lactose aus menschlicher Milch jeweils in abgestuften Konzentrationen andererseits im Kit enthalten sind.