DE3838718C2

DE3838718C2 - Verfahren zum Aufspüren von Magengeschwüren, Leberzirrhose und Karzinomen in Menschen

Info

Publication number: DE3838718C2
Application number: DE3838718A
Authority: DE
Inventors: Takeshi Sakai; Hiroko Yokota; Kazuki Yamamoto; Sadaji Yokoyama; Susumu Matsui; Ikunoshin Kato; Akira Obayashi
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1987-11-19
Filing date: 1988-11-15
Publication date: 1996-09-26
Anticipated expiration: 2008-11-16
Also published as: JPH01244741A; US4927767A; DE3838718A1; JP2613085B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Aufspüren von Magengeschwüren, Leberzirrhose und Karzinomen in Menschen.

Verschiedene Formen von komplexen Glykoketten, das heißt Glykoproteinen und Glykolipiden, liegen in dem lebenden Körper von höheren Tieren vor. Die meisten dieser komplexen Glykoketten enthalten als Bestandteil L-Fucose. Die kom plexen Glykoketten, welche L-Fucose in der Kette enthalten, werden beispielsweise durch ein Mucoglykoprotein, das die Magenschleimhaut schützt, ein Mucoglykoprotein, das aus den Unterkieferdrüsen ausgeschieden wird, saures alpha₁-Glyko protein und beta₂-Glykoprotein, das durch die Leber synthetisiert und von ihr ausgeschieden wird, ein Glyko protein an der Oberfläche der Erythrozytenmembran und gamma-Globulin, das in dem Knochenmark gebildet wird, sowie andere Glykoproteine und Colipide, die sich auf der Oberfläche der Zellmembran finden, repräsentiert. Wie vorstehend erwähnt, gibt es eine Vielzahl von komplexen Glykoketten, welche L-Fucose in dem lebenden Körper enthalten. Andererseits ist es bekannt, daß sich die Struktur der Zuckerketten in den komplexen Glykoketten, welche L-Fucose enthalten, ändert, oder daß die Menge dieser Glykoketten in der Körperflüssigkeit sich bei einigen Krankheiten verändert. Die berichteten Fälle betreffen beispielsweise die verminderte Sekretion von Mucoglykoprotein bei Magengeschwüren oder -krebs, die verminderte Sekretion von Glykoproteinen, wie saurem alpha₁-Glykoprotein, im Falle von Leberzirrhose und Primärtumoren der Leber und Veränderungen der Zuckerkettenstruktur von Glykoproteinen und Glykolipiden auf der Zelloberflächenmembran, welche auf die Karzinogenese der Zellen zurückgehen.

Diese Berichte beschreiben jedoch nur einfach die Veränderungen der Struktur von Glykoketten oder der Menge der Glykoketten und erläutern nicht jeweils die einzelnen Stoffwechselveränderungen in den Sacchariden dieser Glykoketten im Krankheitszustand.

Aus CA 88 (23): 16 81 47, CA 85 (21): 15 76 25 k, CA 92 (25): 21 32 49 x und DE-A1-37 02 159 sind Verfahren zum Nachweis verschiedener Krankheiten, wie Tumoren, bekannt, wobei gebundene Fucose bestimmt wird.

Gegenstand der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Aufspürung eines Magengeschwürs, einer Leberzirrhose und/oder eines Krebses in Menschen, das sich dadurch auszeichnet, daß die Konzentration an freier L-Fucose mit ihrem normalen Wert in einer Urinprobe aus dem Subjekt verglichen wird.

Es wurde festgestellt, daß höhere Konzentrationen an freier L-Fucose in Urinproben vorliegen, die aus Patienten mit Magengeschwüren, Leberzirrhose und Krebsen, wie Magenkrebs, Primärtumore der Leber, Brustkrebs, myelogene Tumore, Lungenkrebs und Darmkrebs, vorliegen als im Falle von Proben, die aus gesunden Individuen entnommen worden sind, wobei gefunden wurde, daß die Konzentration an freier L-Fucose als Index für die Krankheiten verwendet werden kann.

Urinproben werden bevorzugt, da sie einfach zu sammeln und zu verwenden sind.

Erfindungsgemäß unterliegen die Methoden zum Messen der freien L-Fucose in den Proben keinerlei Einschränkungen, beispielsweise kommen enzymatische Methoden und die HPL-Chromatographie (high performance liquid chromatography) in Frage.

Die enzymatischen Methoden sind diejenigen, die L-Fucose- Dehydrogenase (nachfolgend als FDH bezeichnet) verwendet. Wie in der japanischen Patentanmeldung Kokai No. 175197/87 ausgeführt wird, bestimmt dann, wenn FDH verwendet wird, eine Methode die freie L-Fucosekonzentration anhand der Extinktion von NADH bei 340 nm, während eine andere die Konzentration anhand der Extinktion von Formazanfarbstoff bei einer Wellenlänge im sichtbaren Spektrum berechnet.

Die FDH, die zur quantitativen Analyse verwendet wird, ist beispielsweise eine solche, wie sie in der japanischen Patentanmeldung Kokai No. 155085/87 aufgeführt wird, während eine andere auf Schweineleber zurückgeht. Darüber hinaus ist es dann, wenn FDH verwendet wird, vorzuziehen, die Proben mit Bilirubinoxidase zu behandeln, da diese Methode den Blindwert herabsetzt.

Ferner kann die Konzentration an freier L-Fucose durch HPL-Chromatographie gemessen werden. Die Mengenbestimmung durch HPL-Chromatographie erfolgt beispielsweise durch den Einsatz von im Handel verfügbaren Instrumenten, wie sie von der Shimadzu Seisakusho Co. und Dionex Corporation hergestellt werden.

Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen sowie der folgenden Beispiele näher erläutert. Die Erfindung ist jedoch nicht auf Einzelheiten der Beschreibung der folgenden Beispiele beschränkt.

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, die durch Auftragen der Urinkonzentration an freier L-Fucose, gemessen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, durch einen Patienten angefertigt worden ist.

Die Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Eichkurve zur Messung der Urinkonzentration nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Beispiel 1

Die Konzentrationen an freier L-Fucose wurden unter Verwendung von Urinproben aus 21 gesunden Individuen, 7 Patienten mit Magengeschwür, 5 Patienten mit Leberzirr hose, 35 Patienten mit Magenkrebs, 12 Patienten mit Primärtumoren der Leber, 5 Patienten mit Lungenkrebs, 6 Patienten mit Brustkrebs und 5 Patienten mit Darmkrebs und ermittelt.

Die L-Fucose wurde wie folgt gemessen:

Urin\|0,1 ml
1 Einheit/ml Bilirubinoxidase (Takara Shuzo Co., Ltd.), inkubiert bei 37°C während 15 Min.	0,1 ml
300 mM Glycin-Natriumhydroxid gepufferte Lösung (pH 8,2), enthaltend 10 mM Natriumazid	0,25 ml
2 mM Iodnitrotetrazolium	0,15 ml
0,1 ml 1-Methoxyphenazinmethosulfat	0,05 ml
20 mM NAD⁺	0,05 ml
70 Einheiten/ml FDH (Takara shuzo Co., Ltd.), inkubiert bei 37°C während 15 Min.	0,1 ml
0,2 M Chlorwasserstoffsäure	2,0 ml

Man ließ die Reaktionen in der vorstehenden Reihenfolge ablaufen, die Extinktion wurde bei 492 nm gemessen und die Ablesung war OD_t. Zur gleichen Zeit wurden Reaktionen in dem vorstehenden Reaktionssystem unter Verwendung von Wasser anstelle von 70 Einheiten/ml FDH ablaufen gelassen, um eine Extinktion bei 492 nm zu messen. Die Ablesung war OD_b.

OD_t-OD_b = delta-OD

Wurde die Konzentration an freier L-Fucose aus dem delta-OD- Wert berechnet, dann ließ man die Reaktionen in dem vorstehenden Reaktionssystem unter Verwendung von Wasser und 1 mM L-Fucose anstatt Urin ablaufen, wobei die Extinktion bei 492 nm gemessen wurde, um eine graphische Darstellung der Eichkurve durch Auftragen der Extinktion bei 492 nm auf der Ordinate und der freien L-Fucosekonzentration auf der Abszisse aufzuzeichnen. Die Urinkonzentration der L-Fucose wurde auf der Basis der Eichkurve und des delta-OD-Wertes berechnet. Die Fig. 2 zeigt die Eichkurve (Abszisse: L-Fucosekonzentration (mM) und Ordinate: Extinktion bei 492 nm).

Untersuchungsergebnisse von freier Urin-L-Fucose gehen aus der Fig. 1 hervor. Diese Figur ist eine graphische Darstellung, auf welcher die Konzentrationen des Urins an freier L-Fucose, gemessen gemäß vorliegender Erfindung, durch einen Patienten aufgetragen wurden.

Wie aus der Fig. 1 hervorgeht, besteht ein Unterschied in der Verteilung der Konzentrationen einer L-Fucose in dem Urin zwischen gesunden Individuen und Patienten mit Magengeschwür, Leberzirrhose, Magenkrebs, Primärtumoren der Leber und anderen Krebsen. Es wurde gefunden, daß höhere Konzentrationen an freier L-Fucose im Urin bei Patienten mit Magenkrebs, Leberzirrhose und einer Vielzahl von Krebsen vorliegen, und zwar im Vergleich zu gesunden Individuen.

Beispiel 2

Mengenbestimmung an freier L-Fucose durch HPL-Chromato graphie (HPLC):
Werden die Konzentrationen an freier L-Fucose im Urin quantitativ unter den nachfolgend angegebenen Testbe dingungen gemessen, dann werden praktisch die gleichen Konzentrationen wie im Falle des Beispiels 1 erhalten.

Testbedingungen

Säule: Shim-pack CLC-NH₂
6 × 150 mm (Shimadzu Seisakusho Co.)
Mobile Phase: 75% Acetonitril
Temperatur: 30°C
Detektor: Brechungsindex des Detektors Shodex RI SE-51 (Showa Denko Co.)

Wie vorstehend beschrieben, dient erfindungsgemäß die Urinkonzentration an freier L-Fucose als Markierungs mittel für Krankheiten, die im Zusammenhang mit Stoffwechselabnormalitäten von L-Fucose stehen, wie Magengeschwüren, Leberzirrhose, Magenkrebs, Primärtumoren der Leber und anderen Krebsen. Folglich wurde eine neue Methode zur Aufspürung der vorstehenden Krankheiten entwickelt. Insbesondere ermöglicht dieses Verfahren die Aufspürung von Magengeschwüren, Magenkrebs, Leberzirrhose und Primärtumoren der Leber auf billige Weise und ohne Schmerzverursachung, wodurch sich die Ausbeute bei Massenuntersuchungen verbessern läßt.

Claims

Verfahren zum Aufspüren eines Magengeschwürs, einer Leberzirrhose und/oder eines Krebses im Menschen, ge kennzeichnet durch den Vergleich der Konzentration an freier L-Fucose mit ihrem normalen Wert in einer Urin probe aus dem Subjekt.