DE69506272T2 - Bestimmung von freien radikalen - Google Patents
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Description
- Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Reagens, das erlaubt, die Bestimmung der freien Radikale in jeder Art eines Analysegerätes für die klinische Chemie durchzuführen und somit erlaubt, eine derartige Bestimmung in jedem Labor vorzunehmen, wodurch es möglich wird, die üblicherweise verfügbaren Instrumente zu verwenden.
- Wie dem auf dem Gebiet tätigen Fachmann wohlbekannt ist, ist mit dem Begriff "freies Radikal" in der Literatur jede Art von klinischen Spezies gemeint, die in der Lage ist, unabhängig zu existieren und die ein oder mehrere ungepaarte Elektronen auf dem äußersten Orbital (im Atom und/oder Molekül) enthält.
- In den fetzten Jahren hat auf dem medizinischen Gebiet unter den verschiedenen existierenden freien Radikalen Sauerstoff eine herausragende Bekanntheit in Bezug auf die Rolle, die sie für die Bestimmung einer Gewebeschädigung unterschiedlicher pathologischer Zustände annehmen kann.
- In der angelsächsischen Literatur werden freie Radikale bezeichnet als ROMs ("Oxygen Reactive Metabolites" - sauerstoffreaktive Metaboliten), eine Bezeichnung, die im folgenden in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden wird, und sie sind dadurch gekennzeichnet, daß sie eine ungerade Zahl von Elektronen im äußersten Orbital des Sauerstoffs aufweisen. Aufgrund dieser Tatsache reagieren sie chemisch mit vielen biologischen Molekülen.
- Die hauptsächlichen in der Literatur bekannten ROMs sind: das O&sub2;-Anionsuperoxid; das H&sub2;O&sub2; Wasserstoffperoxid, das organische Peroxidradikal R-O&sub2;; das R-O-Alkoxyradikal; das OH-Hydroxyradikal; die OHX-Hypohalidsäuren, worin X Halogen und alle relevanten Amine sein kann.
- In jüngsten Studien sind zahlreiche klinische Bedingungen an Individuen nachgewiesen worden, in denen eine Rolle der ROMs angeführt und nachgewiesen wurde. Insbesondere können genannt werden Entzündungs- und postischämische Erkrankungen des Verdauungstrakts, die Erkrankungen des Zentralnervensystems aufgrund von Gefäß- oder traumatischen Erkrankungen, die Arteriosklerose und seine Herzkomplikationen, einige renale Erkrankungen, die Arthritis deformans und die alkoholinduzierten Erkrankungen in einigen Bereichen des Organismus.
- Bis heute standen jedoch erhebliche Schwierigkeiten der Lokalisierung und Bestimmung freier Radikale in biologischen Proben entgegen, so daß ihre pathogene Rolle in diesen Erkrankungen auf Basis der Wirkung von Antioxidationssubstanzen stark vermindert wurde, die natürlich keine spezifischen Antientzündungswirkungen haben konnten.
- Bis heute sind hauptsächlich, obwohl nicht ausschließlich, die zur Bestimmung der freien Radikale angewendeten Verfahren ESR ("Electron Spin Resonance" - Elektronenspinresonanz) eine hochentwickelte Technik, die nur in Forschungslaboratorien verwendet wird, da sie sehr teuer ist, oder diejenigen, die auf der Verwendung von hochentwickelten Instrumenten basieren und somit nicht auf eine Analyse in Laboratorien der täglichen Standardnachweise anwendbar sind.
- In Anbetracht des obigen scheint es überaus wichtig, ein Reagens wie das zur Verfügung zu haben, welches gemäß der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen wird, welches erlaubt, ein einfaches und schnelles Verfahren zur Bestimmung freier Radikale und ihrer Derivate anzuwenden, um auch eine Überwachung von Antioxidant- Entzündunghemmenden-Therapien durch eine Analyse zu erlauben, die in Standardlaboratorien durchgeführt werden kann.
- Der Anmelder hat auf einer experimentellen Basis bestimmt, daß das N,N- Diethylparaphenylendiamin ((C&sub2;H&sub5;)&sub2;-NC&sub6;H&sub4;NH&sub2;), welches bereits für die Bestimmung von aktivem Chlor in Wasser bekannt ist, in der Lage ist, wenn es in einem geeigneten Puffer und unter speziellen Konzentrations- und pH-Bedingungen eingesetzt wird, hierdurch eine chromogene Reaktion zu bestimmen, um durch Farbbildung nicht nur das Chlor, sondern auch alle die Produkte zu bestimmen, die die Eigenschaft des ungepaarten Elektrons in der äußeren Schale aufweisen, wie etwa das Anionsuperoxid, das Wasserstoffperoxid, die Hydroxylradikale, die Hypohalidsäuren und ihre Amine.
- Ähnliche Ergebnisse sind mit Produkten derselben Kategorie erhalten worden und welche in der beschriebenen und beanspruchten allgemeinen Formel eingeschlossen sind.
- Aus den durchgeführten Tests ist somit beobachtet worden, daß das erfindungsgemäße Reagens es erlaubt, die in einer Probe vorhandenen ROMs quantitativ zu bestimmen. Die entwickelte Farbe hat ein Absorptionsspektrum mit 2 Spitzen, eine bei 510 nm und eine bei 550 nm, wie von dem beigefügten Graph 1 zu sehen ist. Seine Farbintensität ist direkt proportional zu der Konzentration der freien Radikale, die in der Probe vorhanden sind und folgt perfekt dem Lambert-Beerschen-Gesetz, wie auch aus Graph 2 deutlich wird, wenn entweder ein Ablesen bei 510 nm oder ein Ablesen bei 550 nm durchgeführt wird.
- Im Fall, daß die zu untersuchende Probe eine biologische Probe umfaßt (Blut, Plasma, Serum, Liquor etc.) kann die ROMs-Bestimmung durch das Verfahren, das das Reagens gemäß der Erfindung verwendet, entweder mit dem Endablesen der Farbentwicklung (Endpunkt) oder mit dem vorbestimmten Zeitbereich (festgelegter Punkt) und mit einer kontinuierlichen kinetischen Bestimmung durchgeführt werden.
- Dies ist ein Aspekt, der die Verwendung des Reagens gemäß der vorliegenden Erfindung in Hinsicht auf alle momentan bekannten Systeme unterscheidet und diese besonders vorteilhaft macht.
- Tatsächlich ist es möglich, das erfindungsgemäße Reagens mit jeglichem Analyseverfahren zu verwenden. So ist es möglich dieselbe in jedem Laboratorium ohne die Notwendigkeit zu verwenden, spezielle Apparate bereitzustellen, sondern erlaubt es sogar, die bereits verfügbaren zu verwenden.
- Das durch den Anmelder vorgeschlagene Verfahren, welches insbesondere das erfindungsgemäße Reagens, aber nicht ausschließlich, verwendet, stellt, und das kann nicht als Begrenzung angesehen werden, die Verwendung zweier getrennter Reagenzien A und B bereit, worin A das Chromogen und B eine geeignete gepufferte Lösung darstellt.
- Die zwei Reagenzien werden in geeigneten Verhältnissen gemischt, um ein einziges Reagens als das wirksame Reagens herzustellen.
- In jedem Fall können die zwei Reagenzien auch in zwei aufeinanderfolgenden Schritten verwendet werden.
- Es ist deshalb ein besonderer Gegenstand der Erfindung, ein Reagens zur Bestimmung von freien Radikalen zu verwenden, welches ein aus der folgenden Formei (I) ausgewähltes Chromogen umfaßt
- worin:
- R1 = C&sub2;H&sub5;-, CH&sub3;-, H-, X-
- R2 = C&sub2;H&sub5;-, CH&sub3;-, H-, X-
- R3 = C&sub2;H&sub5;-, CH&sub3;-, H-, X-
- R4 = C&sub2;H&sub5;-, CH&sub3;-, H-, X-
- worin X- aus Halogeniden ausgewählt wird,
- wobei das Chromogen in Wasser oder anderem geeigneten Lösungsmittel und einem Puffer mit einem pH-Wert zwischen 3 und 6,9 gelöst wird.
- Vorzugsweise wird das Chromogen und der Puffer in einem Verhältnis zwischen 1:20 und 1:300 gemischt, wobei dieses Verhältnis für unterschiedliche Lösungsverhältnisse des Chromogens und des Puffers variabel ist.
- Gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung des Reagens umfaßt das Chromogen 4-Amino-paraphenylen-N,Ndiethylamin oder seine Salze.
- In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung des Reagens kann das Chromogen 4-Amino-paraphenylen-N,N-diethylaminsulfat (C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;N&sub2;H&sub2;SO&sub4;) oder seine Salze umfassen.
- Ebenso kann in einer dritten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das Chromogen 4-Diamin-paraphenylen-N,N-diethylenanilinoxalat (C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;N&sub2;C&sub2;H&sub2;O&sub4;) oder seine Salze umfassen.
- Weiterhin kann bei der erfindungsgemäßen Verwendung des Reagens das Chromogen 4-Amino-paraphenylen-N,N-dimethylamin oder seine Salze umfassen.
- Weiterhin kann gemäß der Erfindung das Chromogen 4-Amino-paraphenylen-N,Ndimethylaminsulfat oder seine Salze umfassen.
- Ferner kann gemäß der Erfindung das Chromogen 4-Diamin-paraphenylen-N,Ndimethylaminoxalat oder seine Salze umfassen.
- Bevorzugt wird der Puffer gemäß der Erfindung einen pH-Wert zwischen 4 und 5 aufweisen.
- Nun werden einige Herstellungsbeispiele der zwei Reagenzien, die das erfindungsgemäße Reagens ergeben, im folgenden angegeben.
- Es muß weiterhin betont werden, wie einige gegebene Verhältnisse zwischen Chromogen und Puffer in Abhängigkeit der Löslichkeit desselben Chromogens und Puffers modifiziert werden können. REAGENS A - Chromogen Beispiel A Beispiel B Beispiel C
- Acetatpuffer zwischen pH 3 und pH 6,9
- Natriumhydroxid von 0,01 N und 1 N
- Phosphatpuffer zwischen pH 3 und pH 6,9
- Pipespuffer zwischen pH 3 und pH 6,9
- Epespuffer zwischen pH 3 und pH 6,9
- Im folgenden wird zur Veranschaulichung ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Reagens beschrieben.
- Das Reagens A und das Reagens B werden in einem Verhältnis zwischen 1:300 und 1:100 gemischt, vorzugsweise 1:200. Für das Chromogen gemäß Beispiel B wird das bevorzugte Verhältnis 1:40 sein.
- 1 ml wirksames Reagens (A+B) wird mit 5 ml biologischer Probe (Blut, Serum, Plasma, Liquor etc.) gemischt.
- Die Lösung wird in dem Thermostat bei 37ºC eine Stunde lang belassen.
- Das Ablesen wird zwischen 480 und 570 nm durchgeführt. Der Test wird parallel unter Verwendung einer Probe durchgeführt, welche eine bekannte Konzentration aufweist und wobei die klassische Formel angewendet wird:
- C Probe = (A Probe / A Standard) · C Standard
- Die Reaktionstemperatur ist gleich 37ºC.
- 1 ml wirksames Reagens wird mit 20 ml Probe gemischt.
- Das Ablesen erfolgt nach 30". Die Ausgangsabsorption wird erfaßt zwischen 480 und 570 nm.
- Eine Inkubation für 5' bei 37ºC wird durchgeführt.
- Dann wird die Absorption nochmals abgelesen.
- Die Berechnung wird nach folgender Formel durchgeführt:
- C Probe = (End-A - Anfangs-A) Probe/(End-A - Anfangs-A) Standard · C Standard
- Die Reaktionstemperatur beträgt 37ºC (35ºC - 30ºC - 20ºC) (die Analysetemperatur ist tatsächlich kein grundlegender Parameter).
- Die Ablesung wird zwischen 480 und 570 nm durchgeführt.
- Das Puffervolumen beträgt 0,1 ml, das Serumvolumen beträgt 10 ml, und das Chromogenvolumen beträgt 10 ml.
- Nun bleibt die Reaktionsgeschwindigkeit für viele Minuten konstant, was eine Bestimmung der Kinetik der ROMs erlaubt.
- Indem man die Variation der D.O/Minute einer Probe mit einer bekannten Konzentration hervorruft, wird die Konzentration der ROMs in der Probe wie folgt bestimmt:
- Konz.(Probe): D.O/Minute Probe · Konz. Standard
- D.O/Minute Standard
Claims (18)
1. Verwendung eines Reagens, das ein Chromogen, ausgewählt aus der folgenden
Formel (I), umfaßt
worin:
R1 = C&sub2;H&sub5;-, CH&sub3;-, H-, X-
R2 = C&sub2;H&sub5;-, CH&sub3;-, H-, X-
R3 = C&sub2;H&sub5;-, CH&sub3;-, H-, X-
R4 = C&sub2;H&sub5;-, CH&sub3;-, H-, X-
worin X- aus Halogeniden ausgewählt wird,
wobei das Chromogen in Wasser oder anderem geeigneten Lösungsmittel und
einem Puffer mit einem pH-Wert zwischen 3 und 6,9 gelöst wird, zur Bestimmung
freier Radikale.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Chromogen
und der Puffer mit einem Volumenverhältnis zwischen 1:20 und 1:300 gemischt
werden.
3. Verwendung eines Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß das Chromogen 4-Amino-paraphenylen-N,N-diethylamin (C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;N&sub2;) oder
seine Salze umfaßt.
4. Verwendung eines Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß das Chromogen 4-Amino-paraphenylen-N,N-diethylaminsulfat
(C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;N&sub2;H&sub2;SO&sub4;) oder seine Salze umfaßt.
5. Verwendung eines Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß das Chromogen 4-Diamin-paraphenylen-N,N-diethylenanilinoxalat
(C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;N&sub2;C&sub2;H&sub2;O&sub4;) oder seine Salze umfaßt.
6. Verwendung eines Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß das Chromogen 4-Amino-paraphenylen-N,N-dimethylamin oder seine Salze
umfaßt.
7. Verwendung eines Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß das Chromogen 4-Amino-paraphenylen-N,N-dimethylaminsulfat oder seine
Salze umfaßt.
8. Verwendung eines Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß das Chromogen 4-Diamin-paraphenylen-N,N-dimethylaminoxalat oder seine
Salze umfaßt.
9. Verwendung eines Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche 10 bis
17, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer einen pH-Wert zwischen 4 und 5
hat.
10. Verfahren zur Bestimmung freier Radikale, dadurch gekennzeichnet, daß es die
Verwendung eines Reagens, umfassend ein aus der folgenden Formel (I)
ausgewähltes Chromogen, zur Verfügung stellt
worin:
R1 = C&sub2;H&sub5;-, CH&sub3;-, H-, X-
R2 = C&sub2;H&sub5;-, CH&sub3;-, H-, X-
R3 = C&sub2;H&sub5;-, CH&sub3;-, H-, X-
R4 = C&sub2;H&sub5;-, CH&sub3;-, H-, X-
worin X- aus Halogeniden ausgewählt wird,
wobei das Chromogen in Wasser oder anderem geeigneten Lösungsmittel und
einem Puffer mit einem pH-Wert zwischen 3 und 6,9 gelöst wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Chromogen und
der Puffer mit einem Volumenverhältnis zwischen 1:20 und 1:300 gemischt
werden.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das
Chromogen 4-Amino-paraphenylen-N,N-diethylamin (C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;N&sub2;) oder seine Salze
umfaßt.
13. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das
Chromogen 4-Amino-paraphenylen-N,N-diethylaminsulfat (C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;N&sub2;H&sub2;SO&sub4;) oder
seine Salze umfaßt.
14. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das
Chromogen 4-Diamin-paraphenylen-N,N-diethylenanilinoxalat (C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;N&sub2;C&sub2;H&sub2;O&sub4;)
oder seine Salze umfaßt.
15. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das
Chromogen 4-Amino-paraphenylen-N,N-dimethylamin oder seine Salze umfaßt.
16. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das
Chromogen 4-Amino-paraphenylen-N,N-dimethylaminsulfat oder seine Salze
umfaßt.
17. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das
Chromogen 4-Diamin-paraphenylen-N,N-dimethylaminoxalat oder seine Salze
umfaßt.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 10 bis 17, dadurch
gekennzeichnet, daß der Puffer einen pH-Wert zwischen 4 und 5 hat.
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