ITRM940598A1 - "reattivo per la determinazione di radicali liberi" - Google Patents

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Description

DESCRIZIONE
a corredo di una domanda di breveto per invenzione industriale avente per titolo:
"Reativo per la determinazione di radicali liberi"
La presente invenzione riguarda un reativo per la determinazione di radicali liberi.
Più in particolare, l'invenzione concerne un reattivo del tipo detto che consente di effettuare la determinazione dei radicali liberi in ogni tipo di analizzatore di chimica clinica, e quindi consente di effettuare tale determinazione in ogni laboratorio, potendosi utilizzare la strumentazione normalmente in dotazione.
Come è ben noto agli esperti nel ramo, con il termine radicale libero si intende in letteratura qualunque specie chimica capace di esistenza indipendente che contiene uno o più elettroni spaiati nell'orbitale (atomico e/o molecolare) più esterno.
Tra i vari radicali liberi esistenti quella che si riferisce all'ossigeno ha assunto negli ultimi anni, in medicina, sempre maggiore interesse per il ruolo che essi possono svolgere nel determinare il danno tessutale per diverse condizioni morbose.
Nella letteratura anglosassone i radicali liberi sono denominati ROMs (metaboliti reativi dell'ossigeno), simbolizzazione che verrà utilizzata anche nella prosecuzione della presente descrizione, e sono modo in laboratori di analisi per quelle determinazioni di routine giornaliera.
Alla luce di quanto sopra appare di notevole importanza la possibilità di poter disporre di un reattivo come quello proposto secondo la presente invenzione che consente di poter utilizzare un metodo semplice e rapido per la determinazione dei radicali liberi e dei loro derivati al fine di permettere anche il monitoraggio di terapie antiossidanti e antinfiammatorie con analisi eseguibili nei normali laboratori.
La Richiedente ha determinato sperimentalmente che la N,N-dietil parafenilendiammina già nota per la determinazione del cloro attivo nelle acque, se utilizzata in appropriata soluzione tampone ed in particolari condizioni di concentrazioni e di pH, dando luogo ad una reazione croniogena, è in grado di evidenziare con formazione di colore non solo il cloro, ma anche di tutti i prodotti aventi la caratteristica dell'elettrone spaiato nell'orbitale esterno quali il superossido anione, l'acqua ossigenata, i radicali perossidici organici, i radicali alcoolossilici, i radicali idrossilici, gli acidi ipoalosi e tutte le loro ammine.
Risultati analoghi sono stati ottenuti con prodotti della stessa categoria e che sono inclusi nella formula generale descritta e rivendicata.
Dalle sperimentazioni effettuate, si è visto quindi che il reattivo secondo l'invenzione permette di determinare quantitativamente i ROMs presenti in un campione.
il colore che si sviluppa ha uno spettro di assorbimento a due picchi, uno a 510 nm e uno a 550 nm, come si può desumere dal grafico 1 allegato.
La sua intensità di colore è direttamente proporzionale alla concentrazione dei radicali liberi presenti nel campione e segue perfettamente la legge di Lambert e Beer, come appare anche evidente dai grafico 2, sia che si esegua la lettura a 510 nm che a 550 nm.
Nel caso in cui il campione da esaminare sia costituito da un campione biologico (sangue, plasma, siero, liquor, etc.), la determinazione dei ROMs con il metodo che impiega il reattivo secondo l'invenzione può essere effettuata sia con lettura a termine dello sviluppo del colore (End Point) che con lettura di un predeterminato intervallo di tempo (Fixed Time), e cinetica continua.
Questo è un aspetto che differenzia notevolmente il reattivo secondo la presente invenzione rispetto a tutti i sistemi attualmente noti e che lo rende particolarmente vantaggioso.
Infatti, il poter usare il reattivo secondo l'invenzione con qualsiasi tipo di metodologia di analisi ne permette l'adozione in qualsiasi laboratorio senza la necessità di doversi strutturare con apparecchiature speciali, ma anzi consentendo l'utilizzazione di quelle già disponibili.
La metodologia messa a punto dalia Richiedente e che utilizza il reattivo secondo l'invenzione prevede, particolarmente, ma non unicamente, e pertanto tale indicazione non può essere considerata come una limitazione, l'utilizzazione di due reagenti separati A e B, dove A rappresenta il cromogeno e B una soluzione opportunamente tamponata.
I due reagenti vengono miscelati nelle opportune proporzioni in modo da formare un unico reagente quale reattivo di lavoro.
Ad ogni modo i due reagenti possono essere utilizzati anche in due fasi successive.
Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione un reattivo per la determinazione dei radicali liberi comprendente un cromogeno, scelto dalla seguente formula (I)
detto cromogeno essendo sciolto opportunamente in acqua o altro solvente idoneo,
e un tampone con pH compreso tra 3 e 6,9.
Preferibilmente, detti cromogeno e tampone sono mischiati in proporzione compresa tra 1:20 e 1:300, questo rapporto potendo essere variato per diversi gradi di soluzione del cromogeno e del tampone.
In una prima forma di realizzazione preferita del reattivo secondo l'invenzione, detto croniogeno comprende 4-amino-N,N-dietilamina 10 16 2 o suoi sali.
In una seconda forma di realizzazione preferita dèi reattivo secondo l'invenzione, detto croniogeno può comprendere 4-amino-N.Ndietilamina solfato o suoi sali.
Ancora secondo l'invenzione, in una terza forma di realizzazione preferita, detto croniogeno può comprendere 4-diamino-Ν,Ν-dieti /anilina ossalato 0 suoi sali.
Inoltre, nei reattivo secondo l'invenzione il croniogeno può comprendere 4-amino-N,N-dimeti lamina o suoi sali.
Sempre secondo l'invenzione, detto croniogeno può comprendere 4-amino-N, N dimetilamina solfato o suoi sali.
Ulteriormente, secondo l'invenzione, detto croniogeno può comprendere 4-diamino-N,N-dimetilanilina ossalato o suoi sali.
Di preferenza detto tampone avrà, secondo l'invenzione, un pH compreso tra 4 e 5.
Vengono ora fomiti alcuni esempi di preparazione per i due reagenti che vengono a costituire il reattiivo secondo l'invenzione.
Detti esempi non devono in alcun modo essere intesi come limitativi dell'ambito di protezione dell'invenzione, in quanto sono solo esemplificativi di alcune possibili soluzioni.
Si deve inoltre sottolineare come i rapporti indicati tra cromogeno e tampone possono cambiare in funzione del grado di soluzione del cromogeno e del tampone stessi.
Tampone pipes da pH 3 a pH 6,9
Esempio 5 (Utilizzabile con i cromogeni secondo gli esempi A e B)
Tampone epes da pH 3 a pH 6,9
Verrà ora descritto nel seguito, a titolo illustrativo, ma non limitativo un metodo per la preparazione del reattivo secondo l'invenzione.
Preparazione del Reattivo di lavoro.
Si miscelano il Reattivo A con il Reattivo B in rapporto compreso tra 1:300 e 1:100, preferìbilmente 1:200. Nei caso dei cromogeno di cui all'esempio B il rapporto preferito sarà 1:40.
Metodo d'impiego con reazione a termine.
Vengono miscelati mi 1 di Reattivo di lavoro (A+B) con 5 mi di Campione biologico (sangue, siero, plasma, liquor, ect.).
il tutto viene lasciato in termostato a 37 °C per 1 ora.
La lettura è effettuata da 480 a 570 nm. La prova si effettua utilizzando in parallelo un campione a titolo noto e applicando la classica formula:
C campione= (A campione / A standard) x C standard
Metodo di impiego con reazione Fixed Time.
La temperatura di reazione è pari a 37 °C.
Si miscela 1 mi di reattivo di lavoro con 20 mi di campione. La lettura avviene dopo 30". L'assorbanza iniziale è compresa tra 480 a 570 nm.
Si procede ad incubazione a 37 °C per 5'.
Si procede quindi ad ulteriore lettura dell'assorbanza.
Il calcolo è effettuato con la formula:
C campione = [ (A finale - A iniziale) campione / (A finale - A iniziale) standard ] x C std.
Metodo di impiego con cinetica continua
La temperatura di reazione è di 37°C (35°C - 30<°>C - 20°C) (in effetti la temperatura di analisi non è un parametro fondamentale).
La lettura viene effettuata tra 480 e 570 nm.
Il volume del tampone è di 1,0 mi, il volume del siero è di 10 μΙ, e il volume del croniogeno è di 10 μl.
A questo punto la velocità di reazione rimane costante per diversi minuti, consentendo la determinazione cinetica dei ROMs.
Causando la variazione di D. O/minuto di un campione a titolo noto, si determina come segue la concentrazione dei ROMs nel campione:
Con (campione): Δ D. O/minuto campione x Conc Standard
Δ D. O/minuto standard
La presente invenzione è stata descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, ma è da intendersi che variazioni e/o modifiche potranno essere apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione, come definito dalle.rivendicazioni allegate.
caratterizzati dall'avere un numero dispari di elettroni nell'orbita più esterna dell'ossigeno, il che li rende chimicamente reattivi nei confronti di un gran numero di molecole biologiche.
i principali ROMs noti in letteratura sono: il superossido anione O2*; l'acqua ossigenata H2O2; il radicale perossilico organico R-O2*; radicale alcoolossilico R-O*; il radicale idrossilico OH*; gli acidi ipoalosi OHX, in cui X può essere l'alogeno e tutte le loro ammine.
In studi recenti, si sono individuate numerose condizioni cliniche in cui è stato invocato e riconosciuto un ruolo dei ROMs. In particolare, si possono citare le malattie infiammatorie e postischemiche del tubo digerente, i danni del Sistema Nervoso Centrale a seguito di incidenti vascolari o traumatici, l'aterosclerosi e le sue complicazioni cardiache, alcuni tipi di danno renale, l'artrite reumatoide ed i danni da alcool in alcuni distretti dell'organismo.
Tuttavia, sino ad oggi si sono avute notevoli difficoltà nella individuazione e nella quantizzazione dei radicali liberi nei campioni biologici, per cui il loro ruolo patogenetico in queste malattie è stato largamente dedotto dall'effetto di sostanze antiossidanti, le quali, naturalmente, potrebbero avere efFetti antinfiammatori aspecifici.
Principalmente, anche se non esclusivamente, sino ad oggi le metodologie maggiormente impiegate per la determinazione dei radicali liberi sono state quella nota nella tecnica come ESR (electron spin resonance), tecnica sofisticata utilizzata solo nei laboratori di ricerca perché molto costosa, o quelle basate sull'impiego di una strumentazione di tipo sofisticato, per cui non proponibile in alcun

Claims (10)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Reattivo per la determinazione dei radicali liberi caratterizzato dal fatto di comprendere un croniogeno, scelto dalla seguente formula (I) detto croniogeno essendo sciolto opportunamente in acqua o altro sovente idoneo, e un tampone con pH compreso tra 3 e 6,9.
  2. 2. Reattivo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che detti croniogeno e tampone sono mischiati in proporzione compresa tra 1 :20 e 1 :300.
  3. 3. Reattivo secondo ia rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che detto croniogeno comprende 4-amino-N,N-dietilamina
  4. 4. Reattivo secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che detto croniogeno comprende 4-amino-N,Ndietilamina solfato
  5. 5. Reattivo secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che detto cromogeno comprende 4-diamino-N,N-dietilanilina ossalato
  6. 6. Reattivo secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che detto cromogeno comprende 4-amino-N,N-dimetilamina 0 suoi sali.
  7. 7. Reattivo secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che detto cromogeno comprende 4-amino-N,Ndimetilamina solfato 0 suoi sali.
  8. 8. Reattivo secondo la rivendicazione 1 0 2, caratterizzato dal fatto che detto cromogeno comprende 4-diamino-N,N-dimetilaniIina ossalato o suoi sali.
  9. 9. Reattivo secondo una delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto tampone ha un pH compreso tra 4 e 5
  10. 10. Reattivo per la determinazione dei radicali liberi secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, sostanzialmente come illustrato e descritto.
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