CH619731A5 - Process for combatting the autooxidation of substances capable of being degraded by an oxidation involving superoxide ions - Google Patents

Description

La présente invention a pour objet un procédé pour lutter contre l'auto-oxydation des substances susceptibles de se dégrader par une oxydation mettant en jeu des ions superoxydes, caractérisé en ce qu'on associe auxdites substances au moins une enzyme superoxyde dismutase.

Ce procédé s'applique notamment à la protection contre l'auto-oxydation des lipides et des composés utilisés comme anti-oxydants dans l'industrie alimentaire.

On a déjà décrit des superoxyde dismutases, extraites d'éry-throcyte de bœuf (Markovitz, J. Biol. Chem. 234, p. 40,1959) et d'Escherichia coli (Keele et Fridovich, J. Biol. Chem. 245, p. 6176,1970).

Les superoxyde dismutases sont des enzymes capables d'induire la dismutation des ions superoxydes, suivant la réaction:

202- + 2H+^H202 + O2

Elles contribuent donc à réaliser un système d'autoprotection pour les articles ou organismes dans lesquels elles se trouvent, car les ions O2- qui sont produits au cours des réactions d'oxydation sous l'effet d'oxygène moléculaire sont très actifs et attaquent entre autres les protéines, par oxydation du tryp-tophane entre autres acides aminés, et les acides nucléiques.

On a maintenant trouvé que les enzymes superoxyde dismutases de toutes origines agissent remarquablement comme inhibiteurs d'oxydation des substances oxydables, en particulier comme inhibiteurs de l'oxydation des aliments lipidiques, protéiques ou lipoprotéiques, ainsi que d'autres substances et milieux oxydables.

Au sens de la présente invention, on entend par «substance oxydable» toute substance susceptible de se dégrader par une oxydation mettant en jeu l'intervention d'ions superoxydes.

Les superoxydes dismutases qui se sont révélées efficaces sont par exemple préparées à partir de souches bactériennes marines, telles que par exemple des souches de Photobacterium phosphoreum, de Photobacterium leiognathi ou de Photobacterium sepia entre autres; mais ce sont également toutes autres superoxyde dismutases, telles que, à titre d'exemples non limitatifs, celles extraites d'Escherichia coli, de champignons tels que Pleurotus olearius ou celles extraites du sang, notamment les érithrocupréines. Parmi ces diverses souches, on peut citer les souches de Photobacterium phosphoreum no ATCC 11 040, de Photobactérium leiognathi no ATCC 25 521, de Photobacterium sepia no ATCC 15 709, d'Escherichia coli no ATCC 15 224 et de Pleurotus olearius Gillet (Laboratoire de Cryptogamie de Paris).

Tous ces micro-organismes sont connus. En particulier, Photobacterium leiognathi a été décrit par Boisvert, Châtelain et Bassot (Annales de l'Institut Pasteur (1967), 112, p. 520-524). Photobacterium sepia a été décrit par Nicholas et Me El-roy dans J. Gen. Microbiology (1964), 35, p. 401-410.

On a pu déterminer l'effet anti-oxydant remarquable procuré par ces superoxydes dismutases sur des champignons, sur des pommes et sur des pommes de terre, entre autres aliments. Ces essais sont rapportés dans certains des exemples que l'on trouvera plus loin.

Toutefois, on ne peut à l'heure actuelle mettre au point des techniques d'appréciation de qualité des aliments qui soient polyvalentes et vraiment objectives; aussi a-t-on choisi de faire porter des essais également sur des modèles particuliers, qui ont pour avantage de constituer des modèles types d'un grand nombre d'aliments et de compositions alimentaires et de pouvoir être analysés objectivement quant à leur intégrité. C'est ainsi que, à titre de modèle d'inhibition de l'auto-oxydation des lipo-protéines, on a testé l'activité d'inhibiteur d'auto-oxydation procurée selon l'invention par les superoxyde dismutases sur du lysine ARN-t ligase de levure, modèle représentant toutes les classes de lipo-protéines. De même, à titre de modèle des nucléo-protéines dans leur généralité, on a utilisé le bactériophage R 17, qui est une ribonucléprotéine. Par ailleurs, on a testé l'auto-oxydation de l'enzyme ribonu-cléase pancréatique, en tant que modèle d'aliments strictement protéiques en caractère.

D'autre part, on a également établi selon l'invention l'efficacité des superoxyde dismutases pour la protection contre l'oxydation des bactéries exposées à des radiations ultra-violettes ainsi que pour la protection d'un milieu dit «milieu de Jef-fries», contenant du tétrathionate de sodium et actif pour l'enrichissement des Salmonella.

Comme on l'a précisé plus haut, l'enzyme superoxyde dismutase utilisée selon l'invention peut être extraite de toute source appropriée, telle que: érithrocupréine, Escherichia coli, champignons tels que Pleurotus olearius, souches bactériennes marines telles que Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi et Photobacterium sepia et autres. Quelle que soit la source de l'enzyme, l'appréciation de l'efficacité de cette dernière dans l'application considérée est la même, puisqu'elle est mesurée en termes absolus: on mesure en effet l'activité de l'enzyme par l'inhibition de la réaction de chimio-luminescence du luminol, réaction produite par le système enzymatique hypoxanthine/xanthine oxydase/oxy-

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gène; pour réaliser cette réaction, on a chaque fois effectué une injection de 1 ml d'hypoxanthine 0,33xlCHM dans un mélange de 0,3 ml de luminol 10~3M, 0,3 ml de tampon gly-cine-NaOH 1 M de pH 9, 0,3 ml d'EDTA 10'3M, 1,8 ml d'eau et 0,005 ml une solution de xanthine oxydase à 1 mg/ml. Le dispositif expérimental utilisé pour la mesure des intensités lumineuses 1) et 2) après inhibition au moyen de superoxyde dismutase comprenait une cuve argentée destinée à recevoir le mélange à tester et placée devant un photomultiplicateur. On a initié la réaction en injectant le substrat dans la cuve et il se produisait alors-une émission d'un flux de photons qui a donné naissance, sous l'action du photomultiplicateur, à un courant dont on a mesuré, à l'aide d'un picoampèremétre, et enregistré l'intensité. Si l'on introduisait dans le mélange réactionnel une quantité appropriée de la superoxyde dismutase à évaluer, avant l'initiation de la réaction, on réalisait une inhibition de cette émission de lumière. L'unité d'activité choisie correspond arbitraitement à la quantité d'enzyme provoquant une réduction de 50% de l'intensité lumineuse maximale en l'absence d'inhibition enzymatique. Cette unité est donc indépendante de la source d'enzyme et de l'enzyme superoxyde dismutase utilisées.

Dans certains cas, il peut être avantageux, pour apprécier sur une période raisonnable de temps l'efficacité des superoxydes dismutases dans l'application considérée, d'activer l'oxydation des matières. Pour ce faire, on opère en pratique soit à l'aide de flavines réduites par irradiation à 365 mu, soit au moyen d'un système enzymatique, par exemple le système xanthine oxydase/hypoxanthine/oxygène.

Lorsque l'on accélère l'oxydation par les flavines réduites, on irradie une solution de flavine monocucléotide (FMN) 10_4M, d'EDTA 10_3M et de tampon phosphate 10_2M pH 7,0 dans une cuve en quartz placée dans un spectrofluorimétre Zeiss équipé d'un filtre M 365; on suit la photoréduction, qui se produit rapidement, en suivant la diminution de l'intensité de fluorescence émise à 530 m|X.

En fin de réduction, on reprend les solutions pour les agiter vigoureusement en présence d'air, obtenant ainsi leur réoxydation complète, ce qui produit des ions superoxyde 02-r. Il est à noter que ce cycle de réduction-réoxydation des flavines peut être répété plusieurs fois, sans que la structure du flavine mononucléotide soit altérée. En variante, on peut procéder aux irradiations à 365 m(x, à l'aide d'une lampe B 100 A fournie par Ultraviolet Products Inc., sur des solutions telles que décrites ci-dessus agitées en continu.

Lorsque l'on désire accélérer l'oxydation par le système enzymatique hypoxanthine/xanthine oxydase/oxygéne, il est avantageux d'utiliser une solution contenant 0,3 ml d'hypoxanthine 10~3M, 0,3 ml de tampon phosphate 1 M pH 7,8, 0,3 ml d'EDTA 10~3M, 2,1 ml d'eau et 0,05 ml d'une solution de xanthine oxydase à 1 mg/ml.

Un procédé pour la production de superoxyde dismutase par extraction à partir de souches bactériennes marines consiste à disperser dans l'eau et à maintenir à environ 4°C une culture bactérienne marine, à ajuster ensuite le pH du milieu 6,5-8, et de préférence à 7 environ, à porter le mélange à 50-60 °C pendant quelques minutes, à le refroidir à environ 4°C et, à cette température, à centrifuger, à effectuer sur la fraction surnageante une première précipitation fractionnée au moyen de sels neutres, à centrifuger à nouveau et à effectuer sur la fraction surnageante une seconde précipitation fractionnée aux sels neutres et à centrifuger.

En variante, on peut compléter le procédé par une étape de purification, consistant avantageusement en une dissolution dans du tampon phosphate pH 7,8 du précipité recueilli dans la dernière centrifugation et en une dialyse de la solution ainsi obtenue, contre le même tampon phosphate pH 7,8.

Selon une autre variante de ce procédé, on purifie l'enzyme extraite de la culture bactérienne marine, après reprise du produit de la dernière centrifugation avec du tampon phosphate pH 7,8, et dialyse contre ce même tampon, par une Chromatographie qui est de préférence une Chromatographie sur colonne et en particulier une Chromatographie sur trois colonnes successives qui sont respectivement: une première colonne de gel de Sephadex G 200, une colonne de diéthyl-aminoéthyl Sephadex (DEAE-Sephadex A-50) et une seconde colonne de gel de Sephadex G 200.

La culture bactérienne servant de source d'enzyme dans le procédé selon l'invention est, par exemple, une culture de souches de Photobacterium phosphoreum, de Photobacterium leiognathi, ou de Photobacterium sepia. Pour ajuster à 6,5-8 le pH de la dispersion des bactéries dans l'eau, ce qui constitue la première étape dudit procédé, on utilise par exemple de l'ammoniaque 2N et on ajoute ensuite du chlorure de potassium, de préférence du KCl 3M.

On porte ensuite le mélange ainsi constitué à une température de 50 à 60°C, pendant quelques minutes seulement et de préférence pendant 3 à 4 minutes. On refroidit alors le mélange à 4°C environ, température à laquelle on effectue toutes les étapes suivantes du procédé selon l'invention.

Chacune des précipitations fractionnées constituant des étapes de ce procédé est réalisée, comme indiqué plus haut, au moyen de sels neutres en solution aqueuse, et de pféférence au moyen de sulfate d'ammonium (NH4)2S04.

Dans un mode de mise en œuvre avantageux, on réalise la première précipitation fractionnée au moyen de sulfate d'ammonium (NH4)2S04 ajouté en une quantité telle que le mélange ou extrait enzymatique traité soit ainsi amené à une concentration finale de 30 à 35% environ de la saturation à 4° C. Il faut toutefois noter que l'on peut remplacer pour tout ou partie le sulfate d'ammonium par un ou plusieurs autres sels appropriés et la quantité totale desdits sels et alors une quantité équivalente et appropriée pour qu'elle amène le mélange à une concentration finale d'environ 30 à 35 % de la saturation à 40 C.

En variante, on peut utiliser un système d'ultrafiltration, tel que par exemple un système mettant en œuvre un dispositif poreux tel que des tubes poreux, et en particulier un système utilisant un premier tube poreux retenant, en les concentrant, les molécules ayant un poids moléculaire supérieur à 40 000, et un second tube poreux laissant passer les molécules d'enzyme désirées mais retenant les bactéries restantes, procurant ainsi un extrait enzymatique stérile.

De même, on réalise avantageusement la seconde précipitation fractionnée au moyen de sulfate d'ammonium (NH4)2S04 ajouté en une quantité telle que le mélange ou extrait enzymatique traité soit ainsi amené à une concentration finale de 70 à 75% environ de la saturation à 4°C.

Les superoxydes dismutases obtenus à partir de différentes souches bactériennes marines sont toutes des superoxydes dismutases comprenant du fer non hématinique, alors que les enzymes présentant une activité de superoxyde dismutase qui ont été décrites précédemment et qui sont l'érithrocupréine et l'enzyme extraite d'Escherichia coli comportent des cations divalents qui sont respectivement le cuivre et le zinc pour la première, et le manganèse pour la seconde.

La recherche de la présence d'un métal dans les superoxydes dismutases considérées peut être réalisée par une analyse au spectrographe d'absorption atomique.

On peut également effectuer un test colorimétrique qui,

dans le cas présent, consiste à colorer un gel de migration électrophorétique d'une préparation de l'enzyme au moyen d'un colorant spécifique du fer ferreux FeFe2+, la bathophé-nanthroline, éventuellement en présence d'un réducteur tel que l'hydrazine. Pour ce test, on coupe le gel en deux dans le

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sens de la longueur et on place une des deux parties dans du bleu de coomassie, et l'autre partie dans de la bathophénan-throline. Le test est positif si l'on obtient un anneau rose dans le dernier cas, au niveau de la bande protéique. Or, comme il est connu, une telle apparition d'un anneau rosé peut être considérée comme l'indication de la présence de fer ferreux, ici dans la protéine superoxyde dismutase.

On peut aussi utiliser du fer radioactif pour marquer la protéine et en déterminer la stoechiométrie en ce qui concerne le cation métallique divalent présent.

Une superoxyde dismutase extraite de cultures bactériennes marines comprend donc du fer non hématinique, elle a un poids moléculaire de 40 000±2500 environ et un pHi ou point isoélectrique de 4 à 7 environ et présente un maximum d'activité enzymatique pour un pH de 8,5 à 10 environ, avec un optimum à pH 9,5 environ.

On peut maintenir l'enzyme active sur une longue période de temps en la conservant dans une solution à 70-80% de sulfate neutre d'ammonium (NH<t)2S04 à 4°C.

Pour mesurer l'activité des superoxydes dismutases, on peut évaluer l'inhibition par ces dernières de la réaction de chimio-luminescence provoquée par le système enzymatique oxygène-hypoxanthine-xanthine-oxydase-luminol, ainsi qu'on le montrera plus loin. Ce système enzymatique réagissant provoque la libération d'ions Oz-r qui sont aptes à donner une réaction de chimioluminescence avec le luminol. L'addition de superoxyde dismutase à ce système divertit en effet des ions O2- et provoque ainsi une diminution de l'intensité de la lumière émise dans cette réaction.

Les superoxyde dismutases catalysent en effet la réaction

2O2- + 2H+-*H202 + O2

Si l'on utilise alors comme substrats dans cette réaction les ions superoxyde produits par la réaction enzymatique mettant en jeu xanthine-oxydase et xanthine ou hypoxanthine, les ions superoxyde ainsi produits sont très instables et émettent spontanément de la lumière. Cette dernière est cependant trop faible et les mesures ne pourraient avoir une reproductibilité suffisante.

C'est pourquoi on complète en pratique le dispositif analytique en utilisant, pour mettre en évidence la quantité d'ions superoxyde formée, une substance chimioluminescente, le luminol ou 5-amino-2,3-dihydro-l,4-phtalazinedione.

Luminol +O2-I1V + produit d'oxydation

On a par ailleurs également mis au point des systèmes producteurs d'ions superoxyde, systèmes catalytiques susceptibles de promouvoir l'oxydation du luminol constitués d'ions Fe2+, Ni2+ ou Co2+ dans des solutions aqueuses d'oxygène moléculaire en présence de certains ligands.

La superoxyde dismutase introduite dans le système diminue la quantité d'ions Ol- et par conséquent la production de lumière.

On effectue le dosage comme suit:

On utilise le mélange réactionnel ci-après:

Luminol 10~3M 0,3 ml

Tampon phosphate 10T3M pH 7,8 0,3 ml

EDTA 10~3M 0,3 ml

Eau qsp 2 ml

+ 50 [il de xanthine oxydase (1,05 ml d'une solution à 1 mg/ml de xanthine-oxydase).

On place ce mélange dans une cuve argentée, devant un photomultiplicateur. On initie la réaction en injectant dans la cuve le substrat: 1 ml d'une solution contenant 0,3 pi mole d'hypoxanthine.

Il se produit alors une émission d'un flux de photons, qui donne naissance, sous l'action du photomultiplicateur, à un courant dont l'intensité est mesurée par un picoampèremètre et enregistrée. Si l'on introduit dans le mélange réactionnel 5 al de la superoxyde dismutase à évaluer, avant l'initiation de la réaction, on réalise une inhibition de cette émission de lumière.

On définit alors arbitrairement l'unité d'enzyme superoxyde dismutase comme étant la quantité de cette enzyme qui provoque ime inhibition de 50% de l'émission de lumière.

On notera cependant que l'on peut également évaluer l'activité des superoxydes dismutases en provoquant l'inhibition de la même réaction que celle mentionnée plus haut, directement en injectant 1 ml d'une solution d'ions 02-r, préparée par réduction électrochimique (J. M. Cord, I. Fridovitch, J. B. C. vol. 244, 25 (1969), pp. 6049-6055), dans 2 ml d'une solution contenant 0,5 [miole de luminol et 0,17 millimole de tampon phosphate pH 7,8.

En variante, on peut évaluer comme suit l'activité des superoxydes dismutases:

on introduit dans la cuve mentionnée plus haut 0,3 ml de tampon glycine-NaOH IM, pH 9, 0,3 ml d'EDTA 10~3M neutralisé, 1,1 ml de flavine-mononucléotide 10~5M et 0,3 ml de luminol (20 mg/70 ml). On injecte 1 ml de NaBKU 10~2M. Dans ces conditions on obtient un signal évalué à IO-7 à 10~8A pour une tension de 1500 V. On notera que la solution de Na BH4 doit être préparée extemporanément, tandis que le luminol doit être conservé à l'abri de la lumière à 0°C et doit être ajouté séparément au mélange réactionnel.

L'addition de superoxyde dismutase à ce système provoque une certaine inhibition du signal lumineux, cette dernière variant linéairement avec la quantité d'enzyme jusqu'au taux de 75%.

Selon une autre variante encore, on peut évaluer l'activité des superoxydes dismutases en utilisant un mélange réactionnel composé de 0,3 ml de tampon glycine-NaOH IM, pH 9, 0,3 ml d'EDTA 10_3M, 1,1 ml d'eau et 0,3 ml de luminol 10-4M. On ajoute à ce mélange 5 [il de xanthine-oxydase (1 mg/ ml) et une quantité aliquote de superoxyde dismutase. On injecte 1 ml d'hypoxanthine (0,3 ml d'hypoxanthine 10_3M, dilué au dernier moment avec de l'eau jusqu'à 10 ml). Il faut noter que le luminol, qui doit être conservé à l'abri de la lumière et à 0°C, est à ajouter séparément au mélange réactionnel.

Le signal obtenu pour le dosage du témoin (sans superoxyde dismutase) est d'environ 10_8A pour une tension de 1500 V et l'inhibition du signal lumineux est linéaire est proportionnelle à la quantité de superoxyde dismutase jusqu'à 50%.

Ayant admis que, dans des conditions appropriées, les ions métalliques Fe2+, Ni2+ et Co2+ peuvent donner naissance à des radicaux superoxyde, la titulaire s'est penchée sur le problème de l'oxydation des lipides, en particulier dans les aliments en contenant, et en a rapproché le mécanisme réactionnel de celui de la formation d'ions superoxyde par un système comprenant les ions métalliques susdits et un ligand approprié. On a alors pu constater que les antioxydants usuellement utilisés dans l'industrie alimentaire, tels que les interrupteurs de chaînes à radicaux libres du type pyrogallol, par exemple le propyl gallate, ou les inhibiteurs de production de radicaux libres, comme l'EDTA et l'acide ascorbique, peuvent effectivement favoriser contre toute attente certaines oxydations catalysées soit par voie enzymatique soit sous l'effet d'ions métalliques, au lieu d'agir comme antioxydants comme on s'y attendait.

C'est alors que l'on a établi que, dans des conditions de pH appropriées, les superoxyde dismutases selon la présente invention inhibent des systèmes oxydants tels que ceux constitués d'ions 02-r produits électrochimiquement, deFMNHb/

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Oz, ou d'ions Fe2+, Ni2+ ou Co2+ dans des solutions aqueuses d'oxygène moléculaire en présence de ligands appropriés. Ainsi, 7 unités de superoxyde dismutase extraite de Photobacterium leiognathi se sont révélées inhiber à 16,5% l'émission de lumière due à l'action du système Co2+/02/tétraglycine sur le luminol à pH 9,7 et à 40% environ celle due à l'action du système Ni2+/02/cyanure sur le luminol à pH 9.

On a pu montrer que les superoxyde dismutases protègent efficacement les lipides et les antioxydants et autres conservateurs usuellement utilisés dans l'industrie alimentaire, en inhibant très fortement les réactions liées à la production de l'ion superoxyde O2. En particulier, on a établi que l'auto-oxyda-tion de lipides insaturés provenant d'Anchoveta est très fortement inhibée par les superoxydes dismutases. En outre, d'autres essais ont montré que les superoxydes dismutases exercent une action protectrice contre l'auto-oxydation de certains antioxydants, en particulier d'anti-oxydants utilisés pour la conservation des aliments, tels que par exemple le pyrogallol ou l'acide ascorbique.

Le procédé selon l'invention fournit donc des compositions alimentaires, des compositions obtenues à partir de souches de bactéries ou de virus ou des milieux de culture, comportant, en association avec lesdits aliments, bactéries ou virus ou autres principes du milieu, une quantité efficace d'une enzyme superoxyde dismutase.

Il est clair que les quantités d'enzymes superoxydes dismutases à associer aux substances à protéger ne sont pas critiques et la détermination des quantités les plus appropriées pour chaque cas d'espèce est à la portée de l'homme de l'art. Des essais de routine permettent de déterminer l'efficacité de la protection conférée par l'enzyme et d'adapter ou de modifier éventuellement la quantité de cette dernière en conséquence, en se servant pour ce faire de tests d'activité semblables à ceux décrits ci-dessus.

A titre d'exemples, on peut toutefois préciser que des quantités d'enzyme superoxyde dismutase de 1 à 100 unités par millilitre ou par gramme sont particulièrement appropriées pour la protection des substances auto-oxydables telles qu'on les a définies plus haut.

Ainsi qu'on l'a montré précédemment, les superoxydes dismutases protègent efficacement les lipides et les anti-oxydants et autres conservateurs usuellement utilisés dans l'industrie alimentaire, en inhibant très fortement les réactions liées à la production de l'ion superoxyde O2-. En particulier, on a établi que l'auto-oxydation de lipides insaturés provenant des poissons est très fortement inhibée par les superoxydes dismutases. En outre, d'autres essais ont montré que les superoxydes dismutases exercent une action protectrice contre l'auto-oxydation de certains anti-oxydants, en particulier d'anti-oxydants utilisés pour la conservation des aliments, tels que par exemple le pyrogallol ou l'acide ascorbique.

L'invention est décrite plus en détail dans les exemples ci-après, qui ne la limitent aucunement.

Exemple 1

On a cultivé des bactéries de Photobacterium leiognathi de souche no ATCC 25 521 sur un milieu synthétique contenant, en grammes par litre:

NaCl

Na2HP04,12H2O KH2PO4 MgS04,7H2O (NH4)2HP04 Glucose Glycérol Trypticase Extrait de levure

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On a amené ce milieu au pH de 7,2 avec de la soude et on l'a stérilisé pendant 1 heure à 110°C.

On s'est servi d'une préculture de 1 litre, poussée pendant la nuit et répartie entre 4 Erlenmeyer contenant 250 ml de milieu chacun, pour ensemencer un fermenteur de 12 litres de milieu.

On a poursuivi la culture pendant 12 heures à 20°C avec forte aération et on a ainsi obtenu 100 g de bactéries, exprimés en poids de produit mouillé.

On a dispersé 135 g en poids mouillé de bactéries de Photobacterium leiognathi, provenant de plusieurs cultures, dans 650 ml d'eau et on a laissé reposer à 4°C pendant une nuit. On a ajouté de l'ammoniaque 2N, jusqu'à amener le pH du milieu à 7-8 et on a ensuite ajouté 18 ml de KCl 3M.

On a porté le mélange à 58°C et on l'a maintenu à cette température pendant 4 minutes, après quoi on l'a rafraîchi jusqu'à 4 et centrifugé pendant 10 minutes à la vitesse de 10 000 tours/minute. Toujours en opérant à 4°C, on a ajusté les surnageants à 35% de saturation avec du sulfate d'ammonium solide à pH 8; on a centrifugé et on a amené le surnageant à 75% de saturation en sulfate d'ammonium et on a laissé reposer pendant une nuit à 4°C. On a récolté par centrifugation la protéine précipitée et on l'a conservée dans une solution de sulfate d'ammonium à 75%.

L'activité d'une solution de 9 mg de protéine par millilitre (Biuret) était de 40 unités/mg, alors qu'elle était, à titre comparatif, de 0 unité/mg pour de la catalase en solution à 9 mg de protéine/ml.

Après une nouvelle précipitation fractionnée au moyen de sulfate d'ammonium avec un gradient de concentration de 35 à 75 % de la saturation, on a obtenu une superoxyde dismutase qui, en solution à 14,8 mg de protéine/ml (Biuret) présentait une activité de 134 unités/mg à 500 unités/mg.

On a dissous le précipité protéique dans du tampon phosphate pH 7,8 et on a dialysé pendant 48 heures à 4°C. On a conservé l'enzyme superoxyde dismutase à -20°C.

Pour déterminer l'activité de cette dernière, on a utilisé une cuve placée devant un photomultiplicateur et renfermant le mélange réactionnel ci-après:

40 Luminol

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10~3MpH 7,8 10-3M

(1 mg/ml)

0,3 ml 0,3 ml 0,3 ml 1,0 ml 0,050 ml

On a initié la réaction en injectant dans la cuve 1 ml d'hypoxanthine 3xl0~4M.

Un flux de photons était alors émis, qui a donné naissance, sous l'action du photomultiplicateur, à un courant dont on a mesuré l'intensité au picoampèremètre et on a également enregistré les variations de cette intensité.

En introduisant dans le mélange réactionnel, avant initiation de la réaction, 5 jxl d'une solution de la superoxyde dismutase préparée comme indiqué plus haut, on a obtenu une inhibition de l'émission de lumière et on a considéré arbitrairement que 1 unité d'enzyme superoxyde dismutase serait la quantité d'enzyme qui provoque une inhibition de 50% de l'émission de lumière.

En spectroscopie UV, la superoxyde dismutase extraite a donné le spectre classique des protéines non hématiniques, avec l'épaulement du tryptophane à 290 m[x.

Pour en déterminer le poids moléculaire, on a utilisé deux techniques connues, l'une consistant à déterminer un gradient de centrifugation au saccharose et l'autre mettant en œuvre un gel de Sephadex G 200.

On a pour ce faire utilisé les marqeurs suivants, dont on connaissait le poids moléculaire (P.M.):

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P.M.

ADH de levure 150 000

Albumine bovine 66 000

Peroxydase 40 200

On a conclu à un poids moléculaire de 40 000±2500.

Pour déterminer les sous-unités de la structure protéique de l'enzyme, on a réalisé une électrophorèse en gel de Polyacrylamide additionné de SDS (dodécyl sulfate de sodium) à 10%.

On a observé un seul type de sous-unité, de poids moléculaire d'environ 21 000. Le poids moléculaire de la superoxyde dismutase obtenue peut donc être estimé à 21 000x2, soit 42 000.

Toujours sur le gel de Polyacrylamide, on a obtenu une bande rouge en présence de bathophénanthroline et d'hydra-zine, au niveau précisément de la bande de superoxyde dismutase révélée par le bleu de coomassie.

On a effectué un dosage colorimétrique d'une solution de protéine et on a obtenu pour le fer une valeur qui, en estimant le poids moléculaire de l'enzyme à 42 000, donnait environ 2 atomes de fer par mole.

Une spectrométrie d'absorption atomique d'une solution de protéine à 0,2 mg/ml a confirmé de chiffre.

On peut donc raisonnablement estimer à 2 le nombre d'atomes de fer par mole de la superoxyde dismutase.

Par ailleurs, l'enzyme extraite selon cet exemple s'est révélée ne pas subir de perte appréciable d'activité après 5 minutes à la température de 70°C.

Une électrofocalisation de la superoxyde dismutase a permis d'évaluer à 4,4 le pHi ou point isoélectrique de cette enzyme.

L'enzyme présentait un maximum d'activité pour un pH d'environ 9,5.

On a obtenu une enzyme identique avec des caractéristiques semblables à partir d'une souche bactérienne de Photobacterium leiognathi no ATCC 25 587.

Exemple 2

On a soumis une culture de bactéries de Photobacterium sepia de souche no ATCC 15 709 à une lyse en l'agitant dans de l'eau froide, à raison de 1 g de poids mouillé de bactéries pour 4 ml d'eau. On a ensuite centrifugé à 16 000 tours/ minute pendant 20 minutes à 4°C. On a ajouté au surnageant jaune clair du KCl 3M jusqu'à une concentration finale de 0,1 M.

On a chauffé la solution pendant 3 à 4 minutes dans un bain 'd'eau porté à 60°C. On l'a ensuite refroidie à 4°C et on l'a clarifiée par centrifugation.

On a soumis le surnageant à une précipitation fractionnée par addition de sulfate d'ammonium solide. La fraction active a précipité entre 45 et 75 % de saturation en sulfate d'ammonium et on l'a séparée par centrifugation; on l'a redissoute dans le volume minimal de K2HPO4 5xl0~3M, pH 7,8, et on a dialysé pendant une nuit contre le même tampon phosphate. Le produit de cette dialyse a ensuite été dirigé sur une colonne de gel de Sephadex G 100 ou G 200, équilibrée avec du tampon phosphate 5xlO~3M, pH 7,8. On a concentré la fraction active éluée à l'aide d'une membrane d'ultracentrifugation Diaflo PM-10, et on a ensuite dialysé pendant une nuit contre du K2HPO4 5xlO"3M, pH 7,8.

On a adsorbé l'enzyme superoxyde dismutase sur une colonne de DEAE-Sephadex A-50 temponnée avec du K2HPO4 5 X 10"3M, pH 7,8. On a élué la protéine de la colonne avec un gradient linéaire de K2HPO4, pH 7,8 (de 5 X 10_3M à 3 X ÎO^M).La superoxyde dismutase était ainsi éluée à une concentration en phosphate de 1,4 X 10_1M et on l'a ensuite concentrée. On a effectué une nouvelle filtration dans les mêmes conditions que la précédente sur une colonne de

DEAE-Sephadex A-50. On a ainsi élué l'enzyme à une concentration en phosphate de l,6xlO_IM et on a concentré.

La protéine ainsi extraite et purifiée a donné une bande unique à l'électrophorèse en gel d'acrylamide (100 (xg de protéine pour un gel).

Ainsi, on a obtenu 3 mg de superoxyde dismutase pure à partir de 20 g de cellules congelées de Photobacterium sepia (avec une activité de superoxyde dismutase de 250 à 5000 unités/mg).

On a maintenu l'enzyme active sur une longue période de temps en la conservant dans une solution à 70 à 80% de (NH4)zS04 à 4°C.

On a déterminé le poids moléculaire de l'enzyme purifiée au moyen d'une ultracentrifugation à 45 000 tours/minute et pendant 16 heures, à 4°C. On a mesuré la vitesse de sédimentation par la méthode de Martin et Ames, avec un gradient linéaire en sucrose de 5 à 20 (en poids/volume) et en utilisant un appareillage Beckman Spinco modèle L2-65B, avec un rotor SW 65 K. On a trouvé un coefficient de sédimentation de 3,2 pour cette dismutase, contre un coefficient de 4,82 et 7,4 respectivement pour des alcool déshydrogénases de foie de cheval et de levure. A partir de cette constante de sédimentation, on a donc calculé le poids moléculaire de la superoxyde dismutase extraite comme étant de 42 500 environ.

On a d'autre part établi que la molécule de cette protéine contenait 2 atomes de fer.

L'électrophorése en gels d'acrylamide a donné pour la dismutase une bande unique correspondant à un poids moléculaire de 20 000 à 20 500, montrant ainsi que la molécule pro-téinique était composée de deux sous-unités identiques.

La superoxyde dismutase s'est en outre révélée être très résistante à l'action protéolytique de la trypsine, puisqu'un traitement pendant 60 minutes de 150 [xg de cette superoxyde dismutase avec 10 jig de trypsine à 20°C n'a entraîné aucun changement dans l'activité enzymatique, non plus d'ailleurs que dans la mobilité électrophorétique de la protéine non dissociée.

L'enzyme obtenue était très stable vis-à-vis de la chaleur: aucune perte d'activité enzymatique n'est apparue après 30 minutes à 20° C, 30° C et même 40°C; après 15 minutes à 50°C, une diminution de l'activité de 28% est apparue; après 30 minutes à 50°C, la perte d'activité n'était toujours que de 50% et elle n'était que de 10% et 50% après respectivement 3 minutes et 10 minutes à 60°C.

Une électrofocalisation de la superoxyde dismutase a permis d'évaluer à 4,1 le pHi ou point isoélectrique de cette enzyme.

On a déterminé au moyen d'une solution d'ions 02T préparée par voie électrolytique, que l'enzyme présentait un maximum d'activité pour un pH de 8,5 à 10, avec un optimum à pH 9,5.

Exemple 3

On a traité une souche no ATCC 11 040 de bactéries Photobacterium phosphoreum qui sont des bactéries marines et ont par conséquent une forte concentration saline interne.

La lyse des bactéries était spontanée dans une solution d'EDTA 10_3M, pH 7,8, à 4°C.

On a éliminé les débris cellulaires au moyen d'une centrifugation à 16 000 tours/minute pendant 20 minutes et à 0°C.

Des études préliminaires avaient montré que l'enzyme superoxyde dismutase était stable à 50°C et on a donc éliminé les autres protéines, elles-mêmes thermolabiles, en portant le lysat pendant 3 minutes à 50°C, après une addition de KCl jusqu'à molarité de 0,1 puis on a refroidi le lysat à 4°C et on a séparé les protéines dénaturées par une centrifugation classique.

Toujours à 4°C, on a réalisé une précipitation fractionnée au moyen de sulfate d'ammonium (NH4)2S04 ajouté en une s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

619731

quantité telle que le mélange ou extrait enzymatique traité soit amené à un gradient de concentration de 0 à 30% environ de la saturation à 4°C. On a éliminé la fraction précipitée en centrifugeant pendant 45 minutes à 16 000 tours/minute et à OC.

On a ajouté au surnageant la quantité de sulfate neutre d'ammonium requise pour l'amener à 75 % de la saturation à 4°C.

On a réuni la fraction précipitée par une centrifugation analogue à la précédente.

En vue de purifier la superoxyde dismutase ainsi extraite, on a dissous le précipité recueilli dans un peu de tampon phosphate 5xl0~3M, pH 7,8 et on a dialysé contre ce même tampon pendant 48 heures à 4°C, pour obtenir un extrait (A).

On a ensuite séparé les protéines encore présentes en fonction de la taille de leurs molécules, à l'aide d'un gel de Sephadex G 100, dont la réticulation des grains est telle qu'elle exclut les protéines ayant un poids moléculaires supérieur à 100 000, qui donc sortent très rapidement à l'extérieur du gel. Les molécules dont le poids moléculaire est plus faible pénétrent dans le gel et en sont éluées plus ou moins rapidement selon leur taille.

Pour ce faire, on a mis la résine de Sephadex à gonfler pendant 3 heures dans l'eau, on l'a dégazée et on a filtré sur Büchner pour éliminer l'eau; on l'a placée dans le tampon de filtration et on l'a versée dans une colonne de 50 cm de long sur 3 cm de diamètre intérieur. On a équilibré la colonne par passage de 2 litres de tampon.

On avait au préalable repris l'extrait enzymatique (A) provenant de la dialyse pour le concentrer sur une membrane Diaflo millipore (P.M.-10) sous pression d'azote, jusqu'à un volume de 5 ml. On a déposé ce concentrât sur la colonne préparée comme indiqué ci-dessus et on l'a élué par passage de 500 ml de tampon phosphate 5xl0_3M, pH 7,8. Le débit était de 1 goutte toutes les 8 secondes et on a recueilli des fractions de 2,5 ml; celles ayant une activité notable ont été réunies et concentrées sur membrane Diaflo. On a ainsi obtenu un extrait concentré (B).

On a réalisé une nouvelle étape de purification par Chromatographie sur une résine échangeuse d'ions à base de DEAE Sephadex, résine sur laquelle les protéines sont élués selon leur charge, par des tampons de force ionique croissante.

Pour préparer la colonne, on l'a mise à gonfler dans l'eau, puis on l'a dégazée et lavée dans les solutions suivantes:

NaOH 0,5 M

KH2PO4 0,5 M

en ayant soin de rincer la résine à l'eau distillée entre chaque étape jusqu'à un pH voisin de la neutralité. Après filtration sur Büchner, on a mis la résine en suspension dans du tampon phosphate 0,1 M pH 7,8 et on l'a placée dans une colonne de 30 cm de long sur 3 cm de diamètre intérieur. On a équilibré la colonne en y faisant passer 300 ml de tampon 0,1 M.

On a placé l'extrait concentré (B) sur la colonne ainsi préparée. Une fois cet extrait complètement adsorbé, on l'a élué par 500 ml de tampon phosphate pH 7,8, composés de 250 ml de tampon phosphate 0,1 M auxquels on a progressivement ajouté 250 ml de tampon phosphate 0,5 M. Le débit était de 1 goutte toutes les 5 secondes et le volume des fractions recueillies de 2,5 ml. On a réuni les fractions actives et on les a précipitées par du sulfate d'ammonium, puis conservées sous cette forme à -18 à -20°C.

La pureté de l'enzyme superoxyde dismutase a pu être contrôlée par électrophorése sur gel de Polyacrylamide.

Une détermination du poids moléculaire de l'enzyme au moyen d'une étude de l'élution lors d'une filtration sur Sephadex G 200 a permis, à l'aide de la relation Log(PM) = f (volume d'élution) et des marqueurs connus, d'attribuer à la superoxyde dismutase extraite un poids moléculaire d'environ 40 000.

On a également déterminé ce poids moléculaire par une centrifugation en gradient de sucrose: on a coulé des gradients de sucrose de 5 à 20% dans du tampon phosphate 5xl0~3M, pH 7,8 en mélangeant progressivement 2,60 ml de la solution à 20= à 225 ml de la solution à 5%, dans un dispositif approprié.

On a déposé sur ces gradients de sucrose différents marqueurs protéiques de poids moléculaires connu et de la superoxyde dismutase. On a réalisé l'équilibre par une centrifugation à 45 000 tours/minute, à 5°C et pendant 22 heures. On a alors percé les tubes par le fond et on a recueilli les fractions de 10 gouttes, sur lesquelles on a mesuré les activités enzyma-tiques présentées par les différents marqueurs utilisés. Après avoir tracé la droite représentant la variation du poids moléculaire en fonction du numéro de la fraction d'élution, on a évalué à environ 40 000 le poids moléculaire de la superoxyde dismutase extraite de Photobacterium phosphoreum, ce qui confirmait le résultat précédent.

Pour déterminer le poids moléculaire des sous-unités de la protéine, on a soumis cette dernière, ainsi que des marqueurs dont le poids moléculaire des sous-unités était connu, à une migration électrophorétique sur gel de Polyacrylamide en présence de dodécyl sulfate de sodium. La résolution graphique des valeurs trouvées a permis d'attribuer la valeur 20 000 au poids moléculaire de chaque sous-unité de la molécule de superoxyde dismutase.

Cette dernière s'est avérée très stable encore à 50°C et présenter un maximum d'activité enzymatique pour un pH de 9,5 environ.

Une électrofocalisation de la superoxyde dismutase a conduit à évaluer à 4,2 le pHi ou point isoélectrique de cette enzyme.

Un test colorimétrique tel que décrit précédemment a permis de relever la présence de fer ferreux dans la protéine, un anneau rose apparaissant au niveau de la bande protéique dans un gel de migration électrophorétique préalablement additionné de bathophénanthroline. Le nombre d'atomes de fer ferreux par molécule a été évalué comme étant pratiquement égal à 2.

On a déterminé d'autre part l'inhibition de l'autooxydation de certains composés sous l'action des superoxyde dismutases (SOD) en opérant comme suit:

Exemple 4

On a préparé une solution de pyrogallol 2,5xHHM dans du tampon phosphate K2HPO4 2,0x10~2M, pH 7,7. Cette solution (A) avait un volume de 3 ml.

On a mesuré l'accroissement de la densité optique (DO) à 440 mu par minute pour différents systèmes et on en a déduit le pourcentage d'inhibition, pour chacun des systèmes suivants:

Accroissement Inhibition de DO à %

440 mti/minute

(A) 0,031 (A) + 25 unités de SOD de Photobacterium leiognathi (brute) 0,029 6,5 (A) + 250 unités de SOD de Photobacterium leiognathi (brute) 0,004 87 (A) + 4 [ig de catalase 0,046 -

On voit donc que cette superoxyde dismutase a un effet exceptionnel d'inhibition de l'auto-oxydation du pyrogallol.

s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

«0

65

619 731

8

Exemple 5

On a opéré comme dans l'exemple 4, à cette différence près que le pyrogallol que l'on a mis en solution dans le tampon phosphate était respectivement 5,0xl(HM, 2x1 (HM et 1CHM. Les solutions obtenues étaient dénommées (B), (C) et (D).

On a obtenu les résultats ci-après:

Accroissement Inhibition de DO à 440 mji/ %

minute (X 10)

— Pyrogallol 5 X10-4M (dans tampon phosphate 2,0 X10-2M, pH 7,7)

(B)

(B) + 5 unités de SOD de Photobacterium leiognathi (brute)

(B) + 10 unités de SOD de Photobacterium leiognathi (brute)

(B) + 50 unités de SOD de Photobacterium leiognathi (brute)

(B) + 200 unités de SOD de Photobacterium leiognathi (brute)

(B) + 4 [ig de catalase

— Pyrogallol 2 X 10~4M (id.)

(C)

(C) + 25 unités de SOD de Photobacterium leiognathi (brute)

(C) + 5 unités de SOD de Photobacterium leiognathi (brute)

(C) + 10 unités de SOD de Photobacterium leiognathi (brute)

— Pyrogallol 10~4M (dans tampon phosphate 2,0 X 10~2M, pH 7,7)

0,175

0,070

0,043

0,004

0,001 0,135

0,054

0,026

0,012

0,005

60

75

98

99,5

52

78

91

(D) 0,030

(D) + 1 unité de SOD de

Photobacterium leiognathi (brute) 0,013

57

20

35

Exemple 6

On a préparé des solutions de pyrogallol 10~4M respectivement dans du tampon phosphate K2HPO4 5 X 10~2M et 2X 10_2M, pH 7,7, saturé avec de l'oxygène moléculaire. Ces solutions (E) et (F) avaient un volume de 2,5 ml. On a mesuré l'accroissement de la densité optique à 440 m[i par minute et on en a déduit le pourcentage d'inhibition:

Accroissement de DO à 440 m|U minute (X 10)

Inhibition

%

- K2HPO4 5 X 10_2M

(E)

0,365

-

(E) + 1 unité de SOD de

Photobacterium leiognathi

0,275

25

(E) + 5 unités de SOD de

Photobacterium leiognathi

0,183

50

(E) + 10 unités de SOD de

Photobacterium leiognathi

0,063

83

Accroissement Inhibition de DO à 440 mu ' ^

minute ( x 10)

10

(E) + 20 unités de SOD de

Photobacterium leiognathi 0,018 95

- K2HPO4 2 X 10~2M

(F) 0,062 99(F) + 10 unités de SOD de

Photobacterium leiognathi 0,016 74

On notera que 1 unité d'enzyme dans 2,5 ml correspond à une enzyme 2 X10-9 M.

Exemple 7

On a préparé une solution d'acide ascorbique 10_4M dans un tampon phosphate 2 X 10_2M, pH 7,7.

On a mesuré la variation de la densité optique (DO) à 265 m(i par minute pour chacun des systèmes suivants:

Variation de DO à Inhibition 265 mu/minute %

Témoin 0,016

Témoin + 7,5 unités de SOD de Photobacterium leiognathi (brute) 0,005 Témoin + 10 unités de SOD de Photobacterium leiognathi (brute) 0 Témoin + 15 unités de SOD de Photobacterium leiognathi (brute) 0 Témoin + 20 unités de SOD de Photobacterium leiognathi (brute) 0

69

100

100

100

Exemple 8

On a opéré comme dans l'exemple 7, à cette différence près que l'acide ascorbique 10—4 M a été mis en solution dans 40 un tampon phosphate 5 X10"2M, pH 8,8.

Variation de DO à 265 mji/ minute

Inhibition

%

« Témoin

0,031

Témoin + 7,5 unités de SOD

de Photobacterium

leiognathi (brute)

0,011

65

Témoin + 10 unités de SOD de

s» Photobacterium leio

gnathi (brute)

0,004

87

Exemple 9

55 On a déterminé l'action des superoxyde dismutases sur l'oxydation du luminol catalysé par des ions métalliques, comme suit:

Imax. (x 10' quanta/s/ml)

Inhibition

%

16,2

65

- Système catalytique oxydant: C02+/02/NH40Ac/acide di-hydroxyfumarique.

- pH 9,0 témoin

— pH 9,0 témoin + 140 unités de SOD de Photobacterium sepia

7,3

55

9

619 731

Imax. (X 10' Inhibition quanta/s/ml) %

— pH 9,8 témoin 16,5 -

— pH 9,8 témoin + 140 unités de Photobacterium sepia 11,0 33

- Système catalytique oxydant: Ni2+/02/NH40Ac/acide di-hydroxyfumarique.

- pH 9,0 témoin 4,7 -

- pH 9,0 témoin + 140 unités de SOD de Photobacterium sepia 0,88 81

- pH 9,8 témoin 240 -

- pH 9,8 témoin + 140 unités de Photobacterium sepia 80 67

Exemple 10

On a préparé une suspension à 10= en poids par volume de lipide d'Anchoveta dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 8.

On y a ajouté de la superoxyde dismutase de Photobacterium leiognathi brute, à raison de 0,01 % en poids d'enzyme par rapport au lipide (c'est-à-dire 0,1 mg d'enzyme brute par g de lipide).

On a mesuré dans un appareil de Warburg la consommation d'oxygène par ce système, en le rapportant chaque fois à la valeur obtenue avec un témoin lipidique de même composition, mais ne comportant pas d'ajout de superoxyde dismutase. On a effectué les mesures sur des périodes de temps successives et on a exprimé les résultats obtenus sous la forme d'un pourcentage d'inhibition de l'oxydation par rapport au témoin ne comportant pas d'ajout de superoxyde dismutase.

Temps (en heure)

0-24

24-40

40-42

42-44

% d'inhibition

61

74

72

78

Exemple 11

On a utilisé 5 g de champignons de Paris frais, que l'on a coupés en fines tranches et débarrassés de leurs lamelles colorées, car ces dernières auraient pu perturber la coloration du milieu et rendre difficile l'appréciation du résultat.

On a réparti les champignons ainsi préparés dans plusieurs béchers de 100 ml, dans chacun desquels on a ensuite introduit 50 ml d'une solution tamponnée au pH 7,8 (tampon phosphate 0,01 M) et contenant 0,02% d'acide ascorbique.

Dans l'un des béchers on a ajouté 50 unités de superoxyde dismutase de Photobacterium leiognathi de souche no ATCC 25 521.

On a recouvert chaque bêcher d'une double feuille de papier et on a laissé reposer à la température du laboratoire.

Après 40 heures, on a évalué la densité optique à 600 m|i du surnageant de chacun des béchers: la densité optique trouvée a permis de déduire un accroissement de densité optique de 0,173 en moyenne pour les témoins, alors que l'accroissement de densité optique n'était que de 0,092 pour le surnageant comprenant de la superoxyde dismutase. L'oxydation dans le bêcher ainsi traité était donc de R7 % inférieure à ce qu'elle était dans les béchers témoins.

Exemple 12

On a introduit des tranches de pomme dans une solution de

3 unités de superoxyde dismutase de Photobacterium leo-ignathi de souche no ATCC 25 521 par ml, dans un tampon phosphate pH 7,8. Après quelques minutes, on a retiré les tranches de pomme de la solution et on les a placées dans des boîtes de Pétri où on les a laissées; au bout de quelques jours, on a comparé les tranches ainsi conservées avec des tranches préparées de même, mais conservées sans traitement avec une superoxyde dismutase. Ces dernières sont apparues plus brunes que celles traitées selon l'invention.

. Exemple 13

On a placé des rondelles de pommes de terre dans des béchers contenant chacun trois unités de superoxyde dismutase de Photobacterium leiognathi de souche no ATCC 25 521 par ml, dans le tampon phosphate pH 7,8; on les en a retirées quelques minutes après et on les a ensuite mises dans des boîtes de Pétri où on les a laissées. Après 4 jours, les rondelles ainsi traitées apparaissaient nettement moins oxydées que des rondelles identiques, soumises au même traitement, mais sans addition aucune de superoxyde dismutase.

Exemple 14

On sait que certaines ARN-t ligases de levure sont des lipoprotéines dans lesquelles l'activité enzymatique est fonction de l'intégrité de la partie lipide. On dispose donc là d'une matière dont on peut déterminer objectivement la dégradation par une simple évaluation de l'activité enzymatique et qui, du fait de sa constitution essentiellement lipo-protéique, peut être prise pour modèle de tous les aliments lipo-protéiques.

Les ligases que l'on a utilisées étaient extraites de cellules de levure (Saccharomycetes cerevisiae). Pour les préparer, on a opéré comme suit: on a cultivé des souches de Saccharomycetes cerevisiae no ATCC 9841 dans un milieu contenant 30 g de glucose et 5 g d'extrait de levure, et on a laissé la culture se développer jusqu'au milieu de la phase logarithmique de croissance. On a ensuite effectué une centrifugation, puis on a lavé les cellules et on les a broyées dans un dispositif connu sous la dénomination de French Press; on a ainsi été amenés à traiter 67 g de levure avec 67 ml de tampon (constitué de 0,01 M de tris pH 8, de 0,01 M de MgCh, de 1 mM d'EDTA, de 10% de glycérol et de 2 mM de fluorure de phényl-méthyl-sulfonium). Après le broyage dans le dispositif dénommé French Press, répété trois fois, on a centrifugé pendant 30 minutes à 15 000 tours/minute. On a repris le surnageant et on l'a à nouveau centrifugé pendant 2 heures à 50 000 tours/minute. On a purifié le surnageant de cette dernière centrifugation sur une colonne de DEAE-cellulose DE-52 de 2 cmx36 cm comportant 80 g de cellulose, ladite colonne étant équilibrée par du tampon phosphate de potassium 0,02 M pH 7,5, 0,02 M de mercaptoéthanol, 1 mM de MgCk et 10% de glycérol. Une fois ledit surnageant mis sur la colonne, on a lavé avec 370 ml du même tampon. On a ensuite élué les ligases avec un tampon phosphate de potassium 0,25 M pH 6,5, 0,02 M de mercaptoéthanol, 1 mM de MgCh et 10% de glycérol.

On a déterminé la densité optique des fractions recueillies en bas de la colonne et on en a testé l'activité avec de la lysine, ainsi qu'avec les autres acides aminés (les valeurs d'activité sont rapportées dans le tableau I ci-après). On a ensuite concentré chaque extrait par ultrafiltration, jusqu'à une concentration en protéines de 10 mg/ml et on a dosé en mesurant la charge de l'ARN-t. Le milieu d'incubation utilisé était de 100 (il et contenait 50 mM d'acide N-morpholino-3-propane sulfurique (pH 6,5), 10 mM de MgCh, 2 mM d'ATP (acide adénosine-triphosphorique), 400 pM (picomoles) de lysine marquée au carbone 14 et 10 unités de densité optique à 260 mfi d'ARN-t total de levure.

Après incubation pendant un temps déterminé, on a déposé 50 (il du mélange réactionnel sur du papier Whatmann DE-81

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

619 731

10

et on a lavé pendant 1 heure et demie avec de l'acide acétique à 8,7% et de l'acide formique à 2,5%. On a ensuite séché le papier ainsi lavé et, sur les taches formées, on a effectué un comptage à l'aide d'un mélange scintillateur à base de toluène.

Pour évaluer l'efficacité de la protection contre l'oxydation du lysine ARN-t ligase de levure procurée par une superoxyde dismutase, on a réalisé une solution de 0,37 mg de lipoprotéines dans 1 ml de tampon phosphate (0,5 M) pH 7,5, et on y a ajouté soit de l'acide ascorbique à 0,1%, soit 90 unités de superoxyde dismutase de Photobacterium leiognathi de souche no ATCC 25 521; dans chaque cas, on a laissé les solutions reposer à 4°C, on en a prélevé des parties aliquotes en des temps différents (voir tableau I ci-dessous) et on a dosé l'activité enzymatique comme indiqué précédemment).

Tableau I

Jours

% d'activité

sans protecteur avec acide avec 90 unités

ascorbique de superoxyde

à 0,1%

dismutase de

Photobacterium

leiognathi

0

100

100

100

2

81

31

97

4

62

19

96

7

35

2,8

72

9

27

1,2

67

On a obtenu des résultats semblables en utilisant le même nombre d'unités des superoxyde dismutases provenant de Pleurotus olearius Gillet, d'Eschirichia coli de souche no ATCC 15 224 ou Férithrocupréine.

Exemple 15

En vue de la détermination de la protection des bactéries contre l'oxydation par une superoxyde dismutase, on a utilisé des bactéries luminescentes de Photobacterium leiognathi de souche no ATCC 25 521 dont on a artificiellement accéléré l'oxydation par photo-réduction de FMN, afin de rendre le phénomène de protection perceptible sur un laps de temps plus court. On a cultivé les bactéries à 28°C sur un milieu comprenant 8 g de bouillon nutritif (Nutrient Broth), 10 g de NaCl, 14 g de Na2HP04,2 g de KH2PO4 et complété à 1000 ml avec de l'eau, et ajusté à pH 7.

On a effectué le comptage des cellules par étalement de 0,1 ml d'une solution bactérienne diluée avec de la solution physiologique salée sur des boîtes de Pétri maintenues à 25 °C et contenant un milieu constitué de 8 g de bouillon nutritif (Nutrient Broth), 10 g de NaCl, 15 g d'agar-agar, et de l'eau jusqu'à un complément de 1000 ml, le pH de ce milieu étant ajusté à 7.

On a centrifugé une culture de 100 ml de Photobacterium leiognathi en croissance exponentielle (leur densité optique à 600 m[i était de 0,3) à la vitesse de 10 000 tours/minute, pendant 10 minutes à 3°C. On a dispersé le culot de centrifugation dans 100 ml de sérum physiologique. Cette suspension bactérienne a été diluée 10 fois dans dû FMN 5xlO~5M et du NaCl à 3% (proportions respectives) jusqu'à un volume final de 10 ml.

On a irradié les bactéries à 25°C à 365 m(i sous une lampe B 100 A et avec agitation constante. Après des durées déterminées d'exposition à la lampe, on a prélevé des parties aliquotes et on a compté les cellules, après les avoir au préalable diluées encore dans du sérum physiologique. Alors que l'on avait lxlO7 cellules/ml avant irradiation, on a compté après des temps déterminés d'irradiation les nombres de cellules/ml rapportés dans le tableau II ci-dessous.

Tableau II

Durée d'exposition

Témoin

Bactéries additionnées de 13,5

(en minutes)

unités/ml de superoxyde dismutase

(dans 10~2M tampon phosphate pH 7)

30

4X106

7 X106

60

5xl0s

3,9 X106

120

8X103

6 X104

Exemple 16

On a opéré comme dans l'exemple 15, en mettant des bactéries de Photobacterium leiognathi de souche no ATCC 25 521 en suspension dans une solution physiologique salée jusqu'à un volume final de 10 ml et on a irradié cette suspension pendant 16 heures à 365 mjx à l'aide d'une lampe B 100 A (énergie incidente 0,55 mW/cm2). On a ensuite placé la suspension dans des boîtes de Pétri, pour déterminer le taux de survie des bactéries.

Bien qu'une irradiation très prolongée, puisque de 16 heures, eût été utilisée, on a pu constater qu'il y avait 3,3 fois plus de bactéries survivantes, par rapport à un essai témoin sans superoxyde dismutase, dans les boîtes de Pétri où se trouvait une suspension à laquelle on avait, avant l'irradiation, ajouté 53 unités par ml de superoxyde dismutase (SOD) de Pleurotus olearius Gillet, les résultats obtenus étant les suivants:

— Bactéries non irradiées 9,7 X104 cellules/ml

— Bactéries irradiées (témoin) 1,5 X102 cellules/ml

— Bactéries irradiées (additionnées de 53 unités/

ml de SOD de Pleurotus olearius) 5,0 X102 cellules/ml

Exemple 17

On a procédé à un essai de préservation d'un bactériophage, qui est une nucléoprotéine et sera dénommée dans la suite bactériophage R 17. On a conservé et dilué ce bactériophage dans une solution comprenant 6 g de Na2HP04, 3 g de KH2PO4, 0,5 g de NaCl, 1 g de NH4CI, 100 ml d'eau et 10 ml de CaCl2 0,01 M. On a fait incuber pendant dix minutes à 38°C 0,1 ml de cette solution de bactériophage avec 0,2 ml d'une solution d'Escherichia coli de souche no ATCC 15 224, 10 g de trypticase, 5 g d'extrait de levure, 10 g de NaCl et 1000 ml d'eau, et ce à une densité optique de 0,5 à 650 mjx et avec 3 ml de suspension de gélose molle (constituée de 8 g d'agar, 10 g de trypticase, 1 g d'extrait de levure, 8 g de NaCl, 1000 ml d'eau, 2 ml de CaCk 1 M et 5 ml de glucose à 20%) que l'on a maintenue à 45°C. On a coulé le tout dans des boîtes de Pétri contenant 20 ml de gélose dure (constituée de 12 g d'agar, 10 g de trypticase, 1 g d'extrait de levure, 8 g de NaCl, 1000 ml d'eau, 2 ml de CaCk 1 M et 5 ml de glucose à 20%); on a placé les boîtes de Pétri à la température de 37°C.

Afin d'accélérer l'oxydation naturelle du bactériophage R 17, on a eu recours à la photoréduction des flavines: on a dilué la solution de bactériophage de 10 fois son volume d'une solution de FMN 10 ~4M, d'EDTA 10~3M et de tampon phosphate pH 7 10~2M; on a réalisé la photoréduction au fluorimè-tre, le volume final de solution étant de 0,8 ml.

Avec une solution contenant initialement 4,lxl08 particules/ml à l'instant t = 0, on a obtenu les résultats reportés dans le tableau III ci-dessous:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tableau III

Particules/ml

Nombre d'opéra

Essai témoin

Avec 13,5 unités/

Protection tions successives

(comportant ml de dismutase

(B)

de photoréduction

0,05 mg dismutase

(rapport ... )

inactivée à pH 3)

(A)

(B)

0

4,1 X108

4,1 X108

—

3

4,9 X107

7,5 X107

1,53

6

5 X106

1,5 X107

3,00

9

5 X105

2 XlO6

4,00

Exemple 18

On a opéré comme dans l'exemple précédent, à cette différence près que, en vue d'accélérer l'oxydation du bactériophage R 17, on a mis 0,3 ml de ce dernier à incuber avec un système enzymatique hypoxanthine/xanthine oxydase/oxygène, le volume du système d'incubation étant de 3 ml.

Après 15 minutes, on a traité à nouveau le système par addition de 0,05 ml de xanthine oxydase et 0,3 ml d'hypoxanthine 10"3M.

Avec, au temps t, 0,5xl08 particules/ml, on a obtenu les résultats du tableau IV ci-dessous en l'absence et en présence de 200 unités/ml de superoxyde dismutase provenant de Photobacterium sepia de souche no ATCC 15 709. On a obtenu des résultats tout à fait semblables avec les superoxyde dismutases de Pleurotus olearius Gillet ou l'érithrocupréine.

Tableau IV

Particules/ml

Nombre

Sans dismutase

Avec dismutase

Mortalité

Mortalité

d'opérations

(témoin)

(200 unités)

%

%

enzvmatiques

(témoin)

(avec successives

dismutase)

0

5,0 XlO8

5,0 XlO8

—

—

î

3,5 XlO8

5 XlO8

30

0

2

2 XlO8

3 XlO8

60

40

Exemple 19

On a testé la protection par les superoxyde dismutases contre l'oxydation de la ribonucléase pancréatique, en réalisant une oxydation mettant en œuvre une photoréduction de FMN pour rendre le phénomène perceptible sur une période plus convenable. A cette fin on a dilué une solution de ribonucléase pancréatique (0,1 mg/ml dans 10~2M de tampon phosphate pH 7 et 10-3M d'EDTA) dans 10 fois son volume d'une solution constituée de FMN 10~4M, EDTA 10~3M, et tampon phosphate 10"2M pH 7, le volume final étant de 0,8 ml, on a ainsi soumis la protéine ribonucléase pancréatique à plusieurs cycles de photoréduction, en l'absence et en présence de 67,5 unités/ml de superoxyde dismutase provenant de Pleurotus olearius Gillet ou en présence de la même dismutase dénaturée et inactive à pH 3.

On a déterminé l'activité de l'enzyme ribonucléase à l'aide d'un spectrophotomètre en suivant l'augmentation de la densité optique à 280 m[i d'une solution de l'acide ribonucléique telle que décrite ci-dessus. Les résultats obtenus figurent dans le tableau V ci-dessous:

Tableau V

% d'activité résiduelle

Nombre de Témoin (sans Témoin avec dis- Dismutase cycles dismutase) mutase (0,05 mg) 67,5 unités/ml inactivée à pH 3

0 100 100 100

3 67 56 89

619 731

Tableau V

C'f d activité résiduelle

Nombre de

Témoin (sans

Témoin avec dis

Dismutase cycles dismutase)

mutase (0.05 mg)

67,5 unités ml

inactivée à pH 3

6

45

45

89

9

22

22

67

Exemple 20

On a utilisé une enzyme superoxyde dismutase de souche Photobacterium leiognathi no ATCC 25 521 en vue de tenter d'améliorer la conservation du milieu connu sous le nom de milieu de Jeffries, contenant du tétrathionate de sodium.

Ce milieu est un milieu d'enrichissement des Salmonella et il est utilisé classiquement comme suit: on introduit dans un tel milieu au tétrathionate de sodium un prélèvement contenant des Salmonella en faible quantité et des bactéries d'Escherichia coli en quantité importante. Après un séjour de 24 heures à l'étuve à 37°C, on a ensemencé une goutte de cette culture sur un milieu de culture gélosé dans une boîte de Pétri. Après une incubation de 24 heures à 37°C, on a observé dans cette culture un très grand nombre de colonies de Salmonella, mais on a relevé une absence totale d'Escherichia coli.

On a ainsi confirmé que ledit milieu au tétrathionate de sodium inhibe les Escherichia coli, mais favorise le développement des Salmonella. Toutefois, il s'est également confirmé que ce milieu n'est vraiment utilisable que sur un maximum de trois semaines, à compter de sa préparation, et même pratiquement sur un maximum de deux semaines. De ce fait même, on ne peut envisager jusqu'à maintenant qu'une fabrication par petits lots d'un tel milieu, ce qui rend la gestion d'un stock difficile et en grève le prix de revient.

Pour réaliser un essai de protection contre l'oxydation du milieu de Jeffries, on a prélevé 100 tubes d'un même lot de ce milieu au tétrathionate de sodium; dans 11 de ces tubes qui contenaient chacun 20 ml de milieu, on a ajouté 2 ml d'une solution de superoxyde dismutase de Photobacterium leiognathi à raison de 15 unités/ml, tous les tubes étant considérés comme des témoins. On a conservé l'ensemble des 100 tubes à la température de +40°C.

On a procédé à des analyses en vue de déterminer la conservation des milieux à raison d'une analyse par semaine pendant 7 semaines et ensuite d'une analyse toutes les deux semaines seulement. Pour chacune de ces analyses on a comparé un tube contenant de l'enzyme avec:

- 1 tube témoin pour les trois premiers essais,

- 2 tubes témoins pour les 4ème et 5ème essais,

- 3 tubes témoins pour les cinq derniers essais.

Pour l'analyse, on a suivi le mode opératoire décrit plus haut au début de cet exemple.

Les résultats sont rassemblés dans le tableau VI ci-après:

Tableau VI

Semaines Tétrathionate Témoins (tétrathionate de sodium)

de sodium + enzyme

1er

2ème

3ème

1

+

+

///////////

////////////

2

+

+

////////////

///////////

3

+

+

////////////

///////////

4

+

+

—

///////////

5

+

+

—

///////////

6

+

+

+

-

7

+

-

-

-

9

+

+

+

+

11

+

+

0

-

13

+

+

+

0

(médiocre)

11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

619 731

12

De ce tableau il ressort immédiatement que les contenus des tubes dans lesquels on avait introduit des enzymes superoxyde dismutases ont conservé toutes leurs propriétés. Le tube témoin quant à lui ne donnait satisfaction que pendant les trois premiers essais, ce qui correspond à la durée de validité considérée jusqu'à maintenant normale pour les lots commerciaux de milieux au tétrathionate de sodium. Lors des essais suivants on a constaté que les résultats pour les tubes témoins étaient très irréguliers, ce qui empêche de considérer le produit comme commercialisable. On constate donc que cette adjonction de 2 ml d'une solution d'enzyme superoxyde dismutase de souche Photobacterium leiognathi no ATCC 25 521 par tube de 20 ml de tétrathionate de sodium a prolongé la résistance à l'oxydation de ce dernier d'au moins 10 semaines et même au-delà.

Exemple 21 Conservation des pommes de terre A. 250 g de pommes de terre épluchées sont cuites à l'eau à 100°C pendant 30 minutes. On leur ajoute 60 ml d'eau et on passe au mixeur jusqu'à obtention d'une masse homogène. Quatre lots de 50 g sont mis dans des béchers et à chaque bêcher 20 ml d'eau sont ajoutés et bien mélangés avec la purée.

Bêcher PI Témoin

P2 500 unités de superoxyde dismutase (10 unités/g)

(P. leiognathi) sont ajoutées et mélangées P3 Témoin plus 0,5 ml 2,0% acide ascorbique

(concentration finale 0,02% acide ascorbique) P4 Comme P3 mais 500 unités de superoxyde dismutase sont aussi ajoutées.

Tous les échantillons sont ensuite lyophilisés et laissés à la température ambiante.

B. On utilise des flocons de pommes de terre contenant 25 mg/kg de BHT (ditertiobutyl paracrésol) et BHA (butyl-s hydroxy-anisole) et monostéarate de glycérol (1 %).

Dans 250 ml d'eau bouillante, on ajoute 45 g des flocons ci-dessus, on laisse 2 minutes et on agite avec une baguette de verre. Deux lots de 50 g de cette purée sont pris et mélangés avec 50 ml d'eau.

10

Ml Témoin

M2 500 unités de superoxyde dismutase

(10 unités/g de purée) sont ajoutées et bien mélangées

15

Les deux échantillons sont ensuite lyophilisés et la poudre laissée à température ambiante.

Après deux mois, l'odeur des échantillons A et B a été comparée par six personnes. En présence de superoxyde dis-20 mutase l'odeur est différente de celle des témoins, moins acide et plus agréable.

Exemple 22

25 Conservation des carottes

On a utilisé exactement le même processus que celui décrit pour les pommes de terre, mais dans le cas de carottes cuites à l'eau, avec la même quantité de superoxyde dismutase/g. Après deux mois, l'odeur des échantillons a été comparée 30 par six personnes. En présence de superoxyde dismutase, l'odeur est différente de celle des témoins, moins acide et plus agréable.

B

Claims (12)

619731

1. Procédé pour lutter contre l'auto-oxydation des substances susceptibles de se dégrader par une oxydation mettant en jeu des ions superoxydes, caractérisé en ce qu'on associe aux-dites substances au moins une enzyme superoxyde dismutase.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites substances sont des aliments, notamment des aliments lipidiques, protéiques ou lipo-protéiques.

2

REVENDICATIONS

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites substances sont des bactéries ou des virus.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites substances sont des milieux de culture utilisés pour la croissance des cellules.

5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites substances sont des lipides.

6. Procédé selon la revendication X, caractérisé en ce que lesdites substances sont des anti-oxydants utilisés dans l'industrie alimentaire.

7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites substances sont des lipides et des anti-oxydants.

8. Procédé selon l'une des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que lesdits anti-oxydants sont choisis parmi le pyrogallol et l'acide ascorbique.

9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la superoxyde dismutase est incorporée à ladite substance à raison de 1 à 200 unités d'enzyme superoxyde dismutase par millilitre ou par gramme de substance.

10. Application du procédé selon la revendication 1 à la lutte contre l'auto-oxydation au moyen d'une enzyme superoxyde dismutase choisie parmi celles extraites de souches bactériennes marines, d'Escherichia coli, de champignons, et celles extraites du sang.

11. Application selon la revendication 10, caractérisée en ce que lesdites souches marines sont des souches de Photobacte-rium leiognathi, de Photobacterium phosphoreum ou de Photo-bacterium sepia.

12. Application selon la revendication 10, caractérisé en ce que lesdites souches marines sont choisies parmi une souche de Photobacterium leiognathi No ATCC 25 521, une souche de Photobacterium phosphoreium No ATCC 11 040 et une souche de Photobacterium sepia No ATCC 15 709.