JPS5813147B2 - 超酸化物ジスムタ−ゼ含有組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酸化抑制剤として、特に食品およびその他の化
合物又は被酸化性媒質用の酸化抑制剤として新規な種類
の超酸化物ジスムターゼ含有の組成物に関するものであ
る。

任意起源の超酸化物ジスムターゼ酵素は被酸化性物質用
酸化抑制剤として、かつ特に脂質、たん白質又はリポた
ん白質食品、ならびに他の物質および被酸化性媒質用酸
化抑制剤として著しく有効なことが見出されている。

超酸化物ジスムターゼは既に記載されており、これらの
ものは牛の赤血球から（Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ，Ｊ−Ｂ＋
ｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２３４，４０＋１９５９）および「
エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）」（Ｋｅｅｌｅ ａｎｄ Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５ｔｐ−６１７６＋１９７
０）から抽出？れる。

超酸化物ジスムターゼは下記 ２０７＋２Ｈ＋→Ｈ２０＋０２ の反応により超過酸化物イオンの不均化を生ずることが
できる酵素である。

従って、これらの酵素はそれらの酵素が見出される物品
又は有機体に対し自己防護系を与えるのに寄与する。

この理由は分子酸素に応答して酸化反応中に生ずる０２
。

イオンに著しく活性でありたん白質、とりわけ他のアミ
ノ酸の中のトリプトファンおよび核酸の酸化によりたん
白質を攻撃する。

本発明の目的は被酸化性物質、特に食品用酸化抑制剤と
して食品工業、細菌およびその他の被酸化性媒質で使用
される酸化防止剤としての超酸化物ジスムターゼの応用
にある。

本発明において「被酸化性物質」とは超酸化物イオンを
含む酸化により劣化され易い任意物質を意味するものと
する。

有効であることを見出した超酸化物ジスムターゼは、と
りわけ例えば「ボトバクテリウム・ポスホリウム（Ｐｈ
ｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）
Ｊ，「ホトバクテ９ウム・レイオグナシ（Ｐｈｏｔｏｂ
ａ−ｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ）」又は［
ホトバクテリウム０セピア（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｓｅｐｉａ）Ｊの菌株の如き海洋細菌株から調製
されるが、しかし又、例を限定するものではないが、例
えば「エシエリヒア・コリ」、例えば［プレウロツス・
オレアリウス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｌｅａｒｉｕｓ
）Ｊの如き菌又は血液から抽出される菌、特にエリスロ
キュプレイン（ｅｒｙｔｈｒｏｃｕｐｒｅｉｎｓｓ）の
如き菌からの任意他の超酸化物ジスムターゼでもさしつ
かえない。

前記種々の菌株のうちでは、ホトバクテリウム・ホスホ
リウムｎ０ＡＴＣＣ１ １，０４０、［ホトバクテリウ
ム・レイヨグナシＪｎ° ＡＴＣＣ２５，５２１、「ホ
トバクテリウム・セピア」ｎＯＡＴＣＣ １５，７０９
、「エシエリヒア・コリ」ｎＯＡＴＣＣ １５，２２４
および［プレウロツス・オレアリウス］ギレット（Ｇｉ
ｌｌｅｔ）」（Ｃｒｙｐｔｏｇａｍｙ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，パリ）を挙げることができる。

前述した超酸化物ジスムターゼの著しい酸化防止効果は
その他の食品中きのこ、りんごおよびじゃがいもについ
ても証明できる。

前記実験は若干の例によって以下に示す。

しかしながら、食品の品質を評価するための多価且つ真
の目的技法を工夫することは現在不可能であり、従って
又大多数の食品および食物の組成およびその本来の姿を
客観的に分析することができる典型的模型を構成する利
点を持つ特定模型について実験を導くように決定した。

このようにして、リポたん白質自動酸化の抑制の模型と
して、リジンＲＮＡ−ｔ酵素リガーゼ上のジスムターゼ
により本発明により与えられる自動酸化抑制活性につい
て試験を実施した。

同様に、一般的な核たん白質の模型として、リポ核たん
白質であるバクテリオファージＲｌ７（ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｐｈａｇｅ Ｒ１７）が使用された。

他の関係で、厳密にたん白質特性の食品模型としてすい
臓リポヌクレアーゼの酸化を試験した。

その他の関係で、紫外線照射に暴露された細菌を酸化か
ら防護する超酸化物ジスムターゼの効果を、テトラチオ
ン酸ナトリウムを含有し且つサルモネラの増殖に対して
活性の「ジエフリース媒質（Ｊｅｆｆｒｉｅｓ ｍｓｄ
ｉｕｍ）Ｊとして知られ、本発明に係る媒質の防護のた
め立証した。

前述した如く、本発明で使用した超酸化物ジスムターゼ
酵素は例えば、エリスロキュプレイン、「エシエリヒア
・コリ」、例えば「プレウロツス・オレアリウス」の如
き菌、例えば「ホトバクテリウム・ホスホリウム］、「
ホトバクテリウム・レイオグナシ」および「ホトバクテ
リウム・セピア」等の如き海洋細菌株の如く任意適当な
給源から抽出することができる。

酵素の給源が何であろうと、問題の適用における効力の
評価は、絶対的条件で測定される場合と同じである。

即ち酵素の活性を、酵素系のヒポキサンチン／キサンチ
ンオキシダーゼ／酸素により生じた反応で、ルミノール
の化学発光の抑制により定量する；それぞれの場合、前
記反応を１ｍｌの０．３３Ｘ１０−Ｍヒポキサンチンを
０．３ｍｌの１０−３Ｍルミノール、０．３ｍｌのＬＭ
，ｐＨ９のＮａＯＨグリシン緩衝剤、０．３ｍｌの１０
−３ＭＥＤＴＡ１ １．８ｍｌの水および０．００５ｍ
ｌの１ｍ９／ｍｌキサンチンオキシダーゼ溶液の混合物
中に射出して行った。

供試混合物を受け入れ且つ光電増倍管の前に位置決めす
るようにした銀線を施したキュベットより成る実験装置
を、超酸化物ジスムクーゼによる抑制のある光強度２）
および前記抑制のない光強度１）を決定するのに使用し
た。

漕中に基体を注入することにより反応を生じさせ、それ
により光子束の放出を生じ、それが光電増倍管に応答し
て電流を生じ、その強度をビコ電流計により測定して記
録した。

定量される適当量の超酸化物ジスムターゼが反応開始前
に反応混合物中に導入される場合には、前記の光放出が
抑制される。

選択される活性の単位は、随意に、酵素抑制のない最大
光強度の５０％減少を生ずる酵素の量に相当するものと
する。

特定の場合には、材料の酸化を活性化して、問題の適用
における超酸化物ジスムターゼの効力を適度な期間に亘
って評価するのが有効である。

このため、実際には、操作を３６５ｍμの照射により還
元したフラビンか、例えばキサンチンオキシダーゼ／ヒ
ポキサンチン／酸素系の如き酵素系により実施する。

酸化を還元したフラビンにより促進させる場合、１０−
４Ｍフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、１０−３Ｍ
ＥＤＴＡおよび１０−”Ｍ， ｐＨ７．０の燐酸塩緩衝
剤の溶液をＭ３６５フィルタを設けたツアィス・スペク
ト口ノルオリ〆一ター内に置いた石？キュベットに照射
し、急速に生すす光還元を５３０ｍμで放出した螢光の
強度減少を観察することにより追跡した。

還元の終りに、溶液を回収し、空気の存在で激しくかき
混ぜると、完全に再酸化され０゜超酸化物イオンを生ず
る。

前記フラビン還元一再酸化サイクルはモノヌクレオチド
の構造を害なうことなく数回反復できることを注目すべ
きである。

変形として、前述したような一定にかき混ぜた溶液にウ
ルトラバイオレット・プロダクツ・インコーポレーテツ
ド（Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎ
ｃ．，）で製作のＢ１００ランプを用いて３６５ｍμの
照射を達することができる。

ヒポキサンチン／キサンチンオキシダーゼ／酸素酵素系
により酸化を促進するのが望ましい場合、０、３ｍｇＩ
Ｏ−３Ｍヒポキサンチン、０．３ｍｌＩＭ，ｐＨ７。

８の燐酸塩緩衝剤、０．３ｍｌ１０−３ＭのＥＤＴＡ，
２、１ｍｌの水および０．０５ｍｌの１ｍ９／ｍｌキサ
ンチンオキシダーゼ溶液を含有する溶液を使用するのが
有利である。

超酸化物ジスムターゼの製造方法法海洋菌培地を水中に
分散せしめて約４℃に維持し、遠心分離し次いで上澄み
の混合液を５０〜６０℃に数分間加熱しなからｐＨを６
．５〜８、好ましくは約７に調整し、約４℃に冷却し、
この温度で遠心分離し、中性塩により上澄み部分の最初
の分別沈殿を行ない、更に混合物を遠心分離して中性塩
による上澄み部分の第二の分別沈殿を行ない次いで遠心
分離することを特徴とする。

この方法の他の例によれば、ｐＨ７．８の燐酸塩緩衝剤
中での最後の遠心分離で得た沈殿物を溶解し次いでこの
ようにして得た溶液を同じｐＨ７．８の燐酸塩緩衝液で
透析することより成る精製工程を備える。

更に他の例によれば、海洋細菌培地から抽出した酵素に
最終遠心分離による生成物をｐＨ７．８の燐酸塩緩衝液
と混合し、次いで前記の同一緩衝液に対して、好ましく
はカラムクロマ卜グラフイー、且つ特に第一のセノアデ
ツクスＧ２００ゲルカラム、ジエチルアミノエチル、セ
ファデツクスカラム（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ
−５０）および第二のセファデツクスＧ２００ゲル力ラ
ムより成る３個の連続力ラム上のクロマトグ）ノイーに
よるクロマトグラノイーで透析することにより精製され
る。

前記方法の第一の工程の細菌水分散液のρＨを６．５〜
８に調製するため、例えば２Ｎアンモニア水を添加し、
溶液を遠心分離し、次いで好ましくは３ＭＫＣｔの塩化
カリウムを０．１Ｍの最終濃縮液に添加する。

このようにして生成した混合物を５０〜６０℃の温度で
数分間、好ましくは３〜４分加熱する。

次いで混合物を約４℃に冷却し、すべての下記工程をこ
の温度で実施する。

前記方法の工程を構成するそれぞれの分別沈殿は、上に
示した如く、水溶液中の中性塩により、好ましくは硫酸
アンモニウム（ＮＨ４）２ＳＯ４により実施する。

更に有利な例によれば、最初の分別沈殿を、処理される
酵素混合物又は抽出物の最終濃度が４℃で約３０〜３５
％の飽和となる量の硫酸アンモニウム（ＮＨ４）２Ｓ０
４を添加することにより実施する。

しかしながら、硫酸アンモニウムの全部又は一部分を１
種又は２種以上の他の適当な塩により置換することがで
き、且つ前記塩の全量は４℃で約３０〜３５％の飽和と
なる最終濃度を与える当量且つ適当な量である。

また他の例によれば、例えば多孔性管の如き多孔性装置
を使用する系、特に４００００以上の分子量を有する分
子を保持し且つ濃縮する第一の多孔管を使用し、次いで
望ましい酵素分子を通過させるが残余の屑および細菌を
保持することができる第二の多孔性管を使用し、かくし
て無菌の酵素抽出物を与える系の如き限外沖過系を使用
することができる。

同様に、第二の分別沈殿を、処理する酵素混合物又は抽
出物の最終濃度が４℃で約７０〜７５％の飽和となる量
硫酸アンモニウム（ＮＨ４）２Ｓ０４を添加することに
より有利に実施することができる。

上記方法により種々の海洋細菌株から得られる超酸化物
ジスムターゼは、非−ヘマチン性の鉄より成る超酸化物
ジスムターゼであって、一方前述し、且つエリスロキュ
プレインである超酸化物ジスムターゼ活性を有する酵素
および［エシェリピア・コリ」から抽出される酵素は、
それぞれ、最初のものは銅および徂鉛で第二のものはマ
ンガンである正価陽イオンより成る。

問題の超酸化物ジスムターゼにおける金属の存在を、原
子吸光写真分析により検出することができ、これは酵素
の１分子当り鉄の２原子に相当する。

又比色試験を実施することができ、これは現在の場合、
随意に例えばヒドラジンの如き還元剤の存在下で、第一
鉄Ｆｓ２＋に対する特定着色により調製された酵素の電
気泳動ゲルを着色することより成る。

この試験で、ゲルは縦に半分に切断され且つ二つの部分
の一方の部分はクーマツシー青（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ
ｂｌｕｅ）に、他方の部分はパンフエナントロリン内に
置かれる。

後者の場合、たん白質バンド水準でピンク環が得られる
なら試験は陽である。

現在、既に知られている如く、かかるピンク環の出現は
、ここで超酸化物ジスムターゼたん白質の存在を指示す
るものと考えることができる。

又、たん白質を注目するため放射性鉄を使用し且つ存在
する二価金属陽イオンに関して化学量論的量を定量する
ことができる。

従って、海洋細菌培地から抽出された超酸化物ジスムタ
ーゼは、非一ヘマチン性鉄より成り、約４００００±２
５００の分子量、および約４〜７のｐＨｉ、すなわち等
電点を有し、且つ約８．５〜１０のｐＨで最犬の酵素活
性、約９．５のｐＨで最適酵素活性を有し、ｐＨ４．５
〜１０．５の範囲内で活性である。

酵素を４℃で中性の硫酸アンモニウム 〔（ＮＦＩ４）２ＳＯ４〕の７０〜８０％溶液中で保護
す？ことができる。

上記方法により製造した超酸化物ジスムターゼの活性を
測定するため、以下に説明する如き酸素／ヒポキサンチ
ン／キサンチンーオキシダーゼ／ルミノールにより生ず
る化学ルミネセンス反応の抑制を評価することが可能で
ある。

前記反応酵素系はルミノールとの化学ルミネセンスを与
え得る０２゜イオンの放出を生ずる。

前記系に超酸化物ジスムターゼの添加は、実際に０２７
イオンを転換し、かくして前記反応で放出光の強度の減
少を生ずる。

超酸化物ジスムターゼは下記反応を接触する：２０２’
＋２Ｈ＋→Ｈ２０＋０２ キサンチンーオキシダーゼおよびキサンチン又はヒポキ
サンチンを使用する酵素反応により生じた超酸化物イオ
ンを前記反応における基体として使用する場合、このよ
うにして生じた超酸化物イオンは著しく不安定であり且
つ光を自然に放出する。

しかしながら、この光は著しく弱く、測定は十分？再現
性でない。

測定は実際には、生成した超酸化物イオンの量を証明す
るため分析装置に、化学ルミネセンス物質のルミノール
、すなわち５−アミノー２，３一ジヒドロ−１，４−フ
タラジンジオンを使用することにより完成される。

ルミノール＋０゜→ｈν十酸化生成物 更に欠本発明者等は、特定配位子の存在下、分子酸素の
水溶液中でＦｅ２＋，Ｎ１２＋又はＣｏ２＋イオンより
成るルミノールの酸化を生ずることができる超酸化物イ
オン生成系、触媒系を開発した。

系に導入された超酸化物ジスムターゼは０２７イオンの
量を減じ、従って光を生ずる。

定量は下記に従った： 下記の反応混合物を使用した： Ｍｍｌ ルミノール １０−３ ０．３燐酸塩
緩衝液 １０−３， ｐＨ７．８ ０．３ＥＤＴＡ
１０−３ ０．３水
２＋５０μｔキサンチンオキシ
ターゼ゛（キサンチンオキシターゼの１〜／ｍｌ溶液、
１．０５ｍｌ）。

前記混合物を光電子増培管の前方の銀線を施したキュベ
ットに入れた。

槽の基体中に、０．３μモルのヒポキサンチンを含有す
る１ｍｌの溶液を注入することにより反応を開始した。

次いで光子束を放出し、これを光電子増倍管に応答して
、電流を生ぜしめ、その強度をピコ電流計で測定記録し
た。

定量せんとする５μｔの超酸化物ジスムターゼを反応開
始前に反応混合物内に導入する場合には、前記光の放出
は抑制される。

？いで、超酸化物ジスムターゼ酵素の単位を前記光放出
の５０％抑制を生ずる前記酵素量であるものとして随意
に定義する。

しかしながら又、本発明の超酸化物ジスムターゼの活性
を、電気化学的還元（Ｊ．Ｍ．ＣｏｒｄｙＩ．Ｆｒｉｄ
ｏｖｉｔｃｈ，Ｊ．Ｂ．Ｃ．２４４巻，２５（１９６９
）第６０４９〜６０５５頁）により調製した０゜イオン
溶９０１ ｍｌを、０．５μモルのルミノールおよび０
．１７ミリモルのｐＨ７．３の燐酸塩緩衝剤を含有する
溶液２ｍｌ中に直接注入することにより、前述したのと
同じ反応の抑制を生ぜしめて定量することが可能である
。

変形としての本発明の超過酸化物ジスムターゼの活性を
下記の如くして決定することができる＝Ｑ．３ｍｌのグ
リセリンーＮａＯＨ １Ｍ．ｐＨ９、０．３ｍｌの１０
−３Ｍ中和したＥＤＴＡ、１．１ｍｌの１０−５Ｍフラ
ビンーモノヌクレオチドおよび０．３ｍｌのルミノール
（２０■／７０ｍｌ）を前述のキュベットに導入し次い
で１ｍｌの１０−２ＭのＮａＢＨ４を注入した。

これらの条件下、Ｉ５００Ｖの電圧に対してｌＯ−７〜
１０−８Ａと定量された信号を得た。

ＮａＢＨ４溶液は新鮮なものを調製するようにし、一方
ルミノールは光を遮断しＯ℃で貯蔵して反応混合物に別
個に添加するよう注意せねばならない。

前記系への超酸化物ジスムターゼの添加は光信号の特定
の抑制を生じ、これは酵素の量に応じて７５％の割合に
まで直線的に変化する。

なお他の変形によれば、超酸化物ジスムターゼの活性を
０．３ｍｌのグリシンーＮａＯＨ ＬＭｐＨ９の緩衝剤
、０．３ｍｌの１０−３Ｍ ＥＤＴＡ，１．１ｍｌの水
および０．３ｍｌの１０−４Ｍルミノールより成る反応
混合物を使用して決定することができる。

５μｔのキザンチンーオキシダーゼ（１ｍｇ／／ｌおよ
び整除できる量の超酸化物ジスムターゼを前記混合物に
添加した。

１ｍｌのヒポキサンチン（０．３ｍｌの１０−３Ｍヒポ
キサンチンを直前に水で１０ｍｌに希釈）を注入した。

光に遮蔽し且つＯ℃で貯蔵しなければならないルミノー
ルは反応混合物に別個に添加することを注意すべきであ
る。

対照（超酸化物ジスムターゼを有しない）を定量して得
られる信号は１５００Ｖの電圧で約Ｉ０−７Ａであり且
つ光信号の抑制は線状で超酸化物ジスムターゼの量の５
０％に比例している。

適当な条件下で、Ｆｅ”，Ｎｉ２＋およびＣ０２＋金属
イオンは超酸化物ラジカルを供給することができると仮
定して、本発明者等は脂質、特にそれらを含有する食品
酸化の問題を研究し、且つそれを前述した金属イオンお
よび適当な配位子より成る系による超酸化物イオン生成
の反応機構と比較した。

次いで例えば没食子酸プロビルの如きピロガロール型の
遊離基連鎖妨害剤（ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａ／ｃｈａｉ
ｎ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｏｒｓ），又は例えばＥＤＴＡ
およびアスコルビン酸の如き遊離基生成抑制剤（［ｒｅ
ｅ ｒａｄｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｏｔｉｏｎ ｉｎｈｉ
ｂｉｔｏｒｓ）の如き食品工業に普通使用される酸化防
止剤は、実際上、あらゆる期待とは逆に、期待されたよ
うに酸化防止剤として作用する代りに酸素によるか金？
イオンに応答して接触され若干の酸化を助長することを
立証した。

次いでｐＨの適当な条件下で、本発明に係る超酸化物ジ
スムターゼは例えば適当な配位子の存在下分子酸素の水
溶液中で電気化学的にＦＭＮＨ２／０２で生じた０２゜
イオン、又はｐｅ２ ＋、Ｎｌ２＋又はＣＯ２＋イオン
の如き酸化系を抑制することを立証した。

このようにして、「ホトバクテリウム・レイヨグナシ」
から抽出した７単位の超酸化物ジスムターゼはｐＨ９．
７でルミノールに対するＣｏ２＋／０。

／テトラグリシン系の作用による光の放出を１６．５％
抑制し、且つｐＨ９でルミノールに対するＮｉ２＋／Ｏ
／シアン系の作用による光の放出を約４０％抑制するこ
とを見出した。

超酸化物ジスムターゼは、超酸化物０。

゜イオンの生成に関係する反応を著しく強く抑制するこ
とにより脂質および食品工業で普通使用される酸化防止
剤およびその他の防腐剤を有効に保護することを証明し
た。

特に、アンチョビーから得られる不飽和脂質の自動酸化
が超酸化物ジスムターゼにより著しく強く抑制されるこ
とを立証した。

更に他の試験で超酸化物ジスムターゼは若干の酸化防止
剤、特に例えばピロガロール又はアスコルビン酸の如き
食品の保存に使用する酸化防止剤の自動酸化に関して保
護作用を有することを証明した。

従って、なおその他の見地から、本発明は食品組成物、
細菌又はビールスの菌株、又は前記食品に関連して、細
菌、ビールス、又はその他の培地成分、有効量の超酸化
物ジスムターゼ酵素より成る培地から得られた組成物に
関する。

当業者にとって、保護される物質と会合する超酸化物ジ
スムターゼ酵素の量は臨界的でないことは明らかであり
、且つ如何なる当業者もそれぞれの特定事例において最
も適当な量を決定することができる。

日常の試験で酵素により与えられる保護の効力、および
必要に応じこの目的で前述したものと同様な活性試験を
使用して変性される酵素量を決定することができる。

しかしながら、例示すると、ｍｌ又はｇ当り１〜１００
単位の超酸化物ジスムターゼ酵素が先に限定した如く自
動酸化性物質の保護に特に適していると指摘することが
できる。

先に証明した如く、超酸化物ジスムターゼは、０ダ超酸
化物イオンの生成に関係する反応を著しく強く抑制する
ことにより、脂質および酸化防止剤、その他食品工業で
普通に使用される防腐剤を有効に保護する。

特に、魚から得られる不飽和脂質の自動酸化が超酸化物
ジスムターゼにより著しく強く抑制されることを立証し
た。

更に、他の試験で、超酸化物ジスムターゼは特定酸化防
止剤、特に例えばピロガロール又はアスコルビン酸の如
く食品の保存に使用される酸化防止剤の自動酸化に対す
る保護効果を有することを示した。

次に本発明を実施例につき説明する。

実施例 １ 「ホトバクテリウム・レイオグナシ」、菌株ｎ°ＡＴＣ
Ｃ２５５２１をｇ／ｔにて下記：Ｅｌ／ｔ Ｎａｃｌ ３０Ｎａ２
ＨＰ０４・１２Ｈ２０ １８．７ＫＨ２ＰＯ４２ ＭｇＳ０４・７Ｈ２０ ０．２（ＮＨ４
）２ＨＰＯ４ ０．５ グルコース １．５ グリセロール １．５ トリプチケース ５ 酵母抽出物 ５ の組成から成る合成培地上で培養した。

この培地を炭酸ナトリウムでｐＨ７．２に調節し次いで
１１０℃で１時間滅菌した。

１ｔの予備培地を使用し、１夜生長させ、次いで１２ｔ
の培地の発酵漕に接種するためそれぞれ２５０ｍｌの培
地を含有する４個のエルレンマイヤーフラスコに分割し
た。

強い換気の下で２０℃で１２時間培養を行ない、生成物
の湿潤重量で１００ｇの細菌を得た。

数個の培養から得られた湿潤重量で１３５ｇの「ホトバ
クテリウム・レイヨグナシ」細菌を６５０ｍｌの水中に
分散させ４℃で１晩放置した。

これに２Ｎのアンモニア水を添加してｐＨ７〜８の培地
を得、次いで１８ｍｌの３ＭのＫＣｔを添加した。

混合物を５８℃に加熱し且つこの温度に４分間維持し、
次いで４℃に冷却して１００００ｒｐｍの速度で１０間
遠心分離した。

更に４℃で操作して、上澄み液を固体硫酸アンモニウム
でｐＨ８で３５％飽和に調節し、遠心分離後上澄みを７
５％硫酸アンモニウム飽和に調節し次いで４℃で１晩放
置した。

ｐＨ７〜８の培地を得るため２Ｎのアンモニア液を添加
し、次いで１８ｍｌの３ＭＫＣｔを添加した。

混合分を５８℃に加熱しこの温度に４分間維持し、次い
で４℃に冷却して１００００ｒｐｍの速度で１０分間遠
心分離した。

なお４℃で操作して、上澄みを固体硫酸アンモニウムで
ｐＨ８で３５％飽和に調節し、遠心分離後上澄みを７５
％硫酸アンモニウム飽和に調節し４℃で１晩放置した。

沈殿した蛋白質を遠心分離により回収し且つ７５％硫酸
アンモニウム溶液中に保存した。

ｍｌ当り９ｍ９の蛋白質溶液の活性（ビウレット）は４
０単位／ｍｇで、これに対し、比較での９ｍｇの蛋白質
／ｍｌの溶液のカタラーゼでは０単位／ｍ９であった。

更に３５〜７５％飽和の濃度勾配を有する硫酸アンモニ
ウムを用いて分別沈殿後、超酸化物ジスムターゼが得ら
れ、これは１４．８ｍｇｉ白質／ｍｌの溶液（ビウレッ
ト）中で１３４〜５００単位／ｍ９の活性を有した。

蛋白質沈殿物をｐＨ７．８の燐酸塩緩衝剤に溶解し次い
で４℃で４８時間透析した。

超酸化物ジスムターゼ酵素を−２０℃で保存した。

この酵素生成物の活性を決定するため、下記の反応混合
物： を入れたキュベットを光電子増倍管の前に置いた。

キュベツト１ｍｌの３Ｘ１０−４Ｍにヒポキサンチンを
注入することにより反応を開始した。

光電子増倍管に応答して光子束を放出し、電流を生じそ
の強度をピコ電流計で測定し、又前記強度の変化を記録
した。

前述の如くして調製した５μｔの超酸化物ジスムクーゼ
溶液を反応開始前に反応混合物中に導入し、光放出の抑
制を得、次いで１単位の超酸化物ジスムターゼ酵素は５
０％の光放出の抑制を生ずる酵素量であるものとした。

ＵＶ分光学により超酸化物ジスムターゼ抽出物は、２９
０ｍμでトリプトファンによる吸収で非一へマチン性蛋
白質の普通のスペクトルを与えた。

分子量を決定するため、一つは遠心分離勾配を蔗糖で決
定することより成り且つ他方はセファデツクスＧ２００
ゲルを用いることより成る２種の既に知られた技法を使
用した。

この目的で、分子量（ＭＷ）が既に知られている下記の
トレーサーを使用した： ＭＷ 酵母ＡＤＨ １５００００牛 アル
ブミン ６６０００ペルオキシダーゼ
４００００４００００±２５００の分子量を
観測した。

酵素の蛋白質構造の匪単位（ｓｕｂ−ｕｎｉｔｓ）を決
定するのに、１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）
を添加したポリアクリルアミドゲル内の電気泳動を使用
した。

約２１０００の分子量を有する１種類のみの叱単位が観
測された。

従って、得られた超酸化物ジスムターゼの分子量を２１
０００Ｘ２、即ち４２０００と概算することができた。

なお、ポリアクリルアミドゲルを使用して、バソフエナ
ン卜ロリン及びヒドラジンの存在下、クーマツシー青に
より現わされた超酸化物ジスムターゼのバンド水準で正
確に赤色のバンドを得た。

たん白質溶液の比色定量を行ない、且つ鉄に対して、酵
素の分子量を４２０００と概算し、１モル当り約２個の
鉄原子を与えた。

０．２■／ｍｌのたん白質溶液の原子吸光測光でこの数
値を確証した。

従って超酸化物ジスムターゼ１モル当りの鉄原子の数を
合理的に２であるとすることができる。

更にこの実施例により抽出した酵素は７０℃の温度で５
分後認められる活性損失を受けないことを確かめた。

超酸化物ジスムターゼの電気的集束（ｅ１ｅｃｔｒ−ｏ
ｆｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）で前記酵素のｐＨｉ、即ち
等電点を４４と算定することができた。

酵素は約９．５のｐＨで最犬の活性を持つが、しかしｐ
Ｈ４．５〜１０．５の範囲で活性であった。

「ホトバクテリウム・セピア」菌、ｎ０ＡＴＣＣ１５，
７０９の菌株から類似の特性を有する類似の酵素が得ら
れた。

この酵素は前記「レイヨグナシ」から単離した酵素とは
免疫化学的に異なるものであった。

実施例 ２ 菌株ｎ’ＡＴＣＣ１５．７０９の１ホトバクテリウム・
セピア」細菌の培地を４ｍｌの水に対し１ｇの湿潤重量
のバクテリアの割合で、冷水中でかき混ぜ乍ら溶菌を行
なった。

次いでそれを１６．００Ｏｒｐｍで２０分間、４℃で遠
心分離した。

淡黄色の上澄みに０．１Ｍの最終濃度となるまで３Ｍの
ＫＣｔを添加した。

溶液を水浴中５５℃で３〜４分間加熱した。

次いでそれを４℃に冷却し遠心分離により清澄にした。

上澄みに固体硫酸アンモニウムを添加して分別沈殿を行
なった。

４５〜７５％の硫酸アンモニウム飽和で活性部分が沈殿
し遠心分離により分離し、それを小量の５Ｘ１０＝Ｍ，
ｐＨ７．８のＫ２ＨＰＯ４に再溶解し、次いで同じ燐酸
塩緩衝剤を使用して１晩透析した。

次いで前記透析による生成物を５×１０−３Ｍ，ｐＨ７
．８の燐酸塩緩衝剤で平衡させたセファデツクスＧ１０
０又はＧ２２２ゲルカラムに添加した。

溶離した活性部分を超遠心分離膜（Ｄｉａｆｌｏ ＰＭ
−１０）を用いて濃縮し次いで５×１０−３Ｍ，ｐＨ７
．８０Ｋ２ＨＰＯ４で１晩透析した。

超酸化物ジスムターゼ酵素を５Ｘ１０−３Ｍ，ｐＨ７．
８Ｋ２ＨＰ０４で緩衝したＤＥＡＥセファデツクスＡ−
５０カラム上に吸着させた。

たん白質はｐＨ７．８（５Ｘ１０−３〜３Ｘ１０−１Ｍ
）Ｋ２ＨＰＯ４の直線勾配を有するカラムから溶離され
た。

超酸化物ジスムターゼを１．４Ｘ１０−’Ｍ燐酸塩で溶
離し次いで濃縮した。

更に沖過を、前の如き同一条件下でＤＥＡＥ−セファデ
ツクス八−５０カラム上で行なった。

このようにして酵素を１．６Ｘ１０−１Ｍの燐酸塩濃度
で溶離し次いで濃縮した。

このように抽出し精製したたん白質をアクリルアミドゲ
ル（１個のゲルに対し１００μｇのたん白質）上で電気
泳動で処理した。

このようにして２０ｇの凍結「ホトバクテリウム・セピ
アＪ細胞から３ｍ９の純粋な超酸化物ジスムターゼが得
られた（５０００単位７ｍ９の超酸化物ジスムターゼ活
性を有する）。

この酵素は（ＮＨ４）２ＳＯ４の７０〜８０％溶液中に
４℃で保存することにより長期間にわたる活性を保持し
た。

精製酵素の分子量を４０００Ｏｒｐｍで１６時間、４℃
での超遠心分離により測定した。

沈降速度を５〜２０の蔗糖直線勾配（重量／容積による
）でマルチン及びエームズ法（Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ
Ａｍｅｓ ｍｅｔｈｏｄ）により、且つベツクマン・ス
ピンコ、Ｌ２−６５Ｂ型、（Ｂｅｃｋｍｅｎ Ｓｐｉｎ
ｃｏ，ｍｏｄｅｌＬ２−６５Ｂ）装置でＳＷ６５Ｋ回転
子を使用して測定した。

このジスムターゼで得られた３２の沈降係数を、それぞ
れ４．８２及び７，４の馬の肝臓及び酵母のアルコール
デスヒドロゲナーゼの係数と比較した。

前記沈降の定数から抽出された超酸化物ジスムクーゼの
分子量は約４２５００と計算された。

又前記たん白質分子は２個の鉄イオンを含有することを
立証した。

アクリルアミドゲルでの電気泳動は、ジスムタ一ゼに対
して、２００００〜２５０００の分子量に相当する単一
バンドを与え、このようにしてたん白質分子が２個の同
一の亜単位より成ることを証明した。

又超酸化物ジスムターゼは、１５０μｇの前記超酸化物
ジスムターゼを１０μｇのトυプシンで２０℃で６０分
間処理して酵素活性が変化しない結果を得たのでトリプ
シンのたん自分解作用、即ち非解離たん白質の電気泳動
移動度に著しく抵抗性を有することを示した。

得られた酵素は熱に関して著しく安定で、酵素の活性損
失は２０℃，３０℃又は４０℃で３０分後においても観
察されず、５０℃で１５分後２８％の活性の減少を観察
し、５０℃で３０分後５０％の活性損失を観察し、６０
℃で３分及び１０分後それぞれ１０％及び５０％の活性
損失を観察した。

超酸化物ジスムターゼの電気集束は前記酵素のｐＨｉ又
は等電点を４．１と決定した。

電気的方法により調製した０２゜イオン溶液を使用して
、酵素がｐＨ８．５〜１０、最高ｐＨ９．５の最大活性
を有することを確かめた。

実施例 ３ 海洋細菌で、従って高い内部塩濃度を有する「ホトバク
テリウム・ホスホリウムＪｎ０ＡＴＣＣ１１０４０菌株
を使用した。

溶菌を１０３Ｍ，ｐＨ７．８のＥＤＴＡ溶液中で任意に
行った。

１６０００ｒｐｍ、０℃で２０分間の遠心分離により細
胞屑を除去した。

初期の研究で超酸化物ジスムターゼ酵素は５０℃で安定
なことを示し、従って熱不安定なその他のたん白質は０
．１モル濃度を得るためＫＣＡを添加後５０℃で３分間
溶解質を加熱することにより除去し、次いで変性したた
ん白質を通常の遠心分離により分離した。

操作を４℃で継続した。

前記温度で、酵素混合物又は処理抽出物が４℃で約Ｏ〜
３０％飽和の濃度勾配を有する量添加した硫酸アンモニ
ウム（ＮＨ４）２ＳＯ４により行なった。

沈殿部分を１６００Ｏｒｐｍ、０℃で４５分間遠心分離
して除去した。

それを４℃で７５％の飽和にするのに必要な中性の硫酸
アンモニウム量を上澄みに添加した。

前述したものと同様に沈殿部分を遠心分離により再び一
緒にした。

このようにして抽出した超酸化物ジスムクーゼを精製す
るため、捕集した沈殿物を小量の５Ｘ１０−３Ｍ， ｐ
Ｈ７．８の燐酸塩緩衝剤に溶解し、この同じ緩衝剤に対
し４℃で４８時間透析して抽出物（Ａ）を得た。

なお存在するたん白質は、粒網目が１０００００より犬
なる分子量のたん白質を追い出し迅速にゲルの外方に排
出するセファデツクスＧ１００ゲルを使用して分子の大
きさの関数として分離した。

低分子量分子はゲル内に浸透しそれらの大きさにより多
少迅速に溶離された。

これを達するため、セファデツクス樹脂を水中に３時間
放置して膨潤せしめ、水を除去するためブブナーｒ斗上
で脱ガスし次いで炉過し、該樹脂を戸過緩衝剤中に入れ
次いで５０ｃｍ長さ、３ｃｍ内径のカラム内に注ぎ入れ
た。

カラムを２６の緩衝剤を流すことにより平衡させた。

透析により得た酵素抽出物（５）を加圧した窒素を有す
るダイアフ口・ミリポア（Ｐ．Ｍ−１０）膜上で５ｍｌ
の容積に先ず濃縮した。

濃縮物を前記の如くして調製したカラム上に付着させ、
次いで５００ｍｌの５Ｘ１０−３Ｍ，ｐＨ７．８燐酸塩
緩衝剤を流して溶離した。

流量は８秒当り１滴で２．５ｍｌの部分を回収し、顕著
な活性を有するこれら部分を一緒にし次いでダイアフ口
膜上で濃縮した。

濃縮した抽出物（Ｂ）をこのようにして得た。

いっそうの精製工程を樹脂のＤＥＡＥセファデツクスよ
り成るイオン交換樹脂上でクロマトグラフイーにより行
ない、その上でたん白質をイオン強度を増加させた緩衝
剤によりたん白質の供給に従って溶離した。

カラムを調製するため、水中に入れて膨潤させ、次いで
下記溶液： Ｍ ＮａＯＨ Ｏ．５ＫＨ２Ｐ
０４ ０，５ の中で、樹脂を各工程中にほぼ中性のｐＨとなるまで蒸
留水でゆすぐように注意した。

ブフナーＦ斗で沖過後、樹脂を０．１Ｍ，ｐＨ７．８の
燐酸塩緩衝剤中に入れ、次いで長さ３０Ｃｍ，内径３確
のカラムに入れた。

３００ｍｌの０．１Ｍ緩衝剤を流し乍らカラムを平衡さ
せた。

濃縮した抽出物（Ｂ）を、このようにして調製したカラ
ムに入れた。

この抽出物が完全に吸収された場合、２５ｍｌの０．１
Ｍ燐酸塩緩衝剤より成る５００ｍｌのｐＨ ７．８燐酸
塩緩衝剤で溶離し、それに２５０ｍｌの０．５Ｍ＊酸塩
緩衝剤を順次添加した。

流量は毎５秒当り１滴で且つ捕集した部分の容積は２．
５ｍｌであった。

活性部分を一緒にし次いで硫酸アンモニウムで沈殿し、
次いでこの形態で−１８〜一２０℃に保存した。

超酸化物ジスムクーゼ酵素の純度をポリアクリルアミド
ゲル上の電気泳動により立証した。

酵素の分子量を、セファデツクスＧ２００の沢過中の溶
離を研究することにより且つ関係式Ｌｏｇ（ＭＷ）＝ｆ
（溶離容積）及び既に知られたトレーサーの使用により
決定し、超酸化物ジスムターゼ抽出物に対し約４０００
０の分子量に帰することができた。

又前記の分子量を、５〜２０％蔗糖勾配を５×１０−３
Ｍ，ｐＨ７．８の燐酸塩緩衝剤中に、２．６０ｍｌの該
２０％溶液を２２５ｍｌの該５％溶液に対し適当な装置
内で次第に混合し乍ら注ぎ入れる蔗糖勾配遠心分離によ
り決定した。

既に知られた分子量の種々のたん白質トレーサー及び超
酸化物ジスムターゼを前記蔗糖勾配上に沈殿させた。

４５０００ｒｐｍ，５℃で２２時間の遠心分離により平
衡を得た。

次いで管底部を貫通して１０滴の部分を回収し、それに
ついて使用した種種のトレーサーにより示された酵素活
性を決定した。

溶離部分の数の関数としての分子量の変化を示す線を画
いて、「ホトバクテリウム・ホスホリウム」から抽出さ
れた超酸化物ジスムターゼの分子量を約４００００と評
価し先の結果を確認した。

たん白質亜単位の分子量を決定するため、亜単位の分子
量が知られているたん白質及びトレーサーをドデシル硫
酸ナトリウムの存在下ポリアクリルアミドゲル上で電気
泳動にかけた。

グラフを分析して、２００００の値を超酸化物ジスムタ
ーゼ分子の各匝単位の分子量に帰することができた。

この超酸化物ジスムターゼは５０℃で安定で、約９．５
のｐＨに対して最犬の酵素活性を有することを確かめた
。

前記酵素のｐＨｉ、即ち等電点は超酸化物ジスムターゼ
の電気集束により４．２であると評価された。

前述した如き比色試験で、たん白質に、予めバソフエナ
ントロリンを添加した電気泳動ゲル中のたん白質バンド
水準で桃色の環を現わし第一鉄の存在を証明することが
できた。

１分子当り約２個の第一鉄が存在することを評価した。

他の関係で、超酸化物ジスムターゼ（ＳＯＤ）に応答す
る若干の化合物の自動酸化の抑制を下記の如く操作する
ことにより決定した。

実施例 ４ ２．５Ｘ１０−３Ｍピロガロールを２．０Ｘ１０−２Ｍ
．ｐＨ７．７の燐酸塩緩衝剤Ｋ２ＨＰ０４により調製し
、３ｍｌの前記溶液（Ａ）を得た。

光学密度（ＯＤ）の増加を種々の系に対し４４０ｍμ／
分で測定し、次いで抑制の％を下記の系について推論し
た： 実施例 ６ １０−４Ｍピロガロールの溶液を５Ｘ１０−２Ｍ及び２
ＸＩＦ２Ｍ，ｐＨ７．７燐酸塩緩衝剤Ｋ２ＨＰ０４にて
分子酸素を飽和させて調製した。

前記溶液（Ｅ）及び（Ｆ）は２．５ｍｌの容積であった
。

４４０ｍμ／分での光学密度の増加を測定し次いで抑制
％を推論した：２．５ｍｌ中の酵素の１単位が２Ｘ１０
−９Ｍの酵才に相当することが注目される。

実施例 ７ １０−４Ｍのアスコルビン酸溶液を２Ｘ１０−２Ｍ，ｐ
Ｈ燐酸塩緩衝剤にて調製した。

光学密度（ＯＤ）の変化をそれぞれ下記の系について２
６５ｍμ／分で測定した： 実施例 ８ １０−４Ｍのアスコルビン酸を５Ｘ１０−２Ｍ，ｐＨ８
．８の燐酸塩緩衝剤に溶解したことを除き、実施例７と
同じ手順を使用した。

実施例 ９ 金属イオンにより接触されたルミノールに対する超酸化
物ジスムターゼの作用を下記の如くして決定した： 実施例 １０ 容積当り１０重量％のアンチョビー脂質の懸濁液を０．
１Ｍ，ｐＨ８の燐酸塩緩衝剤にて調製した。

粗製「ホトバクテリウム・レイヨグナシ」の超酸化物ジ
スムターゼを脂質当り酵素の０．０１重量％の割合で添
加した（即ち、脂質１ｇ当り０．１ｍ９の粗製酵素）。

前記系による酵素の消費をワールブルク装置にて、その
消費を同じ組成であるが超酸化物ジスムターゼを添加し
ない脂質対照と毎回比較し乍ら測定した。

測定を連続的期間行ない得られた結果を超酸化物ジスム
ターゼを添加しない対照と比較した酸化抑制％の形態で
表わした。

実施例 １１ ５ｇの新鮮な茸を使用し、茸を薄切りにし且つ媒質の色
に影響して結果の評価を困難ならしめることもあり得る
着色したひだを除去した。

このように用意した茸を数個の１００ｍ７ビーカーに分
配し、次いで０．０２％のアスコルピン酸を含有するｐ
Ｈ７．８（０．０１Ｍ燐酸塩緩衝剤）の緩衝溶液５０ｍ
ｌを添加した。

１個の前記ビーカーに５０単位の「ホトバクテリウム・
レイオグナシ」菌株ｎ’ＡＴＣＣ ２５，５２１の超酸
化物ジスムターゼを添加した。

各ビーカーを紙の二重シートでおおい、次いで実験室温
で放置した。

４０時間後、各ビーカー上澄みの光学密度は６００ｍμ
を測定し、見出された光学密度は対照に対し０．１７３
の光学密度の増加を推論することができた。

しかるに超酸化物ジスムターゼより成る上澄みに対する
光学密度の増加は僅か０．０９２であった。

従って、このように処理したビーカー内の酸化は対照ビ
ーカー内の酸化より４７％低かった。

実施例 １２ 林檎の薄切りをｐＨ７．８の燐酸塩緩衝剤のｍｌ当り３
単位の「ホトバクテリウム・レイオグナシ」菌株ｎ０Ａ
ＴＣＣ２５，５２１の超酸化物ジスムターゼ溶液中に導
入した。

数分後溶液から林檎薄切り除き、これをペトリ皿に入れ
て放置し、数日後、このように保存した薄切りを同様に
調製し超酸化物ジスムターゼ処理を施さない薄切りと比
較した。

後者の薄切りは本発明に係る超酸化物ジスムターゼで処
理されたものより更に褐色を呈することを観察した。

実施例 １３ じゃがいもの薄切りを、ｐＨ７．８の燐酸塩緩衝剤のｍ
ｌ当り「ホトバクテリクム・レイオヤナシ」閑株。

。ＡＴＣＣ ２５５２１の超酸化物ジスムターゼの３単
位を含有するビーカーに入れ、これらを数分後取り出し
、ペトリ皿に入れ放置した。

４日後、処理した薄切りは同じ処理を受け超酸化物ジス
ムクーゼ無添加の同様な薄切りより著しく酸化が少ない
ことを観察した。

実施例 １４ 若干のＲＮＡ−ｔ酵母リガーゼは酵素活性が完全に脂質
部分に依存するリポ蛋白質であることが知られている。

従って材料は簡単な酵素活性の評価により客観的に決定
することができ、且つその本質的リポ蛋白質組成により
、あらゆるリポ蛋白質食品に対する模型として取ること
ができるその分解生成物を利用することができる。

使用のりガーゼは酵母細胞〔［サツカロミセス・セレビ
ジエーｊ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）］から抽出した。

それらを調製するのに下記の手順を使用した：「サツ力
ロミセス・セレビジェー」ｎ０ＡＴｃｃ９８４１菌株を
３０ｇのダルコース及び５ｇの酵母抽出物を含有する培
地で培養し、培養を生長の対数相の中央まで発展させる
ようにした。

次いで遠心分離し、細胞をフレンチ・プレス（Ｆｒｅｎ
ｃｈ Ｐｒｅｓｓ）として知られる装置で粉砕し、かく
して６７ｇの酵母を６７ｍｌの緩衝剤（０．０１Ｍのト
リスｐＨ８．０．０１ＭのＭｇｃ６２．１ｍＭのＥＤＴ
Ａ，１０％クリセロール及び２ｍＭのフエニルーメチル
ースルホニウムフルオライドより成る）で処理した。

フレンチプレスとして知られる装置で３粉砕工程に従っ
て、溶液を１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。

上澄みを還元し、次いで５ｏｏｏｏｒｐｍで再び２時間
遠心分離した。

この最後の遠心分離からの上澄みを８０Ｉのセルロース
より成る２Ｃｍｘ３６ＣｍＤＥＡＥ−セルロースＤＥ一
５２カラム上で精製し、前記カラムを０．０２Ｍ．ｐＨ
７５の燐酸カリウム緩衝剤、０．０２Ｍのメルカプトエ
タノール、１ｍＭのＭｇｃ６２及び１０係グリセロール
で平衡させた。

前記上澄みをカラムに注ぎ入れ次いで３７０ｍｌの同じ
緩衝剤で洗浄した。

次いでリガーゼを０．２５Ｍ，ｐＨ６．５の燐酸カリウ
ム緩衝剤、０．０２Ｍのメルカプトエタノール、１ｍＭ
のＭｇｃｌ２及び１０％グリセロールで溶離した。

カラムの底部で回収した部分の光学密度を測定し、且つ
活性をリシン及びその他のアミノ酸に対して試験した（
活性の水準は下記第１表で示される）。

次いで各抽出物を限外枦過により１０ｍ９／ｍｌの蛋白
質濃度に濃縮し、次いでＲＮＡ−ｔの供給を測定するこ
とにより定量を行なった。

５０ｍＭのＮ−モルホリノー３−プロパン硫酸（ｐＨ６
．５），１０ｍＭのＭｇｃ６２，２ｍＭのＡＴＰ（アデ
ノシン三燐酸）、４０ｐＭ（ピコモル）の炭素１４・ラ
ベル付リシン及び２６０ｍμの光学密度を有する１０単
位の全酵母ＲＮＡ−ｔを含有する１００μｅの培地を使
用した。

所定期間媒養後、５０μｅの反応混合物をワツ卜７７Ｄ
Ｅ−８１紙上に付着させ、次いで８．７％の酢酸及び２
．５％の蟻酸で１．５時間洗浄した。

このように洗浄した紙を乾燥し、次いで生成したスポッ
トをトルエンを含有するシンチレーター混合物を使用し
て算えた。

超酸化物ジスムターゼで得られるリジン ＲＮＡ−ｔ酵母リガーゼの酸化に対する保護効果を決定
するため、１ｍｌの（０．５Ｍ），ｐＨ７．５の燐酸塩
緩衝剤中に１．３７ｍ＠のリポ蛋白質の溶液を調製し、
次いで０．１％のアスコルビン酸か、［ホトバクテリウ
ム・レイオグナシ］菌株ｎ’ＡＴＣＣ２５，５２１の超
酸化物ジスムターゼの９０単位かを添加し、それぞれの
場合、溶液を４℃で放置し、整除できる部分を種々の時
間（第１表参照）に取り出して酵素活性を前述した如く
して測定した。

「プレウロツス・オレアリウス」ギレット、「エシエリ
ヒア・コリ」菌株ｎ０ＡＴＣＣ １５，２２４又はエリ
スロクプレインから得られた同じ単位数の超酸化物ジス
ムターゼを使用して同様な結果を得た。

実施例 １５ 超酸化物ジスムターゼにより細菌に与えられる酸化に対
する保護を測定するため、「ホトバクテリウム・レイオ
グナシ」菌株ｎ０ＡＴＣＣ２５，５２１の発光細菌を使
用し、短期間にわたる認識できる保護現象を与えるため
ＦＭＮの光還元によりその酸化を人工的に促進した。

細菌を８ｇの栄養素肉汁、１０ｇのＮａｃｌ，１５ｇの
寒天、及び１０００匡とするため残余の水より成り、ｐ
Ｈを７に調節した培地上で２８℃で培養した。

０．１ｍｌの細菌溶液を２５℃に維持し且つ８ｇの栄養
素肉汁、１０ｇＮａｃ６，１５ｇの寒天、及びｉｏｏｏ
ｃｃとする残余の水より成り、ｐＨを７に調節した培地
を含有する生理食塩水で稀釈して広げて細胞を数えた。

１００ｍｌの「ホトバクテリウム・レイオグナシ」の培
地を指数展開（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａ６ ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ）で１０００Ｏｒｐｍの速度で３℃で１０分
間遠心分離した（６００ｍμの光学密度は０．３であっ
た）。

遠心分離残渣を１００ｍｌの生理食塩溶液に分散させた
。

前記細菌懸濁液を５Ｘ１０−５Ｍ ＦＭＮ及び３％Ｎａ
ｃｌ中で１０倍に稀釈し１０ｍｌの最終容積とした。

細菌をＢＩＯＯＡランプの下で且つ絶えずかき混ぜ乍ら
２５℃で３６５ｍμの照射をした。

ランプに所定時間暴露後、整除できる部分を取り出し、
更にそれらを生理食塩溶液で稀釈した後細胞を数えた。

照射前１×１０７の細胞数に対し、照射期間中に測定し
た数えた細胞数／ｍｌを第２表に示す。

実施例 １６ 実施例１５におけると同じ手順を使用して、「ホトバク
テリウム・レイオグナシ」菌株ｎ’ＡＴＣＣ ２５，５
２１を生理食塩水の懸濁液に入れ、最終容積をｌＯｍｌ
とし、次いで前記懸濁液をＢ１０ＯＡランプを使用し３
６５ｍμで１６時間照射した（入射エネルギー５５００
μｗ／ｃｍ２）。

次いで細菌の生存率を決定するため懸濁液をペトリ皿に
入れた。

１６時間の長時間の照射を使用したのに係らず、超酸化
物ジスムターゼを添加しない対照を基準として、照射前
「プレウロツス・オレアリウス」ギレットの超酸化物ジ
スムターゼ（ＳＯＤ）を５３単位／ｍｌ添加した懸濁液
を含有するペトリ皿では？．３倍の生存細菌が存在する
ことを観察し、この結果を下記に示す： ・非照射の細菌 ９．７Ｘ１０’細胞／ｍｌ・照
射した細菌（対照）１．５Ｘ１０２細胞／ｍｌ・照射し
た細菌（５３単位／ｍｌの［プレウロツス・タレアリウ
スｊ ＳＯＤ） ５．ＯＸ１０２細胞／ｍｌ 実施例 １７ 核蛋白質であって且つ以下に説明する如くバクテリオフ
ァージＲ１７に属するバクテリオファージを保存する試
験を行なった。

前記バクテリオファージを保存し次いで６ｙのＮａＨＰ
０４，３ｇのＫＨ２ＰＯ４，０．５ｇのＮａＣ６，１ｇ
のＮＨ４Ｃ６，ｌＯＯｍｌの水及びＬＯｍｌの０．０１
ＭＣａＣｌより成る溶液に稀釈した。

Ｑ．ｌｍｌの前記バクテリオファージ溶液を０．２ｍｌ
の「エシエリヒア・コリ」菌株ｎ０ＡＴｃｃ１５，２２
４，１０ｇのトリプチケース、５ｇの酵母抽出物、１０
″のＮａＣｅ及び？０００ｍｌの水と一緒に３８℃で１
０分間培養し一次いで６５０ｍμで０．５の光学密度で
且つ３ｍｌの軟ゲロース懸濁液（８ｇの寒天、１０ｇの
トリプチケース、１ｇの酵母抽出物、８ｇのＮａＣｇ，
１０００ｍｌの水、２ｍｌのＩＭＣａＣ４及び５ｍｌの
２０係グルコースより成る）と一緒にして４５℃ニ保っ
た。

混合物を２０ｍｌの硬ゲロース（１２ｇの寒天、１０ｇ
のトリブチケース、１ｇの酵母抽出物、８ｇのＮａＣｅ
，１０００ｍｌの水、２ｍｌのＩＭＣａＣｅ２及び５ｍ
ｌの２０％グルコースより成る）を有するペトリ皿に注
ぎ入れ、次いでペトリ皿を３７℃の温度に保った。

バクテリオファージＲ１７の自然酸化を促進するため、
フラビンモノヌクレオチドの光還元を使用し、バクテリ
オファージ溶液を１０−’ＭのＦＭＮ，１０−３ＭのＥ
ＤＴＡ及び１０−２Ｍ，ｐＨ７の燐酸塩緩衝剤より成る
溶液を添加して１０倍に稀釈し、光還元をスペクト口フ
ルオ口メーターで行ない、０．８ｍｌの最終容積の溶液
を得た。

時間１＝０で４．ＩＸ１０８感染粒子／ｍｌを最初含有
する溶液に対して、下記の結果が得られた：実施例 １
８ バクテリオファージＲ１７の酸化を促進するため、実施
例７のバクテリオファーゼ溶液の０．３ｍｌをヒポキサ
ンチン／キサンチンオキシダーゼ／酸素酵素系で培養す
ることを除いて実施例１７と同様にし、培養系の容積を
３ｍｌとした。

１５分後、０．０５ｍｌのキサンチンオキシダーゼ及び
０．３ｍｌの１０−３Ｍヒボキサンチンを添加して系を
再び処理した。

時間１＝０で５．ＯＸ１０８粒子／ｍｌに対し、「ホト
バクテリウム・セピア」菌株ｎ０ＡＴＣＣ１５，７０９
から得られた超酸化物ジスムクーゼの２００単位／ｍｌ
の存在及び不在下において得られた結果を第４表に示す
。

同様な結果を「プレウロツス・オレアリウス」ギレット
又はエリスロクプレインの超酸化物ジスムターゼにより
得た。

実施例 １９ 膵臓のりボヌクレアーゼの超酸化物ジスムターゼの使用
による酸化からの保護を、この現象をいっそう適当な期
間にわたり確認するためＦＭＮの光還元により酸化を生
じさせ試験した。

この目的で、肺臓のりボヌクレアーゼ溶液（１０−２Ｍ
，ｐＨ７の燐酸塩緩衝剤及び１０−３ＭＥＤＴＡ中の０
．１ｍｇ／ｍｌ）をその容積の１０倍に１０−４ＭのＦ
ＭＮ，１０−３ＭのＥＤＴＡ及び１０−２Ｍ，ｐＨ７の
燐酸塩緩衝剤より成る溶液を用いて稀釈し、０．８ｍｌ
の最終容積を有する悴臓のりポヌクアーゼ蛋白質を、「
プレウロツス・オレアリウス」ギレットから得た６７．
５単位／ｍｉの超酸化物ジスムターゼの存在及び不在下
、又はｐＨ３で変性し且つ不活性とした同酵素の存在下
数積の光還元サイクルで試験した。

リボヌクレアーゼ酵素の活性を分光光度計を使用して決
定し、前述しれ如くリポ核酸溶液の２８０ｍμにおける
光学密度の増加を生じた。

この結果を第５表に示す。

実施例 ２０ 「ホ卜ハクテリウム・レイオクナシｊ菌種ｎ。

ＡＴＣＣ ２５，５２１の超酸化物ジスムクーゼ４素を
：ジエフリース培地として知られ、四チオン酸ナトリウ
ムを含有する媒地の保存を改善するのに使用した。

前記媒地をサルモネラ増殖媒地で普通下記のようにして
使用した：少量のサルモネラ及び多量の「エシエリヒア
・コリ」を含有する試料を四チオン酸ナトリウム培地に
導入した。

オープン中３７℃で２４時間後前記培養菌の１滴をペト
リ皿のゲロース培養上に接種した。

３７℃で２４時間の培養後、著しく大量のサルモネラコ
ロニーを前記培養菌中に観察したが絶対に「エシエリヒ
ア・コワ」を観察できなかった。

かくして、前記四チオン酸ナトリウム培地は「エシエリ
ヒア・コリ」を抑制するが、サルモネラの発育を奨励す
ることを確認した。

しかし乍ら又、前記培地は調製してから最大３週間だけ
使用でき、実際には最大２週間使用できることを確認し
た。

この理由で、材料として保存することを困難ならしめ、
これまで小バッチのかかる培地を製造することができる
のみで、従って高価であった。

ジエフリース培地の酸化に対する保護について実験を行
なうため、前記四チオン酸ナトリウム媒地の同じバッチ
から１００個の管を取り、それぞれ２０ｍｌの培地を含
有する１１個の前記管に１５単位／ｍｌを含有する２ｍ
ｌの「ホトバクテリウム・レイオグナシ」超酸化物ジス
ムターゼ溶液を添加し、その他の管は対照として考察し
た。

全部の１００管を一緒に＋４０℃の温度に保った。

媒地の保存を決定するために、週当り１回の分析の割合
で７週、次いで２週毎に１回の割合で分析を行なった。

それぞれの前記分析に対して酵素を含有する１個の管を
下記のものと比較した：・最初の３試験に対し１個の対
照管 ・４及び５の試験に対し２個の対照管 ・最後の５試験に対し３個の対照管 この実施例の開始に当って前述した方法を分析のため使
用した。

この結果を第６表に示す。注：＋＝満足なる結果：純サ
ルモネラ培養菌一二悪い結果：「Ｅ．Ｃｏｌｉ」培養菌 ０＝悪い結果：培養なし この表から、超酸化物ジスムターゼ酵素が導入された管
の内容物はそれらの性質を保持することが直ちに明らか
である。

対照管は、四チオン酸ナトリウムの市販バッチで普通で
あると考えられている有効期間に相当する最初の３回目
までの試験でのみ満足なる結果を与えた。

以下の試験では対照管に対して結果は不規則なことを示
し、これは生成物を商業計画として考えることを不可能
ならしめる。

表の結果から［ホトバクテリウム・レイオグナシ］菌株
ｎ０ＡＴＣＣ２５，５２１を２０ｍｌの四チオン酸ナ卜
リウムの管当り２ｍｌの割合で添加して得を超酸化物ジ
スムターゼ酵素は少なくとも１０週、及びそれ以上酸化
に対する後者の抵抗を延長することがわかる。

実施例 ２１ じゃがいもの防腐 皮をむいた２５０ｇのじゃがいもを水中で１００℃で３
０分間煮沸した。

６０ｍｌの水を添加し次いでミキサで均質な塊を得るま
で処理した。

４個の５０Ｉ試料をビーカーに入れ次いで２０ｍｌの水
を添加し次いでマッシュと十分に混合した。

ビーカーＰ１ 対照 Ｐ２ 「Ｐ．レイオグナシ」超酸化物ジスムターゼ（１
０単位／７）の５０単位を添加し次いで混合したもの Ｐ３ 対照＋〇．５ｍｌの２．０％アスコルビン酸（０
．０２％の最終アスコルビン酸濃度）Ｐ４ ５００単位
の超酸化物ジスムターゼを添加したことを除きＰ３と同
じ 全部の試料を凍結一乾燥し次いで周囲温度に放置した。

２５ｍ？／Ｋ９ＢＨＴ（ブチル化オキシトルエン）及び
ＢＨＡ（ブチル化オキシアニソール）及びモノステアリ
ン酸グリセリン（１％）を含有するじゃがいもフレーク
を使用した。

前述した４Ｆｌのフレークを２５０ｍｌの沸騰水に添加
し、混合物を２分間放置し次いでガラス棒でかき混ぜた
。

２個の前記マッシュの５０ｇ試料を取り次いで５０ｍｌ
の水と混合した。

Ｍ１ 対照 Ｍ２ ５００単位の超酸化物ジスムターゼ（１０単位／
ｇマッシュ）を添加して良く混合したもの ２個の試料を次いで凍結乾燥し次いで粉末を周囲温度で
放置した。

２月後試料Ａ及びＢを６人で比較した。

超酸化物ジスムターゼを含有する試料の匂いは対照のも
と異なり、少し酸性で香りが良かった。

にんじんの防腐 じゃがいもについて記載したのと同じ手順を正確に使用
し、にんじんを水で煮沸し次いでじゃがいもの場合と同
じ量の超酸化物ジスムターゼ／ｇを添加した。

２週後２個の試料の匂いを６人で比較した。

超酸化物ジスムターゼを含有する試料の匂いは酸性が少
なく且つ香りが良かった。

本発明の実施に当っては以下の諸項を実施上の条件とす
ることができる。

（１）酸化により劣化を受け易く且つ超酸化物イオンを
含有する物質の自動酸化の制御において、少なくとも１
種の超酸化物ジスムクーゼの有効量を前記物質に添加す
ることより成る自動酸化の制御方法。

（２）前記物質が食品、特に脂質、たん白質、核たん白
質又はリポたん白質食品である前項記載の方法。

（３）前記物質が細菌又はビールスである前記第１項記
載の方法。

（４）前記物質が細胞を培養するのに使用される培地で
ある前記第１項記載の方法。

（５）超酸化物ジスムターゼを物質のｍｌマはｇ当り超
酸化物ジスムターゼの１〜２００単位の割合で前記物質
に混入して成る前記第１項記載の方法。

（６）超酸化物ジスムターゼが海洋細菌株から、「エシ
エリヒア・コリ」、菌類、又は血液、特にエリスロキュ
プレインから抽出されたものの中から選択されて成る前
記第１項記載の方法。

（７）前記海洋菌株が「ホトバクテリウム・レイヨグナ
シ」、［ホトバクテリウム・ホスホリウム」又は「ホト
バクテリウム・セピア」、特に「ホトバクテリウム・レ
イヨグナシ」菌株 ｎ０ＡＴＣＣ２５，５２１、「ホトバクテリウム・ホス
ホリウム」閑株ｎ０ＡＴＣＣ１１，０４０又は「ホトバ
クテリウム・セピア」菌株ｎ’ＡＴＣＣ１５，７０９の
菌株である前項記載の方法。

（８）超酸化物イオンを含有し酸化による劣化を受け易
い物質より成る組成物において、前記組成物が前記物質
を酸化から保護し、又はそれらの酸化を軽減するため少
なくとも１種の超酸化物ジスムターゼ酵素を含有して成
る組成物。

（９）たん白質に関連して酸化を受け易いたん白質組成
物及び前記物質を酸化から保護し、又はそれら物質の酸
化を軽減するため少なくとも１種の超酸化物ジスムター
ゼ酵素の有効量とより成り、前記物質が食品、特に脂質
、たん白質、核たん白質又はリポたん白質食品である前
項記載の組成物。

（１０）前記物質及び超酸化物ジスムターゼが特許請求
の範囲１及び前記第１〜６項記載のものである特許請求
の範囲８記載の組成物。

（１１）最後の遠心分離にて捕集した沈殿物をｐＨ７．
８の燐酸塩緩衝剤に溶解し、次いで得られた溶液を同じ
ｐＨ７．８の燐酸塩緩衝剤に対して透析することより成
る特許請求の範囲記載の製造方法。

（１２）最後の遠心分離による生成物をｐＨ７．８の燐
酸塩緩衝剤に添加し、次いで得られた溶液についてクロ
マトグラフイーを行なう特許請求の範囲記載の製造方法
。

（１３）前記クロマトグラフイーが、セファデツクスＧ
２００ゲルカラム上の第一のクロマトグラフイー、ジエ
チルアミノエチルセファデツクス（ＤＥＡＥ−Ｓ）カラ
ム上のクロマトグラフイー、及び更にセファデツクスＧ
２００ゲル力ラム上のクロマトグラフイーより成る前項
記載の製造方法。

（１４）前記混合物を５０〜６０℃で３〜４分間加熱し
てなる特許請求の範囲記載の製造方法。

（１５）前記中性塩が中性の硫酸アンモニウム（ＮＨ４
）２Ｓ０４である特許請求の範囲記載の方法。

（１６）第一の分別沈殿を、このように処理された酵素
混合物、即ち抽出物が４℃で飽和の約３０〜３５係の最
終濃度を有する量添加した （ＮＨ４）２Ｓ０４により実施することより成る前項記
載の方法。

（１７）第二の分別沈殿を、このように処理された酵素
混合物、即ち抽出物が４℃で飽和の約７０〜７５％の最
終濃度を有する量添加した （ＮＨ４）２８０４により実施することより成る前記第
１６項記載の方法。

（ｌ８）限外炉過装置を使用することより成る特許請求
の範囲記載の方法。

（１９）前記限外涙過装置が４００００より犬なる分子
量を有する分子を保持し且つ濃縮する第一の多孔性管と
、所望酵素の分子の通過を許すが、残存細菌を保持する
第二の多孔性管とより成り、かくして無菌の酵素抽出物
を供給する前項記載の方法。

（２０）非−ヘマチン性イオンより成り、それが約４０
０００±２５００の分子量及び約４〜７のｐＨｉ即ち等
電点を有し、且つ約８．５〜１０、最適は約９．５のｐ
Ｈで最犬の酵素活性を有することを特徴とする超酸化物
ジスムターゼ。

（２１）超酸化物ジスムターゼが「ホトバクテリウム・
レイオグナシ」ｎ’ＡＴＣＣ２５，５２１又はＡＴＣＣ
２５，５８７の菌株から得られ、該超酸化物ジスムター
ゼが１分子当り２個の鉄原子より成り、且つ約４２００
０の分子量、４．４のｐＨｉ及びｐＨ９．５の最大酵素
活性を有して成る前項記載の超酸化物ジスムターゼ。

（２２）超酸化物ジスムターゼが１ホトバクテリウム・
セピア」ｎ０ＡＴＣＣ１５，７０９の菌株の培養により
得られ、該超酸化物ジスムターゼが１分子当り２個の鉄
原子より成り、約４２５００の分子量、４，１のｐＨｉ
及び約８．５〜１０のｐＨ、最適９．５のｐＨの最大酵
素活性を有して成る前記第２１項記載の超酸化物ジスム
ターゼ。

（２３）超酸化物ジスムターゼが［ホトバクテリウム・
ホスホリウムＪｎ０ＡＴｃｃ１１０４０の菌株の培養か
ら得られ、該超酸化物ジスムターゼが１分子当り２個の
鉄原子より成り、且つ約 ４００００の分子量、４．２のｐＨ１％及びｐＨ９．５
の最大酵素活性を有して成る前記第２１項記載の超酸化
物ジスムターゼ。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 超酸化物イオンを含有し酸化による劣化を受け易い
   物質より成る組成物において、前記組成物が前記物質を
   酸化から保護し、又はそれらの酸化を軽減するため少な
   くとも１種の超酸化物ジスムターゼ酸素を含有して成る
   ことを特徴とする組成物。