WO2007132628A1 - リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定する方法 - Google Patents

リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定する方法 Download PDF

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Hidenobu Yaku
Hirokazu Sugihara
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention relates to a method for immobilizing malate dehydrogenase on a substrate, and particularly to a method for immobilizing malate dehydrogenase on a substrate using a glycerol solution containing phosphate dehydrogenase.
  • An immunoassay is a method of measuring the amount of a target substance by utilizing the binding property between an antigen and an antibody, that is, an antigen-antibody reaction.
  • Antigen-antibody reactions are the most abundant types of biological phenomena known so far and have the highest target substance discrimination. For this reason, the immunoassay method can directly measure the amount of a target substance contained in a biological sample containing a large number of types of biomolecules from the biological sample without the need for isolation and purification of the target substance. It is attracting attention as a method.
  • FIG. 1 is a process diagram for explaining an example of an immunoassay.
  • the sample solution 5 containing the target substance 4 is added to the tank 1 in which the antibody 2 is immobilized (Al).
  • Antibody 2 has an antigen-binding site for target substance 4. For this reason, an antigen-antibody reaction proceeds between the target substance 4 and the antibody 2 by the supplement.
  • A3 the contaminant 3 that can be contained in the sample solution is removed from the tank 1.
  • the second antibody 7 is added to the tank 1 (A3).
  • Second antibody 7 contains a different antigen binding site than antibody 2.
  • an antigen-antibody reaction proceeds between the target substance 4 and the second antibody 7 that are bound to the antibody 2 by the addition.
  • the second antibody 7 is in a state of being labeled with a known label 6 such as a fluorescent substance, a radioactive substance, or an enzyme.
  • a known label 6 such as a fluorescent substance, a radioactive substance, or an enzyme.
  • the inside of tank 1 is again washed with a nother solution or the like (A4).
  • the second antibody 7 not bound to the target substance 4 is removed from the tank 1.
  • the amount of the complex of antibody 2, labeling substance 4 and second antibody 7 remaining in tank 1, more specifically, the label in a state in which second antibody 7 in the complex is labeled.
  • the amount of target substance 4 is calculated by measuring the amount of body 6 (A5).
  • FIG. 2 is a process diagram for explaining another example of the immunoassay.
  • a solution prepared so as to contain the labeled target substance at a predetermined concentration is added to the tank 1 (Bl).
  • the labeled target substance is a pseudo target substance 4 b that has an antigenic site in common with the target substance 4 a and is labeled with the label 6.
  • a competitive antigen-antibody reaction proceeds between the antibody 2, the target substance 4a, and the labeled target substance in the tank 1.
  • the contaminant 3 that can be contained in the sample solution and the unreacted labeled target substance are removed from the tank 1.
  • the amount of the complex of antibody 2 and the labeled target substance remaining in the tank 1, more specifically, the amount of the labeled body 6 in a state where the labeled target substance in the complex is labeled is measured. Based on the amount of labeled target substance added, calculate the amount of target substance 4a (B3).
  • the amount of the target substance in the sample solution is calculated based on the amount of the label reflecting the amount even in the pattern of deviation and deviation.
  • a method for measuring the amount of the labeled body there is a method power S using an optical measuring means.
  • Tadayuki Tsukatani and Kiyoshi Matsumoto Quantification of L-Tartrate in Wine by Stopped-Flow Injection Analysis Using Immobilized D-Malete Dehydrogenase and Fluorescence Detection, Analytical Sciences, March 2000, vol. 16, pp As described in .265-268, it is difficult to reduce the size and cost of the measuring device because it requires a light source and a luminance detector.
  • JP-A-2-062952 and JP-A-9-297121 disclose an enzyme cycling reaction system in which alkaline phosphatase is used as a label and potassium hexanoate (III) is used as an electron mediator.
  • a biosensor that electrochemically measures the amount of a target substance in a sample is disclosed.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining an enzyme cycling reaction system used in the biosensor described in JP-A-2-062952 and JP-A-9-297121.
  • This enzyme cycling reaction system consists of alkaline phosphatase, nicotinamide It is composed of first to third reactions induced in a reaction solution containing nindinucleotide phosphate oxidized form (NADP), ethanol, alcohol dehydrogenase, diaphorase, and potassium ferricyanide as a substrate for diaphorase.
  • the first reaction is a reaction in which NADP is dephosphorylated by alkaline phosphatase and converted to nicotinamide adenine dinucleotide oxidized form (NAD).
  • NADP nindinucleotide phosphate oxidized form
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide oxidized form
  • the second reaction is a reaction that is reduced to nicotinamide adenine dinucleotide reduced form (NADH) by undergoing a redox reaction catalyzed by alcohol dehydrogenase together with the NAD force ethanol produced by the first reaction. .
  • NAD H produced by the second reaction reacts with potassium ferricyanide by the catalytic action of diaphorase and is oxidized to NAD. This reaction is converted to (potassium ferrocyanide).
  • NADP may be nicotinamide adenine dinucleoside phosphate reduced form (NADPH).
  • Ferrocyanic potassium is converted to potassium ferricyanide by applying a voltage to the reaction solution.
  • the amount of alkaline phosphatase in the reaction solution is reflected in the amount of potassium ferrocyanide generated in the third reaction through the above first to third reactions.
  • the amount of alkaline phosphatase can be measured by measuring the amount of oxidation current generated in association with the conversion from potassium ferrocyanide to ferricyanium potassium.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining this novel enzyme cycling reaction system.
  • the basic reaction mechanism is the same as the enzyme cycling reaction system shown in FIG. 3, but the enzyme cycling reaction system proposed by the present inventor is shown in FIG.
  • malate dehydrogenase is used instead of alcohol dehydrogenase, and at least one selected from malic acid and malate is used instead of ethanol.
  • This enzyme cycling reaction system does not contain a highly volatile reagent such as ethanol.
  • the reagent that constitutes the enzyme cycling reaction system is strong enough not to deviate from a fixed position even if a slight impact is applied during chip storage. It is important to be able to hold it.
  • the malate dehydrogenase is preferably immobilized in the chip using a storage solution in a state dissolved in a glycerol solution.
  • the glycerol solution of malate dehydrogenase is known to have less inactivation of malate dehydrogenase than other preservative solutions added in, for example, a 3.2 M ammonium sulfate solution.
  • An object of the present invention is to provide a method capable of immobilizing malate dehydrogenase on a substrate while using a glycerol solution of malate dehydrogenase.
  • the present inventor is selected from malic acid and malate as the glycerol solution containing malate dehydrogenase. It was found that the addition of at least one kind facilitates drying of the glycerol solution, and the method of the present invention was completed. That is, in the present invention, a mixed solution obtained by adding at least one selected from malic acid and malate to glycerol containing malate dehydrogenase is placed on a substrate and dried. Provides a method of immobilizing malate dehydrogenase on the substrate, wherein the malate dehydrogenase is immobilized on the substrate.
  • FIG. 1 is a process diagram for explaining an example of an immunoassay method.
  • FIG. 2 is a process diagram for explaining another example of immunoassay.
  • Figure 3 shows an enzyme cycling reaction system using alcohol dehydrogenase.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining a novel enzyme cycling reaction system.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of a chip for performing an immunoassay.
  • FIG. 6 is a diagram showing another example of a chip for performing an immunoassay.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of constant potential measurement in Example 1.
  • the present inventor added at least one selected from malic acid and phosphonate to the glycerol solution of malate dehydrogenase, although it is difficult to dry and fix it on the substrate as it is. By doing so, it was found that it could be dry-fixed.
  • other reagents constituting the enzyme cycling reaction system shown in FIG. 4 namely ferricyanium potassium, diaphorase and NADP or NADPH, are added to the glycerol solution of malate dehydrogenase. It seems that even if supplemented, the glycerol solution cannot be changed to a dry state.
  • malate it is preferable to add malate to the glycerol solution containing malate dehydrogenase. This is because malate dehydrogenase can be immobilized on a substrate while avoiding a decrease in its activity more reliably, as shown in the examples described later.
  • examples of malate include at least one selected from sodium malate and potassium malate.
  • the enzyme cycling reaction shown in FIG. 4 is added to the solution in addition to at least one selected from malate and malate. It is not excluded to add further additives represented by other reagents constituting the system.
  • Examples of the material of the substrate include polyethylene terephthalate (PET).
  • PET polyethylene terephthalate
  • the substrate material may be a resin material other than PET typified by polycarbonate, polyimide and polypropylene, or glass.
  • a mixed solution obtained by adding at least one selected from malic acid and malate to glycerol containing malate dehydrogenase is a liquid solution such as dripping, coating, and spraying. Using a known method for placement on the substrate. Just place it.
  • the substrate on which the mixed solution is disposed is placed at room temperature (25 ° C).
  • the operation of vacuum drying for about 2 hours can be exemplified.
  • the conditions for the drying operation may be appropriately changed as long as the phosphate dehydrogenase can be immobilized on the substrate. Changes to the conditions
  • malate dehydrogenase can be immobilized on a substrate with such a strength that the malate dehydrogenase does not deviate from the fixed position even if a slight impact is applied to the substrate.
  • malate dehydrogenase thus immobilized on the substrate is firmly immobilized, as shown in Examples described later, it easily dissolves in a solvent typified by a sample solution.
  • FIG. 5 and FIG. 6 are diagrams for explaining an example of a chip that measures the amount of a target substance in a sample solution using the enzyme cycling reaction system shown in FIG.
  • the chip 100 includes a sample inlet 8 for introducing the sample solution into the chip, a solution containing an alkaline phosphatase-labeled substance in an amount reflecting the amount of the target substance in the sample solution.
  • the reagent fixing tank 10 and the electrode tank 11 are communicated with each other through a flow path 12a.
  • the reaction layer 9 and the reagent fixing tank 10 are communicated with each other through a flow path 12b.
  • the sample inlet 8 and the reaction layer 9 are communicated with each other through a flow path 12c.
  • the chip 200 has a sample introduction port 8, a reagent fixing tank 10, and an electrode tank 11.
  • the reagent fixing tank 10 and the electrode tank 11 are connected to each other by a flow path 12a, and the sample introduction port 8 and the reagent fixing tank 10 are connected to each other by a flow path 12d.
  • reagent fixing tank 10 At least one selected from malate dehydrogenase, malate and malate, NADP and / or NADPH, potassium ferricyanide, and diphorase are fixed.
  • the reagent from malate dehydrogenase to diaphorase is dissolved in the sample solution introduced into the reagent fixing tank 10.
  • malate dehydrogenase is a mixed solution obtained by adding at least one selected from phosphoric acid and malate to glycerol containing malate dehydrogenase. Is placed on the substrate of the chip and dried to fix it on the substrate.
  • NADP and / or NADPH, potassium ferricyanide and diaphorase can be easily fixed on the substrate by placing them on a chip substrate and drying them.
  • the sample solution introduced from the sample introduction port 8 is sent to the reaction tank 9 through the flow path 12c.
  • the reaction vessel 9 a solution containing an alkaline phosphatase-labeled substance that reflects the amount of the target substance in the sample solution is prepared. Thereafter, the solution is sent to the reagent fixing tank 10 through the flow path 12b.
  • the reaction for obtaining the solution has various patterns as represented by the process diagrams of FIGS. For this reason, the reaction tank 9 may be appropriately adjusted in the number of tanks and flow paths and the arrangement pattern according to the reaction pattern.
  • a solution containing a substance labeled with alkaline phosphatase, which reflects the amount of the target substance in the sample solution is introduced from the sample introduction port 8 into the reagent fixing tank 10 through the channel 12d.
  • the solution is prepared by the chip user prior to introduction into the chip.
  • the potassium ferrocyanide obtained by the cycling reaction is converted into ferricyanite potassium, and the current value flowing during the conversion is measured (constant potential measurement). Then, as described above, the amount of the target substance in the sample solution is calculated based on the current value obtained by the constant potential measurement.
  • the reagent group from malate dehydrogenase to diaphorase is in a state in which it can be dissolved in a solution typified by the sample solution in the channel 12a, 12b, 12d or the electrode tank 11, instead of the reagent fixing tank 10. It may be fixed.
  • the electrode configuration in the electrode chamber 11 may be a bipolar type consisting of a working electrode and a counter electrode, or a three-electrode type consisting of a working electrode, a counter electrode and a reference electrode. It may be a polar type.
  • the liquid feeding between the tanks may be performed by using, for example, centrifugal force, or may be performed by applying pressure in the flow path using, for example, a pump.
  • Table 1 shows the state of each solution after the drying operation and the fixed state of the above components from potassium ferricyanide to malate dehydrogenase contained in each solution.
  • Aqueous ferricyanide solution Completely dry and strong
  • the potassium ferricyanide aqueous solution, the diaphorase solution, and the NADP aqueous solution were completely dried after the drying operation.
  • the sodium malate aqueous solution and the potassium malate aqueous solution did not become completely dry after the drying operation, but became very viscous.
  • the malic acid aqueous solution was almost completely dried after the drying operation.
  • the above-mentioned components from potassium ferricyanide to potassium malate contained in each solution were firmly fixed on the substrate.
  • the malate dehydrogenase solution hardly dried after the drying operation, and the malate dehydrogenase in the solution was not fixed on the substrate.
  • the state of “solidly fixed on the substrate” means that the PET substrate in a state where each solution is dropped and dried is centrifuged at lOOOrpm for 5 seconds, and the dried reagent, It means that it is still attached to the substrate, and “not fixed on the substrate” means that the dried reagent can be removed from the substrate by the centrifugation. To do.
  • the immobilization of malate dehydrogenase on the substrate by the following mixed solutions A to C was examined.
  • the mixed solution A is a solution obtained by mixing a malate dehydrogenase solution and a ferricyanium potassium aqueous solution prepared in the same manner as in Comparative Example 1.
  • the mixed solution B is a solution obtained by mixing a malate dehydrogenase solution and a diphorase solution prepared in the same manner as in Comparative Example 1.
  • the mixed solution C is a solution obtained by mixing the malate dehydrologase solution prepared in the same manner as in Comparative Example 1 and the NADP aqueous solution.
  • Each of the mixed solutions A to C was dropped onto a PET substrate and vacuum-dried at room temperature for 2 hours.
  • Table 2 shows the state of each solution after the drying operation and the fixed state of malate dehydrogenase contained in each solution.
  • Table 2 also shows the states of mixed solutions D to F described later.
  • the mixed solution D is a solution obtained by mixing a malate dehydrogenase solution and an aqueous sodium malate solution prepared in the same manner as in Comparative Example 1.
  • the mixed solution E is a solution obtained by mixing the malate dehydrogenase solution and the malic acid aqueous solution prepared in the same manner as in Comparative Example 1.
  • the mixed solution F was prepared in the same manner as in Comparative Example 1. This is a solution obtained by mixing a casease solution and an aqueous potassium malate solution.
  • the mixed solutions D and F did not become completely dry after the drying operation, but became very viscous.
  • the mixed solution E was completely dried after the drying operation.
  • malate dehydrogenase can be firmly fixed on the substrate by dropping the mixed solutions D to F onto the substrate and drying them.
  • the fact that malate dehydrogenase in a state of being immobilized on the substrate is derived from a glycerol solution of malate dehydrogenase is determined using a known biosensor (for example, Bioflow (BF-4) manufactured by Oji Scientific Instruments). Can be identified.
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship between the concentration of alkaline phosphatase-labeled CRP antibody in the reaction solution and the current value flowing through each reaction solution immediately after voltage application.
  • a high correlation was observed between the alkaline phosphatase-labeled CRP antibody concentration and the current value.
  • the activity of malate dehydrogenase was maintained. In the reaction solution prepared using the mixed solution E immobilized on the substrate, the activity of malate dehydrogenase was lower than when the mixed solutions D and F immobilized on the substrate were used.
  • a mixed solution in which malate represented by potassium malate and sodium malate is added to a glycerol solution containing malate dehydrogenase is used.
  • malate dehydrogenase can be firmly fixed on the substrate while preventing inactivation.
  • using a mixed solution obtained by adding malic acid to a glycerol solution containing malate dehydrogenase can also firmly fix malate dehydrogenase on the substrate, although the enzyme activity may be reduced.
  • the present invention provides a method for immobilizing malate dehydrogenase on a substrate while using a glycerol solution of malate dehydrogenase in various fields where it is required to perform an immunoassay using a chip-type biosensor. It has great utility value.

Abstract

　リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロールに、リンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種を添加することにより得た混合溶液を、基板上に配置し、乾燥させる。これにより、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液を用いながらも、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを、基板上に固定できる。混合溶液は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液にリンゴ酸塩を添加して調製することが好ましい。リンゴ酸塩は、リンゴ酸カリウムおよびリンゴ酸ナトリウムから選ばれる少なくとも１種が好ましい。

Description

明 細 書
リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定する方法
技術分野
[0001] 本発明は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定する方法に関し、特には、リン ゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロール溶液を用いて、リンゴ酸デヒドロゲナー ゼを基板上に固定する方法に関する。
背景技術
[0002] 免疫測定法は、抗原と抗体の結合性、すなわち抗原抗体反応、を利用することによ り、標的物質の量を測定する方法である。抗原抗体反応は、これまでに知られている 生物現象の中で最も種類が多ぐかつ標的物質の識別性が最も高い。このため、免 疫測定法は、膨大な種類の生体分子が混在する生体試料に含有された標的物質の 量を、当該標的物質の単離精製作業を必要とせずに、生体試料から直接測定できる 方法として注目されている。
[0003] 図 1は、免疫測定法の一例について説明するための工程図である。この例では、ま ず、標的物質 4を含む試料溶液 5を、抗体 2が固定された槽 1内に添加する (Al)。抗 体 2は、標的物質 4に対する抗原結合部位を有している。このため、当該添カ卩により、 標的物質 4と抗体 2との間で抗原抗体反応が進行する。次に、バッファー溶液などを 用いて槽 1内を洗浄する (A2)。これにより、試料溶液に含有され得る夾雑物質 3が、 槽 1内から除去される。その後、第 2の抗体 7を槽 1内に添加する (A3)。第 2の抗体 7 は、抗体 2とは異なる抗原結合部位を含む。このため、当該添加により、抗体 2に結 合した状態にある標的物質 4と第 2の抗体 7との間で、抗原抗体反応が進行する。第 2の抗体 7は、蛍光物質、放射性物質、酵素などの公知の標識体 6により標識された 状態にある。続いて、再度、ノ ッファー溶液などを用いて槽 1内を洗浄する (A4)。こ れにより、標的物質 4に結合していない第 2の抗体 7が、槽 1内から除去される。その 後、槽 1内に残存した、抗体 2、標識物質 4および第 2の抗体 7の複合体の量、より具 体的には当該複合体における第 2の抗体 7を標識した状態にある標識体 6の量、を 測定することにより、標的物質 4の量を算出する (A5)。 [0004] 図 2は、免疫測定法の別例について説明するための工程図である。この例では、標 的物質 4aを含む試料溶液とともに、標識化標的物質を所定濃度で含有するように調 製された溶液を、槽 1内に添加する (Bl)。標識化標的物質は、標的物質 4aと共通 する抗原部位を有し、標識体 6によって標識された状態にある、擬似的な標的物質 4 bである。当該添カ卩により、槽 1内において、抗体 2、標的物質 4aおよび標識化標的 物質の三者間で競合的な抗原抗体反応が進行する。次に、バッファー溶液などを用 いて槽 1内を洗浄する（B2)。これにより、試料溶液に含有され得る夾雑物質 3および 未反応の標識化標的物質などが、槽 1内から除去される。その後、槽 1内に残存した 、抗体 2および標識化標的物質の複合体の量、より具体的には当該複合体における 標識化標的物質を標識した状態にある標識体 6の量、を測定し、標識化標的物質の 添加量に基づレ、て、標的物質 4aの量を算出する（B3)。
[0005] 免疫測定法には、上述の二例以外にも様々なパターンが存在する。しかし、レ、ずれ のパターンにおいても、試料溶液中の標的物質の量は、当該量を反映した標識体の 量に基づいて算出される。標識体の量を測定する方法として、光学的な測定手段を 用レヽる方法力 Sある。当胃亥ガ法は、 Tadayuki Tsukatani and Kiyoshi Matsumoto, Qua ntification of L-Tartrate in Wine by Stopped-Flow Injection Analysis Using Immobili zed D-Malete Dehydrogenase and Fluorescence Detection , Analytical Sciences, M arch 2000, vol. 16, pp.265-268,に記載されているように、光源および輝度検出器を 必要とするため、測定装置を小型化および低コスト化することが難しい。
[0006] 測定装置を小型化および低コストィ匕するとともに、測定を、安全かつ容易に、また、 高い精度で実施する観点から、電気化学的な測定手段を用いる方法が注目されて いる。例えば、特開平 2— 062952号公報および特開平 9— 297121号公報は、アル カリホスファターゼを標識体とし、へキサシァノ鉄 (III)酸カリウム（フェリシアンィ匕カリウ ム）を電子メディエータとして用いる酵素サイクリング反応系を利用して、試料中の標 的物質の量を電気化学的に測定するバイオセンサを開示する。
[0007] 図 3は、特開平 2— 062952号公報および特開平 9一 297121号公報に記載のバ ィォセンサにおいて利用される、酵素サイクリング反応系について説明するための図 である。この酵素サイクリング反応系は、アルカリホスファターゼ、ニコチンアミドアデ ニンジヌクレオチドリン酸酸化型（NADP)、エタノール、アルコールデヒドロゲナーゼ 、ジァホラーゼ、およびジァホラーゼの基質となるフェリシアン化カリウムを含有する反 応溶液において誘導される、第 1〜第 3の反応によって構成されている。第 1の反応 は、 NADPが、アルカリホスファターゼにより脱リン酸化され、ニコチンアミドアデニン ジヌクレオチド酸化型 (NAD)へと変換される反応である。第 2の反応は、第 1の反応 によって生成した NAD力 エタノーノレとともに、アルコールデヒドロゲナーゼの触媒 作用による酸化還元反応を受けて、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型 (N ADH)へと還元される反応である。第 3の反応は、第 2の反応によって生成した NAD Hが、ジァホラーゼの触媒作用によってフェリシアン化カリウムと反応し、 NADへと酸 ィ匕されるとともに、フェリシアンィ匕カリウムがへキサシァノ鉄（Π)酸カリウム（フエロシアン 化カリウム）へと変換される反応である。なお、 NADPは、ニコチンアミドアデニンジヌ クレオチドリン酸還元型（NADPH)であってもよレ、。フエロシアンィ匕カリウムは、反応 溶液中に電圧を印加することにより、フェリシアン化カリウムに変換される。反応溶液 中のアルカリホスファタ一ゼの量は、上記の第 1〜3の反応を経ることにより、第 3の反 応において生成したフエロシアン化カリウムの量に反映される。これにより、フエロシア ン化カリウムからフェリシアンィ匕カリウムへの変換に伴って生じる酸化電流量を測定す ることで、アルカリホスファタ一ゼの量を測定できる。
[0008] バイオセンサをチップ化するためには、酵素サイクリング反応に必要な試薬をチッ プ内に長期的に保持させることが重要である。アルコールデヒドロゲナーゼを利用す る酵素サイクリング反応系では、上記のとおりエタノールを用いる必要がある。ェタノ ールは、高い揮発性を有するために、チップ内に長期的に保持させることが難しい。 このため、アルコールデヒドロゲナーゼを含む酵素サイクリング反応系を利用して、バ ィォセンサをチップ化することは容易ではない。
発明の開示
[0009] 本発明者は、これまでに、揮発性の高い試薬を必要としない新規な酵素サイクリン グ反応系の確立を進めてきた。図 4は、この新規な酵素サイクリング反応系について 説明するための図である。基本的な反応メカニズムは図 3に示す酵素サイクリング反 応系と同様であるが、本発明者が提案する酵素サイクリング反応系は、図 4に示すよ うに、アルコールデヒドロゲナーゼに代えてリンゴ酸デヒドロゲナーゼを、また、ェタノ ールに代えてリンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも 1種を用いる。この酵 素サイクリング反応系は、エタノールのような揮発性の高い試薬を含まない。
[0010] バイオセンサのチップィ匕を実現するためには、酵素サイクリング反応系を構成する 試薬を、チップの保管中に多少の衝撃が加わっても定位置からずれない程度の強固 さで、チップ内に保持できるようにすることが重要である。
[0011] リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、グリセロール溶液に溶解された状態にある保存溶液を 使用して、チップ内に固定することが好ましい。リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロー ル溶液は、例えば 3. 2Mの硫酸アンモニゥム溶液中に添加された状態にあるその他 の保存溶液と比べて、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの失活が少ないことが知られている。
[0012] ところ力 リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液は、乾燥させることが難しぐ 所定の乾燥操作によっても流動性の高い状態が維持されるという問題がある。このた め、当該溶液を用いて、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをチップ内に固定することは容易で はない。
[0013] 本発明は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液を用いながらも、リンゴ酸デ ヒドロゲナーゼを基板上に固定できる方法の提供を目的とする。
[0014] 本発明者は、図 4に示す酵素サイクリング反応系を利用したチップ型のバイオセン サの開発を進める過程において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロール 溶液に、リンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも 1種を添加することにより、 グリセロール溶液が乾燥しやすくなることを見出し、本発明の方法を完成させた。す なわち、本発明は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロールにリンゴ酸およ びリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも 1種を添加することにより得た混合溶液を、基板 上に配置し、乾燥させることによって、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼを前記基板上に 固定する、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定する方法を提供する。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]図 1は、免疫測定法の一例を説明するための工程図である。
[図 2]図 2は、免疫測定法の別例を説明するための工程図である。
[図 3]図 3は、アルコールデヒドロゲナーゼを利用する酵素サイクリング反応系につい て説明するための図である。
[図 4]図 4は、新規な酵素サイクリング反応系について説明するための図である。
[図 5]図 5は、免疫測定法を実施するためのチップの一例を示す図である。
[図 6]図 6は、免疫測定法を実施するためのチップの別例を示す図である。
[図 7]図 7は、実施例 1における定電位測定の結果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 上記のとおり、本発明者は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液について 、そのままの状態では基板上で乾燥固定させることが難しいものの、リンゴ酸およびリ ンゴ酸塩から選ばれる少なくとも 1種を添加することにより、乾燥固定できることを見出 した。詳しくは後述するが、種々の実験結果によれば、図 4に示す酵素サイクリング反 応系を構成するその他の試薬、すなわちフェリシアンィ匕カリウム、ジァホラーゼおよび NADPまたは NADPHなどでは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液に添 カロしても、当該グリセロール溶液を、乾燥しやすい状態に変化させることはできないよ うである。
[0017] リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロール溶液には、リンゴ酸塩を添加する ことが好ましい。後述する実施例で示すように、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを、その活 性の低下をより確実に回避しつつ、基板上に固定することができるからである。リンゴ 酸塩としては、リンゴ酸ナトリウムおよびリンゴ酸カリウムから選ばれる少なくとも 1種を 例示できる。なお、本発明の方法は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液を 基板上に乾燥固定できる限り、当該溶液に、リンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる 少なくとも 1種に加えて、図 4に示す酵素サイクリング反応系を構成するその他の試薬 に代表される添加物を、さらに添加することを排除しない。
[0018] 基板の材料としては、ポリエチレンテレフタレート（PET)が例示できる。基板の材料 は、ポリカーボネート、ポリイミドおよびポリプロピレンなどに代表される PET以外の樹 脂材料であっても、また、ガラスであっても構わない。
[0019] リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロールにリンゴ酸およびリンゴ酸塩から選 ばれる少なくとも 1種を添加することにより得た混合溶液は、滴下、塗布および噴射な どに代表される、液体を基板上に配置するための公知の方法を用いて、基板上に配 置すればよい。
[0020] 上記の混合溶液を、基板上で乾燥させるための乾燥操作としては、後述する実施 例において示すように、当該混合溶液が配置された状態にある基板を、常温 (25°C) で、約 2時間、真空乾燥させる操作が例示できる。乾燥操作の条件は、基板上にリン ゴ酸デヒドロゲナーゼを固定できる限り、適宜変更して構わない。当該条件の変更は
、乾燥固定後に、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性が低下しない程度の範囲に 収めることが好ましい。
[0021] 本発明の方法によれば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを、基板に多少の衝撃が加わつ ても固定した位置からずれない程度の強固さで基板上に固定できる。なお、こうして 基板上に固定されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、強固に固定されるものの、後述す る実施例で示すように、試料溶液に代表される溶媒に対して容易に溶解する。
[0022] 図 5および図 6は、図 4に示す酵素サイクリング反応系を利用して試料溶液中の標 的物質の量を測定するチップの一例について説明するための図である。
[0023] チップ 100は、図 5に示すように、試料溶液をチップ内に導入するための試料導入 口 8、試料溶液中の標的物質の量を反映した量のアルカリホスファターゼ標識化物 質を含む溶液を得るための反応槽 9、試薬固定槽 10、および定電位測定が可能な 電極が保持された電極槽 11を有している。試薬固定槽 10と電極槽 11は流路 12aに より連通されている。反応層 9と試薬固定槽 10は流路 12bにより連通されている。試 料導入口 8と反応層 9は流路 12cにより連通されている。チップ 200は、図 6に示すよ うに、試料導入口 8、試薬固定槽 10および電極槽 11を有している。試薬固定槽 10と 電極槽 11は流路 12aにより、また、試料導入口 8と試薬固定槽 10は流路 12dにより 連通されている。
[0024] 試薬固定槽 10には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ば れる少なくとも 1種、 NADPおよび/または NADPH、フェリシアン化カリウム、ジァホ ラーゼが固定されている。上記のリンゴ酸デヒドロゲナーゼからジァホラーゼまでの試 薬は、試薬固定槽 10に導入される試料溶液に溶解する状態にある。リンゴ酸デヒドロ ゲナーゼは、上記のとおり、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロールに、リン ゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも 1種を添加することにより得た混合溶液 を、チップの基板上に配置し、これを乾燥させることにより、基板上に固定すればよい 。 NADPおよび/または NADPH、フェリシアン化カリウムおよびジァホラーゼは、チ ップの基板上に配置し、これを乾燥させることにより、基板上に容易に固定できる。
[0025] チップ 100では、試料導入口 8から導入された試料溶液が、流路 12cを通じて反応 槽 9に送られる。反応槽 9では、試料溶液中の標的物質の量を反映する、アルカリホ スファターゼ標識された物質を含有する溶液が調製される。その後、当該溶液は、流 路 12bを通じて試薬固定槽 10に送られる。当該溶液を得るための反応は、図 1およ び 2の工程図に代表されるように種々のパターンが存在する。このため、反応槽 9は、 反応のパターンに応じ、槽ならびに流路の数および配置パターンを適宜調整してよ レ、。
[0026] チップ 200では、試料溶液中の標的物質の量を反映する、アルカリホスファターゼ 標識された物質を含有する溶液を、流路 12dを通じて試料導入口 8から試薬固定槽 10に導入する。当該溶液は、チップの使用者が、チップ内に導入する前に調製する
[0027] チップ 100および 200のレ、ずれにおいても、アルカリホスファターゼ標識された物質 を含有する溶液が試薬固定槽 10に導入されると、当該溶液に、上記のリンゴ酸デヒド ロゲナーゼからジァホラーゼまでの試薬群が溶解する。これにより、試薬固定槽 10に おいて、当該試薬群と、溶液中のアルカリホスファターゼとの間で、図 4に示すサイク リング反応が進行する。サイクリング反応後の溶液は、流路 12aを通じて電極槽 11に 送られる。電極槽 11では、当該電極槽 11に導入された溶液に電圧が印加される。こ れにより、サイクリング反応によって得られたフエロシアン化カリウムがフェリシアンィ匕 カリウムに変換されるとともに、当該変換の際に流れる電流値が測定される（定電位 測定)。そして、上記のとおり、定電位測定により得た電流値に基づいて、試料溶液 中の標的物質の量が算出される。
[0028] 上記のリンゴ酸デヒドロゲナーゼからジァホラーゼまでの試薬群は、試薬固定槽 10 に代えて、流路 12a、 12b, 12dや電極槽 11において、試料溶液に代表される溶液 に溶解可能な状態で固定されていてもよい。電極槽 11における電極の構成は、作用 極および対極からなる二極式としてもよいし、作用極、対極および参照極からなる三 極式としてもよい。各槽間の送液は、例えば遠心力を利用することにより行ってもよい し、また例えばポンプなどを利用して流路内に圧力をかけることにより行ってもよい。
[0029] 以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
[0030] (比較例 1)
図 4に示す酵素サイクリング反応に関与する試薬、すなわちフェリシアンィ匕カリウム、 ジァホラーゼ、リンゴ酸ナトリウム、リンゴ酸、リンゴ酸カリウム、 NADPおよびリンゴ酸 デヒドロゲナーゼ、の基板上への固定性について、次のようにして調べた。基板は、 ポリエチレンテレフタレート（PET)基板を使用した。
[0031] フェリシアンィ匕カリウム（和光純薬工業株式会社製）を純水に溶解させて得た 1Mの フェリシアンィ匕カリウム水溶液を 1 L、ジァホラーゼ（ュニチカ株式会社製）を 50mM のリン酸バッファー（pH7. 5)に溶解させて得た 1000U/mLのジァホラーゼ溶液 6 . 7 z L、リンゴ酸ナトリウム (和光純薬工業株式会社製)を純水に溶解させて得た 4M のリンゴ酸ナトリウム水溶液 7. 8 / L、リンゴ酸 (和光純薬工業株式会社製)を純水に 溶解させて得た 4Mのリンゴ酸水溶液 7. 8 β リンゴ酸カリウム（関東化学株式会社 製）を純水に溶解させて得た 4Mのリンゴ酸カリウム水溶液 7· 8 /i L、 NADP (オリエ ンタル酵母工業株式会社製）を純水に溶解させて得た 5mMの NADP水溶液 1 μ L 、および、リンゴ酸デヒドロゲナーゼが 50%グリセロールに溶解した状態にある 2500 OU/mLのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液（ロシュ'ダイァグノステイタス株式会社製） l μ をそれぞれ用意した。
[0032] 各溶液を PET基板上に滴下し、常温で 2時間、真空乾燥させた。乾燥操作後の各 溶液の状態、および各溶液に含有されたフェリシアン化カリウムからリンゴ酸デヒドロ ゲナーゼまでの上記の成分の固定状態を、表 1に示す。
[0033] [表 1] 乾燥操作後の状
固定状態
態
フェリシアン化カリゥム水溶液 完全に乾燥 強固
ジァホラーゼ溶液 完全に乾燥 強固
NADP水溶液 完全に乾燥 強固
リンゴ ド Jゥム水溶液 粘性が高い状態 強固
リンゴ 溶液 ほぼ完全に乾燥 強固
リンゴ リウム水溶液 粘性が高い状態 強固
リンゴ ヒドロゲナ一ゼ溶液 乾燥せず 固定せず
[0034] 表 1に示すように、フェリシアン化カリウム水溶液、ジァホラーゼ溶液および NADP 水溶液は、乾燥操作後に、完全に乾燥した状態になった。また、リンゴ酸ナトリウム水 溶液およびリンゴ酸カリウム水溶液は、乾燥操作後に、完全に乾燥した状態にはなら なかったものの粘性が非常に高い状態になった。また、リンゴ酸水溶液は、乾燥操作 後にほぼ完全に乾燥した状態になった。そして、各溶液に含有されたフェリシアン化 カリウムからリンゴ酸カリウムまでの上記の成分が、基板上に強固に固定された状態 が得られた。これに対し、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの溶液は乾燥操作後にほとんど 乾燥せず、当該溶液中のリンゴ酸デヒドロゲナーゼは基板上に固定されなかった。な お、本明細書において「基板上に強固に固定された」状態とは、各溶液を滴下し乾 燥させた状態にある PET基板を lOOOrpmで 5秒間遠心させても、乾燥状態の試薬 、基板上に付いたままになる状態にあることを意味し、「基板上に固定されなかった 」状態とは、乾燥状態の試薬が、当該遠心により基板上からとれてしまう状態にあるこ とを意味する。
[0035] このように、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有した状態にあるグリセロール溶液を、そ のままの状態で基板上に滴下し乾燥させることによっては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ を基板上に固定することは難しい。
[0036] (比較例 2)
下記の混合溶液 A〜Cによる、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの基板上への固定性につ いて調べた。 [0037] 混合溶液 Aは、比較例 1と同様にして用意したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液および フェリシアンィ匕カリウム水溶液を、混合して得た溶液である。混合溶液 Bは、比較例 1 と同様にして用意したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液およびジァホラーゼ溶液を、混 合して得た溶液である。混合溶液 Cは、比較例 1と同様にして用意したリンゴ酸デヒド ログナーゼ溶液および NADP水溶液を、混合して得た溶液である。
[0038] 混合溶液 A〜Cをそれぞれ PET基板上に滴下し、常温で 2時間、真空乾燥させた 。乾燥操作後の各溶液の状態、および各溶液に含有されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼ の固定状態を表 2に示す。表 2には、後述する混合溶液 D〜Fについての状態もあわ せて示す。
[0039] [表 2]
Figure imgf000011_0001
[0040] 表 2に示すように、混合溶液 A〜Cは、いずれも、乾燥操作後に、完全に乾燥した 状態にはならず、また、粘性が高い状態にもならなかった。これにより、混合溶液 A〜 Cを基板上に滴下し乾燥させることによつても、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に 固定することは難しいことがわかった。
[0041] (実施例 1)
下記の混合溶液 D〜Fによる、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの基板上への固定性につ いて調べた。
[0042] 混合溶液 Dは、比較例 1と同様にして用意したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液および リンゴ酸ナトリウム水溶液を、混合して得た溶液である。混合溶液 Eは、比較例 1と同 様にして用意したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ溶液およびリンゴ酸水溶液を、混合して 得た溶液である。混合溶液 Fは、比較例 1と同様にして用意したリンゴ酸デヒドロゲナ ーゼ溶液およびリンゴ酸カリウム水溶液を、混合して得た溶液である。
[0043] 混合溶液 D〜Fをそれぞれ PET基板上に滴下し、常温で 2時間、真空乾燥させた。
表 2に示すように、混合溶液 Dおよび Fは、乾燥操作後に、完全に乾燥した状態には ならなかったものの粘性が非常に高い状態になった。また、混合溶液 Eは、乾燥操作 後に、完全に乾燥した状態になった。これにより、混合溶液 D〜Fを基板上に滴下し 乾燥させることによって、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に強固に固定できること がわかった。基板上に固定された状態にあるリンゴ酸デヒドロゲナーゼが、リンゴ酸デ ヒドロゲナーゼのグリセロール溶液に由来することは、公知のバイオセンサ（例えば、 王子計測機器株式会社製バイオフロー (BF— 4) )を用いて特定できる。
[0044] 次に、混合溶液 D〜Fに対する乾燥操作によって基板上に固定されたリンゴ酸デヒ ドロゲナーゼにおける、酵素活性について調べた。 PET基板上で固定された状態に ある混合溶液 D〜Fに対し、比較例 1におレ、て用意したフェリシアン化カリウム水溶液 、ジァホラーゼ溶液および NADP水溶液を、 lMのTris— HCl (pH9) 5 μ Lに混合し て得た溶液 13. 7 i Lを添加し、さらにアルカリホスファターゼ標識 CRP抗体溶液 10 Ο / Lを添加することにより反応溶液を調製した。反応溶液は、アルカリホスファタ一 ゼ標識 CRP抗体の濃度力 0M、 0. 083nM、 0. 415nM、 0. 830nMとなるように 複数種を調製した。
[0045] 反応溶液を 30°Cで 10分間インキュベートした後、 400mVの定電圧を反応溶液に 印加する、定電位測定を実施した。図 7は、反応溶液中のアルカリホスファターゼ標 識 CRP抗体濃度と、電圧印加直後にそれぞれの反応溶液にぉレ、て流れた電流値と の関係を示すグラフである。図 7に示すように、基板上に固定された混合溶液 Dおよ び Fを用いて調製した反応溶液では、アルカリホスファターゼ標識 CRP抗体濃度と電 流値との間には高い相関関係が認められ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性が維持さ れていた。基板上に固定された混合溶液 Eを用いて調製した反応溶液では、基板上 に固定された混合溶液 Dおよび Fを用いた場合と比べると、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ の活性が低下していた。
[0046] 以上のとおり、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロール溶液に、リンゴ酸カ リウムおよびリンゴ酸ナトリウムに代表されるリンゴ酸塩を添加した混合溶液を用いるこ とにより、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを、失活を防止しつつ基板上に強固に固定できる 。また、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロール溶液にリンゴ酸を添加した 混合溶液を用いることによつても、酵素活性が低下する場合はあるものの、リンゴ酸 デヒドロゲナーゼを基板上に強固に固定できる。
産業上の利用可能性
本発明は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼのグリセロール溶液を用いながらも、リンゴ酸デ ヒドロゲナーゼを基板上に固定する方法を提供するものとして、チップ型のバイオセ ンサによる免疫測定法の実施が要求される各分野において多大な利用価値を有す る。

Claims

請求の範囲
[1] リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有するグリセロールにリンゴ酸およびリンゴ酸塩から選 ばれる少なくとも 1種を添加することにより得た混合溶液を、基板上に配置し、乾燥さ せることによって、前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼを前記基板上に固定する、リンゴ酸 デヒドロゲナーゼを基板上に固定する方法。
[2] 前記リンゴ酸塩力 リンゴ酸カリウムおよびリンゴ酸ナトリウムから選ばれる少なくとも
1種を含む、請求項 1に記載の方法。
[3] 前記混合溶液を、前記グリセロールに前記リンゴ酸塩を添加することにより得る、請 求項 1に記載の方法。
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