BRPI0611251A2

BRPI0611251A2 - composição, métodos para estabilizar uma composição compreendendo il-21, para redobrar il-21 não dobrada ou parcialmente dobrada em solução, para purificar il-21 e para tratar cáncer, e, uso de il-21 e sulfato

Info

Publication number: BRPI0611251A2
Application number: BRPI0611251-0A
Authority: BR
Inventors: Malin Persson; Jens Thostrup Bukrinsky
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 2005-06-06
Filing date: 2006-06-06
Publication date: 2010-12-07
Also published as: RU2011103126A; WO2006131515A2; CN101189024A; WO2006131515A3; MX2007015039A; RU2007144057A; AU2006256802A1; JP2008542430A; EP1890723A2; KR20080019025A; US20090047239A1; RU2420308C2; CA2611200A1

Abstract

COMPOSIçãO, MéTODOS PARA ESTABILIZAR UMA COMPOSIçãO COMPREENDENDO IL-21, PARA REDOBRAR IL-21 NãO DOBRADA OU PARCIALMENTE DOBRADA EM SOLUçãO, PARA PURIFICAR IL-21 E PARA TRATAR CáNCER, E, USO DE IL-21 E SULFATO. São fornecidas composições compreendendo IL-2 1 e sulfato.

Description

"COMPOSIÇÃO, MÉTODOS PARA ESTABILIZAR UMA COMPOSIÇÃOCOMPREENDENDO IL-21, PARA REDOBRAR IL-21 NÃO DOBRADAOU PARCIALMENTE DOBRADA EM SOLUÇÃO, PARA PURIFICARIL-21 E PARA TRATAR CÂNCER, E, USO DE IL-21 E SULFATO"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a composições, por exemplocomposições farmacêuticas compreendendo IL-21 e sulfato, e a métodos deestabilizar IL-21, o método compreendendo adicionar sulfato a uma soluçãocompreendendo dito peptídeo.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

IL-21 foi descrita primeiramente em WO 00153761. O pró-peptídeo é um peptídeo de 162 resíduos de aminoácidos, a seqüência do qualé descrita como SEQ ID No: 2 em dito pedido. Para conveniência, aseqüência é repetida neste pedido como SEQ ID No: 1. Inicialmente seacreditava que o peptídeo maduro fosse o peptídeo consistindo deaminoácidos no 32 a 162 de SEQ ID No: 1, entretanto mais recentemente(WO 04/112703) foi sugerido que o peptídeo maduro é, de fato, aminoácidosno 30 a 162.

IL-21 é uma citocina capaz de ativar células B, células T, ecélulas NK, e IL-21 e variantes e análogos desta foram sugeridos comoterapêuticos efetivos para tratar várias formas de câncer, WO 00/53761 e WO03/103589.

Peptídeos normalmente não são estáveis em forma líquida porperíodos prolongados de tempo, e muita pesquisa é investida para fornecerformulações de peptídeos farmacêuticos que satisfaçam o requerimento deestabilidade para composições farmacêuticas. O fornecimento de peptídeoscompreendendo composições farmacêuticas estáveis não é trivial, e assimpermanece como um desafio encontrar maneiras de fornecer formulaçõesestáveis compreendendo IL-21. A presente invenção objetiva fornecer taisformulações ou composições estáveis como propriedades alternativas oumelhoradas.

WO 04/112703 descreve que por exemplo aminoácidos 30 a162 de SEQ ID No: 1 podem ser isolados por métodos compreendendoprecipitar o peptídeo com altas concentrações de sulfato de amônio.

WO 04/055168 descreve que células transfectadas com umvetor compreendendo um polinucleotídeo codificando aminoácidos no 30 a162 de SEQ ID No: 1 com uma Met N-terminal adicional podem serfermentadas em um meio compreendendo sulfato de amônio.

Pedido Internacional W02004DK000686 (publicado comoWO 05/35565 descreve o uso de sulfato de cobre como catalisador em umareação entre um PEG funcionalizado e uma IL-21 funcionalizada parafornecer uma IL-21 PEGuilada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes requerentes surpreendentemente encontraram quea presença de íons de sulfato (S0.4 ") estabiliza a estrutura de IL-21 e aumentaa estabilidade de composições compreendendo IL-21. Por conseguinte, emuma forma de realização, a presente invenção fornece uma composição, e emparticular uma composição farmacêutica compreendendo IL-21 e íons desulfato, contanto que nenhum íon de amônio (NH4) esteja presente em ditacomposição em uma quantidade molar que é duas vezes a quantidade molarde sulfato.

Em uma forma de realização, a invenção fornece umacomposição, e em particular uma composição farmacêutica compreendendoIL-21 e íons de sulfato, contanto que nenhum íon de amônio (NH4+) estejapresente em dita composição em uma quantidade molar que é duas vezes aquantidade molar de sulfato, e contanto que a composição não compreendacobre.

Em uma forma de realização, a invenção fornece um métodode estabilizar uma composição compreendendo IL-21, o métodocompreendendo adicionar sulfato a dita composição.

Em uma forma de realização, a invenção fornece um métodode dobrar ou re-dobrar IL-21, o método compreendendo adicionar sulfato aIL-21 não dobrada ou parcialmente dobrada.

Em uma forma de realização, a invenção fornece um métodode purificar IL-21, o método compreendendo colocar em contato materialcromatográfico com uma composição compreendendo IL-21 e sulfato.

Em uma forma de realização, a invenção fornece um métodode cristalizar IL-21, o método compreendendo adicionar sulfato a umacomposição compreendendo IL-21.

Em uma forma de realização, a presente invenção se refere aum método terapêutico, o método compreendendo a administração de umaquantidade eficaz de uma composição farmacêutica da presente invenção aum paciente com necessidade desta.

Em uma forma de realização, a presente invenção se refere aouso de IL-21 e sulfato na preparação de um medicamento.

Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umacomposição farmacêutica compreendendo IL-21 e íons de sulfato.

LEGENDAS PARA FIGURAS

Figura 1: l-Anilinonaftaleno-8-ácido sulfônico (ANS) seligando a IL-21 em pH diferente. Todas as amostras continham 0,05 mg/ml(3,2 μΜ) de IL-21, 10 mM de tampão (cujo tampão e pH é mostrado nafigura) e quando indicado, 50 mM de Na2S04. 16 uM de ANS foi adicionadologo antes de medida.

Figura 2: Espectros de CD de UV longo de IL-21 em pH 2,0em tampão fosfato com e sem 50 mM de sulfato adicionado. Concentraçãoprotéica 10 mg/ml.

Figura 3A: Espectros de CD de UV longo de IL-21 em pH 5,3em tampão histidina com e sem 50 mM de sulfato adicionado. Concentraçãoprotéica 10 mg/ml.

Figura 3B: Espectros de CD de UV longo de IL-21 em pH 5,3em tampão acetato com e sem 50 mM de sulfato adicionado, Concentraçãoprotéica 10 mg/ml.

Figura 4: Espectros de CD de UV longo de IL-21 em pH 6,0em tampão fosfato com e sem 50 mM de sulfato adicionado. Concentraçãoprotéica 10 mg/ml.

Figura 5: Espectros de CD de UV longo de IL-21 em pH 2,0 a6,0 sem sulfato adicionado. Concentração protéica é 10 mg/ml.

Figura 6: Espectros de CD de UV longo de IL-21 em pH 2,0 a6,0 com 50 mM de sulfato adicionado. Concentração protéica é 10 mg/ml.

Figura 7: Espectros de CD de UV curto de IL-21 em pH 2,0em tampão fosfato com e sem 50 mM de sulfato adicionado. Concentraçãoprotéica 10 mg/ml.

Figura 8A: Espectros de CD de UV curto de IL-21 em pH 5,3em tampão histidina com e sem 50 mM de sulfato adicionado. Concentraçãoprotéica 10 mg/ml.

Figura 8B: Espectros de CD de UV curto de IL-21 em pH 5,3em tampão acetato com e sem 50 mM de sulfato adicionado. Concentraçãoprotéica 10 mg/ml.

Figura 9: Espectros de CD de UV curto de IL-21 em pH 6,0em tampão fosfato com e sem 50 mM de sulfato adicionado. Concentraçãoprotéica 10 mg/ml.

Figura 10: DSC capilar de IL-21 em pH 5,3 em tampãohistidina com e sem 50 mM de sulfato de Na.

Figura 11: Os dados de tabela 1 representados em um gráfico.

Figura 12: Espectros de CD de UV curto de IL-21 em pH 2 emtampões fosfato, sulfato, acetato e formiato em 50 mM. Concentraçãoprotéica 2 mg/ml.

DEFINIÇÕES

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um peptídeocomo usado neste lugar significa uma quantidade suficiente para curar, aliviarou interromper parcialmente as manifestações clínicas de uma dada doença esuas complicações. Uma quantidade adequada para realizar isto é definidacomo "quantidade terapeuticamente eficaz". Quantidades eficazes para cadapropósito irão depender do tipo e severidade da doença ou injúria assim comodo peso e estado geral do sujeito. Será entendido que determinar umadosagem apropriada pode ser atingido usando experimentação de rotina,construindo uma matriz de valores e testando diferentes pontos na matriz, oque está tudo dentro dos versos habituais de um médico ou veterináriotreinado.

O termo "tratamento" e "tratar" como usado neste lugarsignifica o manejo e cuidado de um paciente para o propósito de combateruma condição, tal como uma doença ou uma desordem. O termo é pretendidopara incluir o espectro completo de tratamentos para uma dada condição daqual o paciente está sofrendo, tal como administração do composto ativo paraaliviar os sintomas ou complicações, para atrasar a progressão da doença,desordem ou condição, para aliviar ou reduzir os sintomas e complicações,e/ou para curar ou eliminar a doença, desordem ou condição assim como paraprevenir a condição, caracterizado pelo fato de que prevenção é para serentendida como o manejo e cuidado de um paciente para o propósito decombater a doença, condição, ou desordem e inclui a administração dospeptídeos ativos para prevenir o início dos sintomas ou complicações. Opaciente a ser tratado é preferivelmente um mamífero, em particular um serhumano, mas ele também pode incluir animais, tal como cachorros, gatos,vacas, ovelhas e porcos. E para ser entendido, que regimes terapêuticos eprofiláticos (preventivos) representam aspectos separados da presenteinvenção.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Neste contexto, IL-21 é pretendida para indicar

a) um peptídeo com uma seqüência como definido em SEQID No: 1;

b) um peptídeo com uma seqüência definida por aminoácidosno 32-162 de SEQ ID No: 1;

c) um peptídeo com uma seqüência definida por aminoácidosno 30-162 de SEQ ID No: 1; ou

d) uma variante de qualquer de a), b) e c).

Uma variante é entendida como sendo o composto obtidosubstituindo um ou mais resíduos de aminoácidos na seqüência de IL-21 poroutro aminoácido natural ou não natural; e/ou adicionando um ou maisaminoácidos naturais ou não naturais à seqüência de IL-21; e/ou deletando umou mais resíduos de aminoácidos da seqüência de IL-21, caracterizado pelofato de que qualquer uma destas etapas pode ser opcionalmente seguida porderivatização adicional de um ou mais resíduos de aminoácidos. Emparticular, tais substituições são conservativas no sentido de que um resíduode aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido do mesmogrupo, isto é por outro resíduo de aminoácido com propriedades similares.Aminoácidos podem ser convenientemente divididos nos seguintes gruposbaseado em suas propriedades: Aminoácidos básicos (tal como arginina elisina), aminoácidos ácidos (tal como ácido glutâmico e ácido aspártico),aminoácidos polares (tal como glutamina, cisteína, histidina e asparagina),aminoácidos hidrofóbicos (tal como leucina, isoleucina, prolina, metionina evalina), aminoácidos aromáticos (tal como fenilalanina, triptofano, tirosina) eaminoácidos pequenos (tal como glicina, alanina, serina e treonina.).

Em uma forma de realização, dita variante tem pelo menos80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelomenos 95% de identidade com a), b) ou c). Em particular, ditas variantes têmpelo menos 20%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 60%, talcomo pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%da atividade de a), b), ou c) quando determinada em ensaio I neste lugar.

O termo "identidade" como conhecido na técnica, se refere auma relação entre as seqüências de dois ou mais peptídeos, se determinadocomparando as seqüências. Na técnica, "identidade" também significa o graude parentesco de seqüências entre peptídeos, se determinado pelo número derepetições entre fitas de dois ou mais resíduos de aminoácidos. "Identidade"mede o percentual de repetições idênticas entre a menor de duas ou maisseqüências com alinhamentos de lacuna (se qualquer) destinados por ummodelo matemático particular ou programa de computador (isto é,"algoritmos"). Identidade de proteínas relacionadas pode ser prontamentecalculada por métodos conhecidos. Tais métodos incluem, mas não sãolimitados a, aqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, NewYork, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., andGriffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis inMolecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; SequenceAnalysis Primer, Gribskoν, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press,New York, 1991; e Carib et al., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).

Métodos preferidos para determinar identidade são projetadospara gerar a maior repetição entre as seqüências testadas. Métodos paradeterminar identidade são descritos em programas de computadorpublicamente disponíveis. Métodos preferidos de programa de computadorpara determinar identidade entre duas seqüências incluem o pacote doprograma GCG, incluindo GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387(1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.),BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)). O programa BLASTX é publicamente disponível a partir do NationalCenter for Biotechnology information (NCB!) e outras fontes (BLASTManual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al.,acima). O bem conhecido algoritmo de Smith Waterman também pode serusado para determinar identidade.

Por exemplo, usando o algoritmo computacional GAP(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), duasproteínas para as quais a identidade de seqüência percentual deve serdeterminada são alinhadas para repetição ótima de seus respectivosaminoácidos (a "dimensão idêntica", como determinado pelo algoritmo). Umapenalidade de abertura de lacuna (que é calculada como 3 vezes a diagonalmédia; a "diagonal média" é a media da diagonal da matriz de comparaçãosendo usada; a "diagonal" é o escore ou número assinalado a cada repetiçãoperfeita de aminoácidos pela matriz de comparação particular) e umapenalidade de extensão de lacuna (que normalmente é (fração (1110)) vezes apenalidade de abertura de lacuna), assim como uma matriz de comparação talcomo PAM 250 ou BLOSUM 62 são usadas em conjunção com o algoritmo.Uma matriz de comparação padrão (veja Dayhoff et al., Atlas of ProteinSequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978) para a matriz de comparaçãoPAM 250; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919(1992) para a matriz de comparação BLOSUM 62) também é usada peloalgoritmo.

Parâmetros preferidos para uma comparação de seqüênciasprotéicas incluem os seguintes:

Algoritmo: Needleman et al., J. Mal. Biol, 48:443-453 (1970);Matriz de comparação:

BLOSUM 62 de Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA,89:10915-10919 (1992); Penalidade de Lacuna: 12, Penalidade deComprimento de Lacuna: 4, Limite de Similaridade: 0.

O programa GAP é útil com os parâmetros acima. Osparâmetros mencionados acima são os parâmetros padrão para comparaçõesde peptídeos (junto com nenhuma penalidade para lacunas de extremidade)usando o algoritmo GAP.

Em uma forma de realização, a variante é obtida adicionandoaté cinco aminoácidos, tal como um, dois, três, quatro ou cinco, a qualquerdas seqüências a), b) e c) acima, e em particular ao N-terminal. Mençãoparticular é feita de c) (isto é aminoácidos 30-162 de SEQ ID No: 1) com umaMet adicional adicionada ao N-terminal, SEQ ID No: 2.

A invenção também abrange composições da presenteinvenção compreendendo as variantes de IL-21 discutidas acima que foramadicionalmente derivadas, por exemplo pela ligação covalente de PEG ou umsubstituinte lipofílico, por exemplo como descrito em WO 05/035565.

Em uma forma de realização, as composições da presenteinvenção não compreendem amônio em uma quantidade molar que é duasvezes a quantidade molar de sulfatos. Como amônio é um ácido, a quantidadedele irá depender do pH da solução; em pH alto o amônio estará presentecomo amônia (NH3). E para ser entendido que no presente contexto aquantidade de amônio deve ser calculada como a quantidade total de amônia eamônio. De uma maneira similar, a quantidade de sulfato é dependente do pH.Em pH baixo, sulfato está presente na forma protonada, HSO4". É para serentendido que no presente contexto, a quantidade de sulfato deve sercalculada como a quantidade total de sulfato e da forma protonada.

Em uma forma de realização da invenção, as composições dapresente invenção não compreendem amônio. É entendido que isto épretendido para significar que as composições da presente invenção nãocompreendem cobre acima do nível de quantidade traço.

O íon de sulfato usado na presente invenção pode em princípiovir de qualquer sal de sulfato. Certas áreas ou indústrias podem, como se sabe,ter requerimentos especiais para ditos sais que também têm que ser satisfeitos.Como um exemplo, a indústria farmacêutica pode requerer que o sal desulfato seja um sal farmaceuticamente aceitável. Sais de sulfatofarmaceuticamente aceitáveis incluem sais metálicos, tal como sulfato de lítio,sódio, zinco, cálcio, potássio, e magnésio, e sais de amônio alquilados, talcomo sulfato de metil amônio, dimetil amônio, trimetil amônio, etil amônio,trietil amônio, hidroxietil amônio, dietil amônio, butil amônio, e tetrametilamônio. Alguns dos sais mencionados acima existem em mais do que umaforma compreendendo diferentes quantidades de cristal-água. Qualquer destasformas pode ser usada na presente invenção, e menção particular é feita desulfato de sódio.

Em uma forma de realização, uma composição da presenteinvenção não compreende cobre. E entendido que isto é pretendido parasignificar que as composições da presente invenção não compreendem cobreacima do nível de quantidade traço

Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umacomposição farmacêutica compreendendo IL-21 e sulfato.

Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umacomposição farmacêutica compreendendo IL-21 e sulfato, com a condição deque amônia não esteja presente em uma quantidade molar que é duas vezes aquantidade molar de sulfato.

Em uma forma de realização, a presente invenção fornece umacomposição farmacêutica compreendendo IL-21 e sulfato, com a condição deque amônia não esteja presente em uma quantidade molar que é duas vezes aquantidade molar de sulfato, e com a condição adicional de que a composiçãonão compreenda cobre. Além de IL-21 e sulfato, dita composiçãofarmacêutica também pode compreender outros excipientes conhecidos natécnica, tal como tampões, conservantes, agentes isotônicos, agentesquelantes, estabilizantes, uma base de aminoácido suficiente para diminuirformação de agregado pela proteína durante armazenamento da composição,tensoativos, agentes umectantes, emulsificantes, antioxidantes, agentes dediluição, íons metálicos, veículos oleaginosos, proteínas (por exemplo,albumina no soro humano, gelatina ou proteínas) e uns zwitteríons. Usodestes excipientes é bem conhecido pela pessoa versada na técnica e descritoem por exemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20aedição, 2000.

Em uma forma de realização, as composições farmacêuticas dapresente invenção não compreendem amônio. E entendido que isto épretendido para significar que as composições da presente invenção nãocompreendem cobre acima do nível de quantidade traço.

Uma composição farmacêutica da presente invenção pode seradministrada em diversas formas de dosagem, tal como por exemplo soluções,suspensões, emulsões, microemulsões, emulsão múltipla, espumas,ungüentos, pastas, emplastros, pomadas, comprimidos, comprimidosrevestidos, enxágües, cápsulas, por exemplo, cápsulas duras de gelatina ecápsulas macias de gelatina, supositórios, cápsulas retais, gotas, géis, líquidospulverizáveis, pó, por exemplo pó liofilizado, aerossóis, inalantes, gotasoculares, pomadas oftálmicas, enxágües oftálmicos, pessários vaginais, anéisvaginais, pomadas vaginais, solução de injeção, soluções transformantes insitu, por exemplo geleificação in situ, configuração in situ, precipitação insitu, cristalização in situ, solução de infusão, e implantes.

A composição farmacêutica da presente invenção pode seradministrada através de diversas vias de administração, por exemplo, lingual,sublingual, bucal, na boca, oral, no estômago e intestino, nasal, pulmonar, porexemplo, através dos bronquíolos e alvéolos ou uma combinação destes,epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, retal, ocular, por exemplosatravés da conjuntiva, uretral, e parenteral a pacientes com necessidade de umtal tratamento. Administração parenteral pode ser realizada por injeçãosubcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa por meio de umaseringa, opcionalmente uma seringa tipo caneta. Alternativamente,administração parenteral pode ser realizada por meio de uma bomba deinfusão. Uma opção adicional é uma composição da presente invenção quepode ser uma solução ou suspensão para administração na forma de umlíquido pulverizável nasal ou pulmonar. Como uma opção ainda adicional, ascomposições farmacêuticas da presente invenção também podem seradaptadas para administração transdérmica, por exemplo por uma injeçãolivre de agulha ou a partir de um esparadrapo, opcionalmente um esparadrapoiontoforético, ou transmucosal, por exemplo administração bucal.

Nas composições farmacêuticas da presente invençãocompreendendo IL-21 e sulfato, IL-21 pode estar presente em quantidades deaté 500 mg/ml. Em particular, IL-21 pode estar presente em concentrações deou até 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg/ml. IL-21 é estabilizadaem concentrações de sulfato acima de 1 mM, tal como acima de 5 mM, talcomo acima de 7 mM, tal como acima de 10 mM, tal como acima de 20 mM.De fato, até 500 mM, tal como até 150 mM, tal como até 75 mM, tal como até50 mM de sulfato pode estar presente. O limite superior da concentração desulfato é ditado pela solubilidade do sal de sulfato escolhido. Em muitasaplicações da presente invenção, é desejável ter uma composiçãofarmacêutica que é isotônica, ou perto de isotônica. Em uma forma derealização, a composição farmacêutica é de 20% isotônica a 120% isotônica.

Em uma forma de realização, a concentração de sulfato é decerca de 1 a cerca de 100 mM. Em uma forma de realização, a concentraçãode sulfato é de cerca de 20 a cerca de 100 mM. Em formas de realizaçãoadicionais, a concentração de sulfato é selecionada a partir do grupoconsistindo de cerca de 1 mM, cerca de 5 mM, cerca de 10 mM, cerca de 15mM, cerca de 20 mM, cerca de 25 mM, cerca de 30 mM, cerca de 35 mM,cerca de 40 mM, cerca de 45 mM, cerca de 50 mM, cerca de 55 mM, cerca de60 mM, cerca de 65 mM, cerca de 70 mM, cerca de 75 mM, cerca de 80 mM,cerca de 85 mM, cerca de 90 mM, cerca de 95 mM, e cerca de 100 mM.

Uma composição farmacêutica da invenção por exemplotambém pode ser não isotônica e pode ser pretendido torná-la isotônica, porexemplo por diluição, antes de administração. Isto pode possibilitar a vendade composições farmacêuticas mais concentradas, que são então tornadasisotônicas por exemplo pelo médico ou pelo paciente antes de administração.

Em uma forma de realização da invenção cloreto é adicionadoàs composições da presente invenção. Em particular, até 150 mM de cloretopode ser adicionado.

O pH das composições farmacêuticas da presente invenção épreferivelmente entre 2 e 8, e menção particular é feita de composiçõesfarmacêuticas com pH entre 4 e 6, tal como por exemplo 5,3.

Um exemplo de uma invenção da presente invenção consistede 10 mg/ml do peptídeo definido por SEQ ID No: 2, 10 mM de Na2SO4,tamponado com histidina em pH 5,3.

O impacto de um excipiente particular na estabilidade decomposições farmacêuticas é tipicamente verificado preparando umacomposição de teste (in casu uma composição da presente invenção) e umacomposição de referência (in casu a mesma composição mas sem sulfato). Asduas composições são então armazenadas em condições controladas, porexemplo 2 semanas a 40°C, 2 meses a 25°C ou 6 meses a 5C. Depois dearmazenamento, a atividade residual do peptídeo de interesse nas duascomposições são medidas em um ensaio adequado. Para composiçãocompreendendo IL-21, o ensaio de agregação descrito em exemplo 11 nestelugar pode ser usado. Outros ensaios medindo a quantidade/atividade de IL-21 ou produtos de degradação também podem ser aplicados.

Uma forma de realização da presente invenção se refere ao usode sulfato para promover dobramento ou re-dobramento de IL-21 a partir deIL-21 não dobrada ou parcialmente não dobrada. Em particular, adição deíons de sulfato pode aumentar a velocidade de dobramento ou segurardobramento correto. Se IL-21 é produzida por fermentação demicroorganismos particulares que não são capazes de dobrar os peptídeoscorretamente, os peptídeos podem ser expressos em corpos de exclusãocompreendendo peptídeo não dobrado ou parcialmente não dobrado. Depoisde interrupção de ditos corpos de inclusão, o peptídeo dobrado corretamentepode ser obtido em processos incluindo a adição de íons de sulfato.

A presença de íons de sulfato afeta uma estrutura maiscompacta e estável de IL-21. Isto pode ser explorado em purificaçãocromatográfica de IL-21 para mudar o perfil de eluição cromatográfica dopeptídeo, e em particular para gerar um pico de eluição mais pronunciado emais bem definido. Os efeitos benéficos de adicionar sulfato podem ser vistosem diferentes tipos de cromatografia, tal como cromatografia de troca iônica(cromatografia de troca catiônica e cromatografia de troca aniônica) ecromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de exclusão portamanho. Um pico de eluição mais pronunciado é vantajoso em situaçõesonde separação para um pico de eluição fechado é desejada, mas também emgeral à medida que o peptídeo eluidor é então coletado em um volume menoro que possibilita separação adicional mais simples e mais barata. De acordocom a invenção, sulfato está presente em pelo menos cerca de 3 mM, tal comopelo menos cerca de 7, tal como pelo menos cerca de 10 mM. De fato, éantecipado que apenas a solubilidade do sal de sulfato aplicado define umlimite superior para a concentração de sulfato. Menção particular é feita desulfato de sódio como a fonte de sulfato.

O pH dos processos cromatográficos da presente invençãopode ser de 1 a 10, tal como de 2 a 9, tal como de 3 a 8, tal como de 4 a 7, talcomo de 5 a 6.Muitos materiais cromatográficos diferentes são conhecidos natécnica, e exemplos incluem material de cromatografia de troca aniônica,material de cromatografia de troca catiônica, material de interação hidrofóbicae material de cromatografia de exclusão por tamanho.

Uma estrutura mais bem definida é mais fácil de cristalizar, e apresente invenção portanto também fornece o uso de sulfato para melhorarcristalização de IL-21. Neste contexto, "melhora" pode ser o aumento davelocidade de cristalização, ou o fornecimento de cristais que são maisadequados para por exemplo estudos de difração de raio-X.

IL-21 foi sugerida no tratamento de vários cânceres oudoenças ou desordens neoplásicas. Em uma forma de realização, a presenteinvenção se refere a um método de tratar câncer, o método compreendendo aadministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composiçãoda presente invenção compreendendo IL-21 e sulfato a um paciente comnecessidade desta. Menção particular é feita de melanoma malignometastático, carcinoma de célula renal, câncer ovariano, câncer de pulmão decélula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena, câncer de mama,câncer colorretal, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de bexiga,câncer esofágico, câncer cervical, câncer endometrial, linfoma, e leucemia.

Em aspectos mais específicos da invenção, os termos"desordens neoplásicas", "câncer" são para serem entendidos como sereferindo a todas as formas de crescimento celular neoplásico, incluindo tantotumores císticos como sólidos, tumores de osso e tecido mole, incluindo tantotumores benignos como malignos, incluindo tumores em tecido anal, dutobiliar, bexiga, células sangüíneas, osso, osso (secundário), intestino (cólon &reto), cérebro, cérebro (secundário), mama, mama (secundário), carcinóide,cérvice, cânceres infantis, olho, garganta (esôfago), cabeça & pescoço,sarcoma de Kaposi, rim, laringe, leucemia (linfoblástica aguda), leucemia(mielóide aguda), leucemia (linfocítica crônica), leucemia (mielóide crônica),leucemia (outra), fígado, fígado (secundário), pulmão, pulmão (secundário),linfonodos (secundário), linfoma (de hodgkin), linfoma (não hodgkin),melanoma, mesotelioma, mieloma, ovário, pâncreas, pênis, próstata, pele,sarcomas de tecido mole, estômago, testículos, tireóide, tumor primáriodesconhecido, vagina, vulva, ventre (útero).

Tumores de tecido mole incluem Monossomia deSchwannoma Benigno, tumor Desmóide, Lipoblastoma, Lipoma, leiomiomaUterino, sarcoma de célula clara, Dermatofibrosarcoma, sarcoma de Ewing,condrosarcoma mixóide extraesquelético, Liposarcoma mixóide,Liposarcoma, bem diferenciado, rabdomiosarcoma Alveolar, e sarcomaSinovial.

Tumores ósseos específicos incluem Fibroma não ossificante,Cisto ósseo unicameral, Encondroma, Cisto ósseo aneurismal, Osteoblastoma,Condroblastoma, Condromixofibroma, Fibroma ossificante e Adamantinoma,Tumor de célula gigante, Displasia fibrosa, Sarcoma de Ewing, GranulomaEosinofílico, Osteosarcoma, Condroma, Condrosarcoma, HistiocitomaFibroso Maligno, e Carcinoma Metastático.

Leucemias se referem a cânceres das células brancas dosangue que são produzidas pela medula óssea. Isto inclui mas não é limitadoaos quatro tipos principais de leucemia; linfoblástica aguda (ALL),mieloblástica aguda (AML), linfocítica crônica (CLL) e mielóide crônica(CML).

Além disso IL-21 pode ser usada terapeuticamente emcânceres de vários estágios não metastáticos assim como metastáticos talcomo "Estágio 1" Localizado (confinado ao órgão de origem); "Estágio 2"Regional; "Estágio 3" Extensivo; e "Estágio 4" cânceres amplamentedisseminados.

IL-21 também foi implicada no tratamento de infecções virais,tal como Vírus da Hepatite B, Vírus da Hepatite C, Vírus da ImunodeficiênciaHumana, Vírus Respiratório Sincial, Vírus Eppstein-Barr, Vírus da Influenza,Citomegalovírus, Vírus do Herpes e Síndrome Respiratória Aguda Severa.

Em uma forma de realização, a presente invenção se refere aouso de IL-21 e sulfato na fabricação de um medicamento para o tratamento decâncer. Menção particular é feita de cânceres da lista acima.

Todas as referências, incluindo publicações, pedidos depatente, e patentes, citados neste lugar são neste lugar incorporados porreferência em sua totalidade e no mesmo grau como se cada referência fosseindividualmente e especificamente indicada para ser incorporada porreferência e foram descritos em sua totalidade neste lugar (até o grau máximopermitido por lei), independente de qualquer incorporação fornecidaseparadamente de documentos particulares feita em outra parte neste lugar.

O uso dos termos "um" e "uma" e "o/a" e referentes similaresno contexto de descrever a invenção são para serem construídos para cobrirtanto o singular como o plural, a menos que de outra maneira indicado nestelugar ou claramente contradito por contexto. Por exemplo, a frase "ocomposto" é para ser entendida como se referindo a vários "compostos" dainvenção ou aspecto particular descrito, a menos que de outra maneiraindicado.

A menos que de outra maneira indicado, todos os valoresexatos fornecidos neste lugar são representativos de valores aproximadoscorrespondentes (por exemplo, todos os valores exatos exemplares fornecidoscom respeito a um fator ou medida particular podem ser considerados comotambém fornecendo uma medida aproximada correspondente, modificada por"cerca de," onde apropriado).

A descrição neste lugar de qualquer aspecto ou aspecto dainvenção usando termos tal como "compreendendo", "tendo," "incluindo," ou"contendo" com referência a um elemento ou elementos é pretendida parafornecer suporte para um aspecto ou aspecto da invenção similar que"consiste de", "consiste essencialmente de", ou "compreendesubstancialmente" aquele elemento ou elementos particulares, a menos que deoutra maneira determinado ou claramente contradito por contexto (porexemplo, uma composição descrita neste lugar como compreendendo umelemento particular deve ser entendida como também descrevendo umacomposição consistindo daquele elemento, a menos que de outra maneiradeterminado ou claramente contradito por contexto).

ENSAIO 1

Atividade de IL-21 pode ser analisada em um bioensaio celularempregando umas células Baf3 murinas, estavelmente transfectadas paraexpressar a IL-21 R humana e um construto repórter de luciferase ligada aStat. As células Baf3 expressam endogenamente o componente gc docomplexo ativo de receptor de IL-21. A linhagem celular BaO/repórter dehIL-21R foi subalimentada em meio livre de IL-3 por 18 horas antes deestimulação. Uma curva dose-resposta pode ser obtida usando uma variaçãode concentrações da proteína IL-21 para calcular uma concentração IC50. Ascélulas BaB são descritas em Palacios R, Nature. 309(5964), 126-31 (1984) eestão disponíveis a parir do Banco de Células em RIKEN BioResource Center(http://www2.brc.riken.jp/lab/cell/detail.cgi7cell_no.RCB0805).

EXEMPLOS

Nos exemplos seguintes, "IL-21" é pretendido ser o peptídeoidentificado por SEQ ID No:2.

Exemplo 1

Fluorescência de ANS

ANS (l-anilinonaftaleno-8-ácido sulfônico) se liga a sítioshidrofóbicos em proteínas. Uma intensidade de fluorescência mais forteindica que mais moléculas de ANS estão ligadas à proteína. Isto novamente éindicativo de uma molécula menos estruturada pois uma proteína menosestruturada irá expor mais sítios hidrofóbicos. Uma intensidade defluorescência mais fraca é indicativa de uma estrutura protéica mais compactaque expõe menos sítios hidrofóbicos nos quais ANS pode se ligar.

Todas as amostras continham 0,05 mg/ml (3,2 uM) de IL-21,10 mM de tampão (cujo tampão e pH é mostrado na figura) e quandoindicado, 50 mM de Na2SO^ 16 μΜ de ANS foi adicionado logo antes demensuração.

Espectros de fluorescência de ANS foram registrados em umEspectrofotômetro de Fluorescência Varian Cary Eclipse equipado com célulatermostatizada (acessório Varian Cary Single cell Peltier). Configurações eperformance de Espectrofotômetro de Fluorescência são como segue:

Amostras são excitadas em 390 nm. Tanto fendas de excitaçãocomo emissão foram ajustadas para 5 nm e fotomultiplicador (PMT) etemperatura foram ajustados para "alto" e 20°C, respectivamente. Espectrosde emissão são coletados entre 400-700 nm. 3 espectros são coletados e médiatirada para cada amostra.

O comprimento de onda de emissão máxima (Amax) foiavaliado por cálculo de primeiro derivado do espectro de emissão depois desubtrair branco apropriado.

Os dados em Figura 1 mostram espectros de ANS para IL-21em pH diferente e em tampões diferentes. Os dados mostram claramente queIL-21 obtém uma estrutura mais compacta na medida em que pH éaumentado. Notavelmente, a adição de sulfato causa um aumento significantena firmeza da estrutura de IL-21. Portanto é concluído que sulfato estabiliza aestrutura de IL-21.

Exemplo 2

Dicroísmo circular (CD) de UV longo

Espectros de CD de UV longo de proteínas refletem aassimetria nas ligações peptídicas, o que por sua vez reflete a estruturasecundária da proteína. Espectros de UV longo de proteínas com conformaçãopredominantemente de α-hélice são caracterizados por dois mínimos distintosem 208 e 222 nm, por um pico positivo na região de 190-195 ran, e por umcruzamento da região negativa para a positiva acima de 172 nm. O efeito desulfato na estrutura secundária de IL-21 foi investigado em pH diferente.

Os espectros foram registrados em um espectropolarímetroJasco PTC-4238 ajustado com um controlador de temperatura. As varredurasmostradas representam uma média de três espectros obtidos coletando dadosem intervalos de 0,1 nm com um tempo de resposta de 4 s, e com uma taxa devarredura de 20 nm/min. Os espectros foram corrigidos para branco, e osespectros foram obtidos de 180 a 250 nm. Concentração protéica foi de 10mg/ml

Figura 2 mostra os espectros em pH 2 em tampão fosfato come sem sulfato. Em pH 2, sem sulfato, IL-21 existe em um equilíbrio entre a-hélice e dobramento aleatório. Entretanto, a adição de sulfato favorececlaramente a conformação α-hélice. Figuras 3 e 4 mostram que em particularem pH 5,3 mas também em pH 6,0, adição de sulfato aumenta o pico de 109—195 nm o que indica uma quantidade aumentada de estrutura α-hélice. Osresultados de figuras 2-4 também são apresentados em figuras 5 e 6, ondefigura 5 mostra os espectros de CD de UV longo de IL-21 em pH 2-6 semsulfato enquanto figura 6 mostra os espectros de CD de UV longo de IL-21 nomesmo intervalo de pH com sulfato adicionado. Em uma comparação defiguras 5 e 6 é evidente que a adição de sulfato torna a estrutura secundária deIL-21 mais uniforme por uma ampla variação de pH.

Portanto é concluído que adição de sulfato a composições deIL-21 aumenta o teor de α-hélice da estrutura de IL-21 por uma amplavariação de pH.

Exemplo 3

Dicroísmo circular (CD) de UV curtoCD de UV curto reflete a estrutura terciária de uma proteína.Quanto maior a amplitude dos espectros de UV curto, maior é a quantidade deestrutura terciária da proteína. Os espectros de UV curto de IL-21 foramobtidos em pH 2 a 6 em vários tampões com e sem a adição de sulfato.

Os espectros foram registrados em um espectropolarímetroJasco PTC-4238 ajustado com um controlador de temperatura. As varredurasmostradas representam uma média de três espectros obtidos coletando dadosem intervalos de o. 1 nm com um tempo de resposta de 4 s, e com uma taxa devarredura de 20 nm/min. Os espectros foram corrigidos para branco, e osespectros foram obtidos de 250 a 350 nm. Concentração protéica foi 10mg/ml, exceto para os experimentos mostrados em Fig 12, caracterizados pelofato de que a concentração protéica foi 2 mg/ml.

Figura 7 mostra espectros de CD de UV curto para IL-21 em10 mg/ml em pH 2 (tampão fosfato) com e sem a adição de 50 mM de sulfato.A figura mostra claramente que a adição de sulfato aumenta a quantidade deestrutura terciária de IL-21.

Figura 8A mostra espectros de CD de UV curto para IL-21 em10 mg/ml em pH 5,3 (tampão histidina) com e sem a adição de 50 mM desulfato. A figura mostra claramente que a adição de sulfato aumenta aquantidade de estrutura terciária de IL-21. Figura 8B mostra espectros de UVcurto para IL-21 em 10 mg/ml em pH 5,3 (tampão acetato) com e sem aadição de 50 mM de sulfato. A figura mostra claramente que a adição desulfato aumenta a quantidade de estrutura terciária de IL-21. E evidente apartir dos dados representados em figuras 8A e 8B que independente dotampão, a adição de sulfato resulta em um aumento na quantidade de estruturaterciária de IL-21.

Figura 9 mostra espectros de CD de UV curto para IL-21 em10 mg/ml em pH 6,0 (tampão fosfato) com e sem a adição de 50 mM desulfato. A figura mostra que existe um pequeno, mas significante aumento naquantidade de estrutura terciária de IL-21 neste pH.Figura 12 mostra espectros de CD de UV curto para IL-21 em2 mg/ml em pH em vários tampões. Os espectros de CD para o tampãocontendo sulfato são dramaticamente diferentes dos outros espectros com umamudança de um CD negativo fraco para um muito mais positivo.

Exemplo 4

Calorimetria diferencial de varredura (DSC)

Calorimetria diferencial de varredura mede o desdobramentoou temperatura de fusão de uma proteína. Um pico estreito bem definido éindicativo de uma estrutura compacta e definida e firmeza estrutural de umaproteína, ao passo que um pico largo é indicativo de uma estrutura maisfrouxa.

DSC capilar foi conduzida com um calorímetro Microcal VP-DSC. As amostras foram varridas de 10 a IlO0C, usando uma taxa devarredura a 3 °C/min. A amostra foi corrida com seu tampão individual comoreferência. Curvas de Tampão-Tampão de referência foram subtraídas dasvarreduras de amostras para conseguir o resultado final específico de amostra.As amostras continham 10 mg/ml de IL-21, 10 mM de histidina em pH 5,3, equando indicado, 50 mM de Na2SO4.

O resultado mostrado em figura 10 mostra que a adição desulfato a IL-21 resulta no aparecimento de um pico na DSCscan. Isto mostraque sulfato aumenta a firmeza estrutural de IL-21.

Exemplo 5

Preparação de uma formulação solúvel de IL-21 10 mg/ml em pH 5,3 comhistidina 10 mM

Uma solução de carga de IL-21 2.4%(w/v) foi combinada comuma solução de carga de histidina l,52%(w/v), pH da solução foi ajustadopara 5,3 com HCI e NaOH e água foi adicionada para diluir a formulação parao volume final. A formulação foi esterilizada por filtração usando um filtro de0,22 pm e assepticamente carregada em frascos esterilizados.Exemplo 6

Preparação de quatro formulações solúveis de IL-21 10 mg/ml em pH 5,3com histidina 10 mM e quantidades variadas de sulfato de sódio (3, 10, 50 e150 mM)

Uma solução de carga de IL-21 2,4%(w/v) foi combinada comuma solução de carga de histidina l,52%(w/v). Uma solução de carga desulfato de sódio 10,6%(w/v) foi adicionada. pH da solução foi ajustado para5,3 com HCI e NaOH e água foi adicionada para diluir a formulação para ovolume final. A formulação foi esterilizada por filtração usando um filtro de0,22 pm e assepticamente carregada em frascos esterilizados.

O procedimento foi repetido quatro vezes embora adicionandodiferentes quantidades da solução de carga de sulfato de sódio.

Exemplo 7

Preparação de uma formulação solúvel de IL-21 10 mg/ml em pH 5,3 commanitol 4,7%(w/v) e histidina 10 mM

Uma solução de carga de IL-21 2,4%(w/v) foi combinada comuma solução de carga de manitol 23,6%(w/v) e uma solução de carga dehistidina l,52%(w/v). pH da solução foi ajustado para 5,3 com HCI e NaOH eágua foi adicionada para diluir a formulação para o volume final. Aformulação foi esterilizada por filtração usando um filtro de 0,22 pm eassepticamente carregada em frascos esterilizados.

Exemplo 8

Preparação de formulações solúveis de IL-21 10 mg/ml em pH 5,3 commanitol 4,7%(w/v), histidina 10 mM e quantidades variadas de sulfato desódio (3, 10, 50 e 150 mM)

Uma solução de carga de IL-21 2,4%(w/v) foi combinada comuma solução de carga de manitol 23,6%(w/v) e uma solução de carga dehistidina l,52%(w/v). Uma solução de carga de sulfato de sódio 10,6%(w/v)foi adicionada. pH da solução foi ajustado para 5,3 com HCI e NaOH e águafoi adicionada para diluir a formulação para o volume final. A formulação foiesterilizada por filtração usando um filtro de 0,22 pm e assepticamentecarregada em frascos esterilizados.

Exemplo 9

Preparação de formulações solúveis de IL-21 10 mg/ml em pH 5,3 comhistidina 10 mM, sulfato de sódio 50 mM e várias quantidades de cloreto desódio (50 e 150 mM)

Uma solução de carga de IL-21 2,4%(w/v) foi combinada comuma solução de carga de histidina l,52%(w/v) e uma solução de carga decloreto de sódio 4,38%(w/v). Uma solução de carga de sulfato de sódio10,6%(w/v) foi adicionada. pH da solução foi ajustado para 5,3 com HCl eNaOH e água foi adicionada para diluir a formulação para o volume final. Aformulação foi esterilizada por filtração usando um filtro de 0,22 pm eassepticamente carregada em frascos esterilizados.

O procedimento foi repetido duas vezes embora adicionandodiferentes quantidades da solução de carga de cloreto de sódio.

Exemplo 10

Preparação de formulações solúveis de IL-21 10 mg/ml em pH 5,3 commanitol 4,7%(w/v), histidina 10 mM, sulfato de sódio 50 mM e váriasquantidades de cloreto de sódio (50 e 150 mM)

Uma solução de carga de IL-21 2,4%(w/v) foi combinada comuma solução de carga de manitol 23,6%(w/v), uma solução de carga dehistidina l,52%(w/v) e uma solução de carga de cloreto de sódio 4,38%(w/v).Uma solução de carga de sulfato de sódio 10,6%(w/v) foi adicionada. pH dasolução foi ajustado para 5,3 com HCI e NaOH e água foi adicionada paradiluir a formulação para o volume final. A formulação foi esterilizada porfiltração usando um filtro de 0,22 pm e assepticamente carregada em frascosesterilizados.

Exemplo 11

Estabilidade de armazenamento,

Os frascos contendo formulações de exemplo 5 a 11 foramcolocados em diferentes temperaturas: 37°C, 25°C, 15°C, 5°C e -20°C.Amostras para análise foram extraídas em vários momentos. O teor de"agregados" (incluindo dímeros covalentes e outras impurezas de alto pesomolecular) nas formulações de IL-21 foi determinado por HPLC de exclusãopor tamanho em uma coluna TSK. A porcentagem de agregados é baseada naárea total de picos eluindo antes do pico principal de IL-21, em relação à áreatotal dentro do volume incluído.

Resultados de amostras armazenadas por um mês a 37°C,normalizados usando a formulação em exemplo 5 (isto é a formulação de IL-21 sem sulfato ou manitol) como referência, são listados em Tabela 1. Osdados também são representados em figura 11.

Tabela 1 Formação normalizada de agregado depois de um mês a 37°C emformulações de IL-21 descritas em exemplos 5-10. A referência de Exemplo 5é ajustada para 100

<table>table see original document page 26</column></row><table>

Os dados de Tabela 1 (ou representados em figura 11)mostram que sulfato tem um efeito positivo na estabilidade dearmazenamento de IL-21. Os dados também mostram que este efeito positivoé dependente da concentração de sulfato. Além disso, os dados mostram quecloreto tem um efeito positivo na estabilidade de armazenamento, também, eque este efeito positivo também é dependente da concentração de cloreto.

Finalmente, os dados mostram que um efeito estabilizante adicional é atingidoadicionando tanto sulfato como cloreto a uma composição de IL-21. Assim éestabelecido que o efeito de sulfato na estrutura de IL-21 demonstrado pelosexperimentos biofísicos descritos em exemplos 1-4 é refletido em umaestabilidade aumentada de composições de IL-21.LISTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS

<110> Novo Nordisk A/S

<120> Composições de IL-21 estabilizadas<130> 7167.204 WO/<160> 2

<170> PatentIn versão : 3.3 <210> 1 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met1 5 10 15 Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln 20 25 30 Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln 35 40 45 Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro 50 55 60 Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln65 70 75 80Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile 85 90 95 Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala 100 105 110 Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr 115 120 125 Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu 130 135 140 Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu145 150 155 160Asp Ser <210> 2 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variante IL-21 <4 00> 2 Met Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp1 5 10 15 Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe 20 25 30 Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe 35 40 45 Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn 50 55 60 Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro65 70 75 80Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser 85 90 95 Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe 100 105 110 Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr 115 120 125

His Gly Ser Glu Asp Ser

130

Claims

1. Composição, caracterizada pelo fato de compreender IL-21e sulfato, contanto que nenhum íon de amônio, se presente, esteja presente emuma quantidade molar que é duas vezes a quantidade molar de sulfato.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que sulfato está presente em uma concentração acima de 1 mM.

3. Composição de acordo com reivindicações 1 ou 2,caracterizada pelo fato de que o pH é entre cerca de 1 e cerca de 10.

4. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-3, caracterizada pelo fato de que a seqüência da IL-21compreende aminoácidos no 32-162 de SEQ ID No: 1.

5. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizadapelo fato de que a seqüência da IL-21 compreende aminoácidos no 32-162 deSEQ ID No: 1.

6. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizadapelo fato de que a seqüência da IL-21 compreende SEQ ID No: 1.

7. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-3, caracterizada pelo fato de que a seqüência da IL-21compreende SEQ ID No: 2.

8. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-3, caracterizada pelo fato de que a seqüência da IL-21 érepresentada por SEQ ID No: 1.

9. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-3, caracterizada pelo fato de que a seqüência da IL-21 érepresentada por aminoácidos no 32-162 de SEQ ID No: 1.

10. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-3, caracterizada pelo fato de que a seqüência da IL-21 érepresentada por aminoácidos no 32-162 de SEQ ID No: 1.

11. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-3, caracterizada pelo fato de que a seqüência da IL-21 érepresentada por SEQ ID No: 2.

12. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-11, caracterizada pelo fato de que dita composição é umacomposição farmacêutica.

13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a composição a ser administrada aopaciente é isotônica.

14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é isotônica.

15. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-14 caracterizada pelo fato de compreender cloreto.

16. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-15, caracterizada pelo fato de que dita composição nãocompreende amônio.

17. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-16, caracterizada pelo fato de que dita composição nãocompreende cobre.

18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender IL-21 e íons de sulfato.

19. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a composição a ser administrada aopaciente é isotônica.

20. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é isotônica.

21. Composição farmacêutica de acordo com qualquer umadas reivindicações 18-20, caracterizada pelo fato de que quaisquer íons deamônio, se presentes, não estão presentes em uma quantidade molar que éduas vezes a quantidade molar de sulfato.

22. Composição farmacêutica de acordo com qualquer umadas reivindicações 18-21, caracterizada pelo fato de compreender cloreto.

23. Composição farmacêutica de acordo com qualquer umadas reivindicações 18-22, caracterizada pelo fato de que dita composição nãocompreende amônio.

24. Composição farmacêutica de acordo com qualquer umadas reivindicações 18-23, caracterizada pelo fato de que dita composição nãocompreende cobre.

25. Composição caracterizada pelo fato de compreender 10mg/ml de IL-21, 10 mM de Na2SO4, e tamponado com histidina em pH 5,3.

26. Composição de acordo com a reivindicação 25,caracterizada pelo fato de ser uma composição farmacêutica.

27. Composição de acordo com a reivindicação 25 ou 26,caracterizada pelo fato de que a seqüência da IL-21 compreende aminoácidosno 32-162 de SEQ ID No: 1.

28. Composição de acordo com a reivindicação 27,caracterizada pelo fato de que a seqüência da IL-21 compreende aminoácidosno 32-162 de SEQ ID No: 1.

29. Composição de acordo com a reivindicação 28,caracterizada pelo fato de que a seqüência da IL-21 compreende SEQ ID No: 1.

30. Composição de acordo com a reivindicação 25 ou 26,caracterizada pelo fato de que a seqüência da IL-21 compreende SEQ ID No: 2.

31. Composição de acordo com a reivindicação 25 ou 26,caracterizada pelo fato de que a seqüência da IL-21 é representada por SEQID No: 1.

32. Composição de acordo com a reivindicação 25 ou 26,caracterizada pelo fato de que a seqüência da IL-21 é representada poraminoácidos no 32-162 de SEQ ID No: 1.

33. Composição de acordo com a reivindicação 25 ou 26,caracterizada pelo fato de que a seqüência da IL-21 é representada poraminoácidos no 30-162 de SEQ ID No: 1.

34. Composição de acordo com a reivindicação 25 ou 26,caracterizada pelo fato de que a seqüência da IL-21 é representada por SEQID No: 2.

35. Método para estabilizar uma composição compreendendoIL-21, caracterizado pelo fato de compreender a adição de sulfato a ditacomposição.

36. Método para redobrar IL-21 não dobrada ou parcialmentedobrada em solução, caracterizado pelo fato de compreender a adição desulfato a dita solução.

37. Método para purificar IL-21, caracterizado pelo fato decompreender colocar uma solução de IL-21 e sulfato em contato com materialcromatográfico.

38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-37, caracterizado pelo fato de que a seqüência da IL-21 compreendeaminoácidos no 32-162 de SEQ ID No: 1.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizadopelo fato de que a seqüência da IL-21 compreende aminoácidos no 32-162 deSEQ ID No: 1.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que a seqüência da IL-21 compreende SEQ ID No: 1.

41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-37, caracterizado pelo fato de que a seqüência da IL-21 compreende SEQID No: 2.

42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-37, caracterizado pelo fato de que a seqüência da IL-21 é representada porSEQ ID No: 1.

43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-37, caracterizado pelo fato de que a seqüência da IL-21 é representada poraminoácidos no 32-162 de SEQ ID No: 1.

44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-37, caracterizado pelo fato de que a seqüência da IL-21 é representada poraminoácidos no 30-162 de SEQ ID No: 1.

45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-37, caracterizado pelo fato de que a seqüência da IL-21 é representada porSEQID No: 2.

46. Método para tratar câncer, caracterizado pelo fato decompreender a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz deuma composição como definida em qualquer das reivindicações 1-34 a umpaciente com necessidade desta.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizadopelo fato de que dito câncer é selecionado entre carcinoma de célula renal,câncer colorretal, melanoma e linfoma Não-Hodgkin.

48. Uso de IL-21 e sulfato, caracterizado pelo fato de ser paraa preparação de um medicamento para o tratamento de câncer.

49. Uso de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelofato de que dito câncer é selecionado entre carcinoma de célula renal, câncercolorretal, melanoma e linfoma Não-Hodgkin.

50. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 48-49, caracterizado pelo fato de que a seqüência da IL-21 compreendeaminoácidos no 32-162 de SEQ ID No: 1.

51. Uso de acordo com a reivindicação 50 caracterizado pelofato de que a seqüência da IL-21 compreende aminoácidos no 30-162 de SEQID No: 1.

52. Uso de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelofato de que a seqüência da IL-21 compreende SEQ ID No: 1.

53. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 48-49, caracterizado pelo fato de que a seqüência da IL-21 compreende SEQ IDNo: 2.

54. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 48-49, caracterizado pelo fato de que a seqüência da IL-21 é representada porSEQ ID No: 1.

55. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 48-49, caracterizado pelo fato de que a seqüência da IL-21 é representada poraminoácidos no 32-162 de SEQ ID No: 1.

56. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 48-49, caracterizado pelo fato de que a seqüência da IL-21 é representada poraminoácidos no 30-162 de SEQ ID No: 1.

57. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 48-49, caracterizado pelo fato de que a seqüência da IL-21 é representada porSEQ ID No: 2.