JPS61293397A - トリグリセリド検出用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はトリグリセリド含有量に関する水性液体分析用
組成物に関する。

血清トリグリセリドの濃度測定は数種のタイツ。

の過脂肪血症及びアテローム性動脈硬化性心臓疾病の診
断において重要性が増して来た（参照：Ｋａｈ４ｋｅ、
　’Ｗ’　ｒＭｅｄ、　Ｗｓｃｈｔ　ｊ第９１巻２６頁
（１９６６年）、Ｋｕｏ＋　ｐ、　’ｒ、及びＢａａｓ
ｅｔ＊Ｄ−Ｒ，ｒＡｍｅｒ、　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｍｅｄ
Ｊ第５９巻、４６５頁（１９６３年ン）。慣用的な血清
トリグリセリド測定法はトリダリセリｒを加水分解して
グリセリンを遊離し、そしてこのグ１１セリンを種々の
試薬で処理して分光分析法で定量できる化合物を生成す
ることからなる。塩基を用いて加水分解を行うことが一
般的であるが、ビューコロ（Ｂｕｃｏｌｏ　）らへの米
国特許第３，７０３，５９１号及びストーク（Ｓｔｏｒ
ｋ）らへの米国特許第３，７５９，７９３号では、それ
ぞれリパーゼを単独で（前記同第３，７５９，７９３号
）もしくはグロテアーゼとの併用して（前記同第３，７
０３，５９１号）加水分解を行う酵素方法を述べている
。他の酵素によらない加水分解法はドイツ国特許第２，
２２９，８４９号及び同第２，３２３，６０９号に記載
されている。

現在任意の出所のグリセリンを測定するのに三つの酵素
方法が慣用的に用いられる。

これらは下記の通フである。

（ａ）　　ガーランド及びランドル法（Ｍｅｔｈｏｄ　
ｏｆＧａｒｌａｎｄ　ａｎｄ　Ｒａｎｄｌｅ　）（Ｇａ
ｒｌａｎｄ、　Ｐ、　Ｂ、及びＲａｎｄｌｅ、　Ｒ，Ｊ
、著ｒＮａｔｕｒｅＪ、第１９６巻、９８７−９８８頁
（１９６２年）） グリセリンキナーゼ グリセリン＋ＡＴＰ　　　　　　　　Ｌ−α−グリセロ
ホスフェ−）＋ＡＤＰ ピルベートキナーゼ ＡＤＰ＋ホスホノエノールピルベート ビルビン酸塩＋ＡＴＰ ラクテートデヒドログナービ ピルビン酸塩子ＮＡＤＨ 乳酸塩＋ＮＡＤ＋ （ｂ）　　ソイランド法（Ｗｅｉｌａｎ４ｓ　Ｍｅｔｈ
ｏｄ　）（Ｗｅｉｌａｎｄ、　Ｏ−ｒＢｉｏｃｈｅｍ　
ＺＪ　３２９号、３１３頁（１９５７年）） グリセリンキナーゼ グリセリン＋ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　Ｌ−α−
グリセロホスフェ−）＋ＡＤＰ Ｌ−α−グリセロホスフェ−）＋、ＮＡＤ＋ＮＡＤＨ＋
ジヒドロキシアセトンホスフェート＋Ｈ＋（ｃ）　　グ
リセリンデヒドロダナーゼ法（）（ａｇｅｎ、　Ｊ。

Ｈ及びＨａｇｅｎ、　Ｐ、　Ｂ、　ｒＣａｎ　Ｊ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ　ａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇ）’Ｊ第４０巻
、　１１２９頁（１９６２年））グリセリンデヒドロダ
ナーゼ グリセリン＋ＮＡＤ＋　−−一一−−−−−−−−→ジ
ヒドロキシアセトン十ＮＡＤＩ（＋Ｈ＋方法（ａ）の変
更態様はドイツ特許第２，６６５，５５６号、英国特許
第１，３２２，４６２号及び米国特許第３．７５９，７
９３号にも記載されている。全ての場合、ＮＡＤＨ生成
もしくは消失はＵＶ、分光分析法の３４０ｎｍにおいて
測定される。方法（ａ）は多くの商業上の゛道具（ｋｉ
ｔｓ）′に利用される。三酵素工程でちり、そしてＮＡ
ＤＩ（の消失を測定する。方法（ｂ）は二酵素工程から
な＃）ＮＡＤＨの生成は酵素グリセリンデヒドロダナー
ゼ単一反応（方法（Ｃ））の場合の様に測定される。後
者の二操作は極めてＰＨに鋭敏であり、かつ、厳密なＰ
Ｈ管理を保たなければ誤った値を生む。又、三方法会て
において、（特に方法（ａ））では、診断用酵素だけで
なく、補因子（コファクター）、即ち、ＮＡＤＩ（の安
定性が主要に関係してくる。現在の酵素法における誤差
についてはＣｈｅｎ、　Ｈ，Ｐ、及びＥ　ｌ　−Ｍｅｑ
ｕｉｄ、ｉＳ、ｓ、がｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅＪ第７巻、４６０頁（１９７３年）で詳
しく検討している。

別のトリグリセリド分析法はドイツ特許第２．１３９，
１６３号に記載されている。この特許の方法は、トリグ
リセリドを加水分解し、生成したグリセリンを酸化して
ホルムアルデヒドにし、そしてこのホルムアルデヒドを
アンモニア及ヒ水−アルコールー溶解性の安定で無色の
７セチルアセトン金属錯体と反応させて有色化合物を生
成することからなる。

本発明の目的はトリグリセリド、特に血清トリグリセリ
ドを定量測定するための改良方法及び組成物であって、
厳密でかつ狭いＶＩ管理の必要及び試薬安定性に大きく
係ることから相対的に免かれる前記方法及び組成物を提
供することにある。

本発明に従えば、 （ａ）　　水性媒体中において、（１）水性液体被検試
料と、（ＩＤトリグリセリドを含有する液の存在下に次
の順序の定量反応工程（４）ないしく０、即ち、（４）
　トリグリセリドを加水分解してグリセリンとする工程
、 （Ｂ）　　グリセリンをし一α−グリセロホスフェート
に転化する工程、および （Ｃ）　　Ｌ−α−グリセロホスフェートをα−グリセ
ロホスフェート・オキシダーゼの存在下に酸化して、検
出可能な変化を生ずる工程 全行う、酸素及び試薬と全接触させ、次いで（ｂ）　　
上記検出できる変化を検出することを特徴とする水性液
体中のトリグリセリドを検出する方法を提供する。

好ましい態様に従えば、前記工程（Ｏにおいて過酸化水
素を生成せしめ、そして生成した過酸化水素を、過酸化
活性を示す物質と反応させて検出可能な生成物を生せし
める。

前記検出可能な生成物は一般的に有色物質であり、非常
に好ましい態様に従えば、定量できるものである。

別の好ましい態様に従えば、前記水溶液中に存在するト
リグリセリドはリパーゼを用いて加水分解される。

更に別の好ましい態様に従えばグリセリンキナーゼを用
いてグリセリンをＬ−α−グリセロホスフェートに転化
し、そしてＬ−α−グリセロホスフェート・オキシダー
ゼの存在下でＬ−α−グリセロホスフェートの配化ヲ行
つ。

極めて好ましい態様では、過酸化活性を有する物質及び
染料前駆体からなる指示薬組成物を利用する方法である
。

前記染料前駆体は（１）過酸化水素及び過酸化活性を有
する物質の存在下で染料を生成する化合物又は（２）過
酸化水素及び過酸化活性を有する物質の存在下では肉眼
で検知可能な反応を行わないが、別の１種の化合物もし
くは一連の化合物と反応して分析試料中のグリセリンも
しくはトリグリセリド含量に比例して、定量できる生成
物を生成する、一種化合物もしくは一連の化合物のいず
れかからなることを特徴とする。

この発明の方法は、当業界で好く認識され、かつ文献に
も記載されている欠点を有するＮＡＤＨの生成もしくは
消失に本方法及び組成物が依存し々い点で、従来技術の
方法及び組成物を改良するものである。

本発明において、トリグリセリドは下記の一連の反応（
第１表）によって好適に定量測定される。

第１表 リノ藝−→？ １、トリグリセリド＋ＨＯＨ−一→グリセリン士脂肪酸
グリセリンキナーゼ ２、　グリセリン＋ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　Ｌ
−α−グリセロホスフェート＋ＡＤＰ ジアセトンホスフェート十分析測定用の物質（５ｐｅｃ
ｉｅｓ　、） 酸素が前記電子受容体であるとき、Ｈ２Ｏ２は上記（３
）における分析測定用の物質として生成され、そして、
Ｈ２０□の測定は以下の反応によりて好適に実施される
。

ノ臂−オキシダ〜セ０ ４、　　Ｈ２Ｏ２＋Ｈ２Ａ　（還元型）□→Ａ〔酸化型
〕＋Ｈ２０（検出可能物質）ただしＨ２Ａ　（還元性）
は染料の還元形態である染料前駆体である。

Ａ（酸化型ＨＨ２Ａの酸化によって生成される染料であ
る。

好ましい組成物の組合わせ反応において、グリセリン及
び／もしくはトリグリセリドの濃度に比例して検出可能
物質を生成される。この方法は、沢山の臨床適用、詳し
く言えば、血清トリグリセリドの定量に用いることがで
きる。

本発明の操作は慣用方法に優る独自の利益を多く有する
。第一にパーオキシダーゼが電子供与体として利用する
ロイコ染料はいずれも指示薬組成物に有効に用いること
ができる。従って前記反応を、染料の選択に依存して、
スペクトルの可視区域における数種の波長のうちの１種
で測定できる。

第二に、可視区域で行なった測定は３４０　ｎｍで行っ
た測定より妨害されにくい。第三に、染料の他、過酸化
水素を検出する任意な手段を用いることができる。第四
に０２がα−グ＋ｌ七ａホスフェート・オキシダーゼ反
応の補因子であるので、ＮＡＤ　　もしくはＮＡＤＨの
安定性は重要ではない。第五に従来技術の反応工程を妨
害する、ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＩ（金利用する血清成
分（例えば、乳酸塩とラクテートｒヒドロゲナーゼのた
したもの〕は、本処理を妨害しない。第六に０□を電子
受容体として用いるときに０２消費量を測るいかなる手
段も検出手段として使用できる。最後に、本目的の工程
に用いられる酵素は比較的広いＰＨ範囲に亘って活性で
ありこの為に厳密なＰＨ管理が必要ではない。

以下、トリグリセリドを定量する為の溶液及び溶液法に
主な中心をおいて討議するが、全ての試薬を乾燥もしく
は凍結乾燥形態で提供し、そして使用直前に水で再組成
できることが轟業者にとって容易にわかるはずである。

この種の組成物がここにおいて明らかに期待できる。

加水分解 本発明の方法は最も複雑な態様において、゛トリグリセ
リド含量に関する水性液体、例えば血清を分析するのに
利用される。この態様によれば、トリグリセリド加水分
解で述べられているよく知られた任意の技法によって遊
離グリセリンに加水分解する。酵素による技法が好まし
い。これらは通常、前記血清試料の処理を前記トリグリ
セリドの性質に依存してプロテアーゼもしくは界面活性
剤のようなイフェクターと組合せた、もしくは単独のリ
ノ臂−ゼで行うことからなる。このような技術及びこれ
らの実施に有用な組成物についての詳しい検討は１９７
２年１１月２１日にビューコ０らへ発行された米国特許
第３，７０３，５９１号及び１９７３年９月１８日にス
トークらへ発行された米国特許第３，７５９，７９３号
に掲載されている。ビュ、−；口らはプロテアーゼと組
合せてリノぞ−ゼ、好ましくはりゾデスアリズス（Ｒｈ
ｉｚｏｐｕａ　ａｒｒｈｉｚｕａ）（ヴアル・プレマー
ル（ｗａｒ、　’ｄｅｌｅｍａｒ）　）のリパーゼ及び
類似物質を用いて血清トリグリセリドを加水分解するが
、ストークらはりゾグスアリズスの１ルや−ゼだけを用
いて加水分解を行うことを開示している。別法は、それ
自体では、通常血清中に見られるような蛋白質と複合し
たトリグリセリドを加水分解できないり・ぐ−ゼと、イ
フェクターとしての相溶性を有する界面活性剤との相溶
性混合物を用いる血清トリグリセリドの加水分解からな
る。相溶性界面活性剤は下記の試験で述べるようにリパ
ーゼによるトリグリセリドの加水分解を促進するもので
ある。従って、前記界面活性剤はリパーゼの活性を阻害
せずに実質的に高める。前記リパーゼはカンジダシリン
ドラセア（Ｃａｎｄ％ｄ＆ｃｙＬｉｎｄｒａｃｅａ　）
　（カンジダルーゴＪ　（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ
　）　）のものが好ましい。

任意の前記技法に従うトリグリセリド加水分解に有用な
１ルや一ゼは植物もしくは動物からとったものでもよい
が、下記のように界面活性剤とＩＪ　ノ！？−ゼを併用
するとき、微生物（ｍ１ｃｒｏｂｉｏｌ　）　＋ルぞ−
ゼ例、ｔば、カンジダシリンドラセアのものが最良であ
る。例えば、フクモ）　（Ｆｕｋｕｍｏｔｏ　）らがｒ
　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ａｐｐｌｉ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、　Ｊ第１０巻。

２５７〜２６５頁（１９６４年）に記載のように、クロ
モハクテリウムヴイスコサＡ　（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍｖｉｓｃｏａｕｍ）のり／ぞ一ゼ、種々のノ
ぐラリポリティクｂ（Ｐａｒａｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕｍ
）の粗製もしくは精製リノヤーゼ、リゾプスアリズス（
種々のりゾグスｆルマール）の精製リノクーゼ及び類似
の活性を有するリパーゼ製剤も有用である。

他の有用なリパーゼ及びそれらの調製方法は下記の米国
特許に記載されている。

１９５９年５月２６日グランデル（Ｇｒａｎｄｅｌ　）
に発行した米国特許第２，８８８，３８５号１９６５年
２月２日メルセル（Ｍｅｌｃｅｒ）らに発行した米国特
許第３，１６８，４４８号１９６９年６月１５日ヤマダ
（Ｙａｍａｄａ）らに発行した米国特許第３，１８９，
５２９号１９６６年７月２６日フクモト（Ｆｕｋｕｍｏ
ｔｏ）らに発行した米国特許第３，２６２，８６３号１
９７０年５月１９日モベネー（Ｍａｕｖｅｒｎａｙ）ら
に発行した米国特許第３，５１３，０７３号前記すノｆ
−ゼは凍結乾燥した形態で容易に入手できるので、分析
試料を接触用の反応混合物を生成する為に、水による再
組成用乾燥混合物に容易に組み入れるか、もしくは他の
このような溶液と合併できる安定な試薬溶液として提供
するかのいずれかである。

特に好ましい市販のリパーゼにはインジアナ州のエルク
ハールトにあるマイルス研究所が供給する小麦胚種リノ
クーゼ、ウィルソン研究所が供給すルリパーゼ３０００
、シグマケミカル社が供給するステアプシン（最後の２
つの酵素は両方とも膵臓酵素である）及びエンザイムデ
ィベロップメントカンパニーが供給する（カンジダルー
ゴサからの）リパーゼＭが含まれる。

非イオン性及びアニオン性界面活性剤はそれ自身では血
清トリグリセリドを加水分解できない、リパーゼ製剤と
併用して有用であることが分った。

このような物質の中でもロームアンドハース社が商標ト
リトン（Ｔｒ＋ｔｔｏｎ）で市販している、オクチル及
びノニル・フェノキシ・ポリエトキシ・エタノールが最
も好ましい。

ＨＬＢ　（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ　１ｕｐｏｐｈｉｌｅ
　ｂａｌａｎｃｅ　）値が約１５未満でかつポリオキシ
エチレン鎖のポリオキシエチレン単位数が約２０未満で
ある界面活性剤を用いるとき、最良の結果が得られる。

リパーゼ及び界面活性剤の相溶ま組成物は、下記の試験
によって容易に定義される。

評価すべき組成物の界面活性剤を、緩衝していない再組
成した血清（詳しく言えば、ニーージャージイー州、モ
リスプレイズ、ワーナーランハートカンパ＝　−（Ｗａ
ｒｎｅｒ　ＬａｍｂｅｒＬ　Ｃｏｍｐａｎｙ）のザネラ
ルダイアグノステイクスデイプイジョンから入手できる
血清標準パリディト（Ｖａｌｉｄａｔｅ　）に、約Ｏ及
び１０ＴＬ量％の間の様々な濃度で添加し、そしてこの
溶液を３７℃で約５分間インキエペートする。

この時点で、目的のりＩ？−ゼ製剤の試料を加えて約２
０分の間インキエペートヲ続ける。この溶液の一部（〜
０．２　ｍｌ）を（沈殿生成を促すために１．３ｍＭの
ＣａＣｌ　２　を含む）水で１．６　ｍｅ　：で希沢し
、沸騰している水浴−にに１０分間置き、そして遠心分
離して（４℃、３７，０ＯＯＸｙ−，１０分間）澄明に
する。澄明な上澄液０．４　ｍｌのグリセリンを、ガー
ランド、ピー。ビー（Ｇａｒｌａｎｄ、Ｐ、Ｂ）及びラ
ンドル、ビー、ジエイ（Ｒａｎｄｌｅ、Ｐ　、　Ｊ　、
　）がｒ　ＮａｔｕｒｅＪ第１９６巻９８７−９８８頁
（１９６２年）に記載する方法によって、１．２ｍ／の
総容量中で定量的に測定する。有効グリセリンの理論濃
度の少くとも約５０％を遊離する組成物はいずれも有用
と見なされ、かつ本発明の範囲内にある。前記試験を実
施するとき、リパーゼ以外の混合物の成分全てを含む空
試験を行うことが非常に望ましく、その結果遊離グリセ
リンもしくは他の血清成分に帰因する任意の反応を差し
引くことができる。好ましい組成物は１０分未満で有効
トリグリセリドのグリセリンへの加水分解全７５％遂げ
るもので、更に好ましいものは約１０分未満で実質的に
完全に、即ち、約９０％以上有効トリグリセリドをグリ
セリンに加水分解するものである。このように好ましい
組成物の例は下記第■表に示す。

何らかの理由で、従来技術のプニテアーゼーリＡ’−ゼ
の組合せを加水分解に用いるとき、大抵のプロテアーゼ
を用いることができる。これらは、例えば、キモトリプ
シｙ、ｘ、　）レプトミセスグリセウス（Ｓｔｒ、ｅ−
Ｐ７ｔｎｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　）プロテアーゼ（
プロナーゼという登録商標名で市販されている）、アス
ペルギルスオリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙ
ｚａｅ）及びバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
５ｕｂｔｉｌｉｓ）のプロテアーゼ、エラスターゼ（ｅ
ｌａｓｔａｓｅ）、パパイン及びプロメライン（ｂｒｏ
ｍｅｌａｉｎ）　’ｆｒ、含む。もちろん、このような
酵素の混合物も用いる事ができる。

リパーゼ及び界面活性剤、プロテアーゼ等の他のイフエ
クターの有効濃度は前記分析に課せられた時間制約等に
依存して広く変化するが、これらは当業者によって容易
に測定される。有効濃度の典型的な非制限例は後の例に
記載する。

分析する前に遊離グリセリンを取得するために、強塩基
で処理することを含む公卸の従来技法　非酵素的”方法
のいずれによってもトリグリセリド全加水分解すること
ができる。

しかしながら、グリセリン分析系の酵素を阻害するか、
さもなければ、正確なグリセリン測定を行うのに必要な
反応を妨害する物質を含まない媒体中において、前記グ
リセリンを、酵素によるグリセリン分析組成物に配るこ
とを保証する注意を払わなければならない。

ｌユｊユＺ分所 トリグリセリド加水分解を達成したとき、本発明の新規
な酵素によるグリセリン分析を行うことができる。

上記の反応で明らかなように、グリセリン分析に用いる
最初の酵素はグリセリンキナーゼであシ、これはアデノ
シン三リン酸（ＡＴＰ　）の存在下でグリセリンのＬ−
α−グリセロホスフェートへノ転化に触媒作用を示す。

一般的に、任意のグリセリンキナーゼを用いて本発明を
成功裡に実施できるが、大腸菌及びカンジダミコデルマ
（Ｃａｎｄｉｄａｍｙｃｏｄｅｒｍａ％’ら得たものが
好ましい。他のグリセリンキナーゼ酵素は当業界におい
てよく知られている。このような物質を完全に討議し、
かつ更に！ それらの調整及び反応性に関する文献はティー。

イー、バールマン（Ｔ　、　Ｅ　、　Ｂａｒｍａｎ）の
「エンデイムハンドブック（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｈａｎｄ　
ｂｏｏｋ）ＩＪ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ＋Ｎ
、Ｙ、（１９６９年）、４０１−４０２頁）に見られる
。ワーシントン　バイオケミカル　カン−”ｅ＝　−（
ＷｏｒＬｈｉｎｇｔｏｎ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏ
ｍｐａｎｙ）　　のグリセリンキナーゼは満足できる市
販品の酵素を供給する。

次の反応工程では、Ｌ−α−グリセロホスフェート・オ
キシダーゼ及び検出できる反応を生成するための電子受
容体の存在下でＬ−α−グリセロホスフェートの酸化を
行う。この検出できる変化は好ましくは色の変化もしく
は色の生成であり、好適な場合においては液体試料に含
まれるグリセリンに定量的に関係する。酸素消費量のよ
うな検知できる他の変化を監視しても分析結果を認める
ことができる。オキシダーゼ酵素の存在下、検知できる
変化を伴ってα−グリセロホスフェートを酸化する、任
意の電子受容体はこの反応において好適に使用される侯
補物質である。直接もしくは間接的に、放射線測定法で
検知できる、好適には有色生成物を与える物質が、電子
受容体として特に好ましい。有用性のありそうな電子受
容体を用いて実験することによって、いかなる個々の電
子受容体の利用性も決定できる。

非常に好ましい電子受容体は酸素であり、これはオキシ
ダーゼの存在下でＬ−グリセロホスフェースを酸化して
ジヒドロキシアセトンホスフェート及び過酸化水素にす
る。この種の反応において過酸化水素を測定し、かつ酸
素の消費量を調べる方法は公知であることは言うまでも
ない。別の好ましい態様において、酵素及び基質の存在
下で還元されて直ちに変色もしくは呈色をこうむる有色
もしくは無色の物質を電子受容体として用いる。

前述のように、このような物質は特殊な使用状況下で試
験して選ぶことができる。このような状況は下記例５に
記載する。この方法を用いると、成る種のインドフェノ
ール、フェリシアン化カリウム、及び成る種のテトラゾ
リウム塩が有用な電子受容体であることが分った。詳し
く言えば、この反応′における電子受容体として２，６
−シクロロフエノールインドフエノールを単独、もしく
はメト硫酸フェナジンと併用して、及び２−（ｐ　−ヨ
ウドフェニル）−３−にトロフェニル）−５−フェニル
−２Ｈ−テトラゾリウムクロリドを単独もしくはメト硫
酸フェナジンと併用するかのいずれか一方が有用である
ことがわかった。

検出できる変化は電位差測定技術を用いて、たとえば、
酸素電極を用いて酸素消費量を測定することによって測
定することもできる。

Ｌ−α−グリセロホスフェート・オキシダーゼは様々の
出所源から取得できる微生物酵素である。

下記に詳しく示すように成る種の出所源の酵素の特性は
他からのものの特性より好ましい。一般的に、前記酵素
は連鎖球菌族、乳酸桿菌族及びベジオコツカス（Ｐｅｄ
ｉｏｃｏｃｃｕｓ）７５＞ら取得できる。アメリカンタ
イプカルチャーコレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐ
ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）７＞ら入
手可能なストレプトコツカスファエカリス（５ｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）培養物からの酵素
が特に好ましい。特に有用で、かつ好ましい酵素は、前
記コレクションの保管品に基づいて同定される菌株ＡＴ
ＣＣ１１７００、ＡＴＣＣ１９６３４及びＡＴＣＣ１２
７５５から得られる。下記の例で記載及び例証されるよ
うに、ＡＴＣＣ１２７５５の酵素は他の２菌株から得た
酵素よυ若干広いＰＨ範囲で活性を有し、かつこのため
に最も好ましいといえる。

下記の二つの文献は酵素並びに酵素の調製及び抽出に関
する有用な技法を記載するものである。

文献：コデイチェック、エル、ケー、（Ｋｏｄｉｔｓ−
ｃｈｅｋ＋Ｌ　６、Ｋ、）及びアンプライト、ダグリエ
ー、ダヴリ５−　−　（Ｕｍｂｒｅｉｔ、Ｗ、Ｗ、　）
　、　ｒジャーナルオブパクテリオロジ−（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）Ｊ第９８巻３
号、１０６３−１０６８頁（１９６９年）に記載の「ス
トレプトコツカスファエシウム（５ｔｒｅｐｔｏｃｃｏ
ｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ　）のα−グリセロホスフェー
ト・オキシダーゼ」 ジエイコブ、エヌ、ジエイ、　（Ｊａｃｏｂ、Ｎ、　Ｊ
　−）及びヴアンデマーク、ピー、ジエイ、　（Ｖａｎ
ＤｅｍａｒｋＰ　−Ｊ　＞の「ストレプトコツカスファ
エカリスのα−グリセロホスフェート酸化酵素の精製及
び性質」 上記の刊行物のいずれかに記載の方法に従って調製され
た酵素は本発明を成功裡に実施する上で有用である。わ
かっていない全組成の酵素製剤の任意のものを用いると
き、分析結果を妨害するいかなる汚染物をも抜取ること
に注意を払わなければならない。例えば、下記のように
誘導されるし一α−グリセロホスフェート・オキシダー
ゼ製剤が非常に高濃度の不純物を含む為に、不所望な妨
害物質を含まない血清トリグリセリドの分析を達成する
前に、慣用の分別法及びカラム分離法を用いて、前記粗
製の製剤を精製しなければならなかった。

グリセリン及び／もしくはトリグリセリドを含む水溶液
、例えば血清中のグリセリンの検出は酸素の存在下でＬ
−α−グリセロホスフェートの酸化で生成された過酸化
水素の濃度を検知する指示薬組成物を用いて好適に実施
される。酵素によって生成さｒした過酸化水垢を検知す
る為の指示薬組成物は、特にグルコース及び尿酸の酵素
には検知の指示薬組成物として当業界にしく知られてい
る。

他の多くの中でも、米国特許第３０９２４６５号及び同
第２９８１６０６号では、このような有用な指示薬組成
物について記載している。

前記過酸化水素指示薬組成物は過酸化活性を有する物質
、好ましくはツクーオキンダーゼと、過酸化水素及び過
酸化活性を有する物質の存在下で呈色もしくは変色をこ
うむる染料前駆体とから成る。

別法として、前記染料前駆体はＨ２Ｏ２及び過酸化活性
を有する物質の存在下で酸化されて実質的な変色をこう
むらないが、その酸化形態において、色を生成もしくは
変色する物質（例えば、発色剤）と反応して化学反応を
可視的に証明する、一種もしくはそれ以上の物質である
ことができる。特に米国特許第２９８１６０６号には、
このような指示薬組成物の詳しい記載がある。後者の染
料前駆体は、即ち、カップリング反応によって呈色する
もので、本発明全実施するに好ましい。

パーオキシダーゼは過酸化水素もしくは他の過酸化物が
別の物質を酸化する反応に触媒作用を示す酵素である。

前記ツク−オキシダーゼは一般的Ｋ、ポルフィリン鉄を
含有する複合蛋白質である。ノＺ−オキシダーゼは、西
洋わさび、じゃがいも、いちじく樹液およびかぶら（以
上植物性・ぐ−オキシダーゼ）、乳汁（ラフ）Ａ−オキ
シダーゼ）および白血球（ベルド・ぐ−オキシダーゼ）
中に生ずる。

それはまた微生物中においても生ずる。テオレル（Ｔｈ
ｅｏｒａｌｌ）およびマーリー（Ｍａｅｈｌｙ）がｒ　
Ａｃｔａｃｈｅｍ、　５ｃａｎｄ、　Ｊ　４巻４２２−
４３４頁（１９５０年）に発表したような合成パーオキ
シダーゼもまた満足できる。ヘミン、メトヘモグロビン
、オキシヘモグロビン、ヘモグロビン、ヘモブロモビン
、アルカリ性ヘマチン、ヘミン誘導体のような物質およ
び過酸化活性全有する他の化合物はそれよりやや劣る。

酵素でないが過酸化活性を有する他の物質は次の通９で
ある。チオシアン酸鉄、タンニン酸鉄、フェロシアン化
第−鉄、シリカフ９ルに吸収されている第２クロム酸塩
（クロム硫酸カリウム）等で、これらの物質は・ぐ−オ
キシダーゼそのもの程十分ではないが同じ様に用いられ
る。

過酸化水素及び過酸化活性を有する物質の存在下で呈色
を示す染料前駆体には下記の物質が挙げられる。必要な
場合、発色剤も含む。

（１）アニリンおよびその誘導体、オルト−トルインジ
ノやラートルイジン等のモノアミン類（２）　　オルト
−フェニレンジアミン、Ｎ、Ｎ’−シメチルーノソラー
フエニレンジアミン、Ｎ、Ｎ’−ジエチルフェニレンジ
アミン、ベンジジン、ジアニシジン等のジアミン類 （３）　　フェノールそれ自体、チモール、オルト−、
メタ−およびパラ−クレゾール、α−ナフトール、β−
ナフトール等のフェノール類 （４）　　力ｆコール、グアヤコール、オーシノール、
ピロガロール、ｐ、ｐ−ジヒドロキシジフェニルおよび
フロログルシノールのようなポリフェノール類 （５）サルチル酸、ピロカテキン酸、没食子酸のような
芳香族の駿 （６）　　ロイコマラカイトグリーン及びロイコフェノ
ールフタレインのようなロイコ染料 （７）２．６−シクロロフエノールインドフエノールの
ような着色染料 （８）　　エピネフリン、フラボン類、チロシン、ジヒ
ロドキシフェニルアラニンおよびトリプトファンの様な
種々の生物学的物質 （９）　　その他、グアヤデム、グ１★コン酸、ヨウ化
カリウム、ヨウ化ナトリウムおよび他の水溶性ヨウ化物
、ならびにビリルビンのような物質並びに Ｑ０２，２’−アジノージ（３−エチルベンゾチアゾリ
ン−（６）−スルホン酸）およ０３．３’−ジアミノベ
ンジジンのような特殊染料 ノｅ−オキシダーゼの存在下でパーオキシダーゼに！よ
り酸化されることができ、かつ放射線測定技法によって
検知できる物質を提供できる１、他の指示薬組成物には
、成る種の塗料供与組成物が挙げられる。こΩ態様にお
いて、前記指示薬組成物は、パーオキシダーゼの存在下
で酸化されるとき、そのままでもしくはその還元型とで
自家カップリングして塗料を提供する化合物を含むこと
ができる。

このような自家カップリング化合物には、オルトアミノ
フェノール、４−アルコキシナフトール、４−アミノ−
５−ピラゾロン、クレゾール、ピロガロール、グアヤコ
ール、オーシノール、カテコール、フロログルシノール
、ｐｌｐ−ジヒドロキシジフェニル、没食子酸、ピロカ
テキン酸、サリチル酸等のような、様々な加水分解され
た化合物を挙げることができる。この種の化合物はよく
知られており、メース及びジェイムス版（Ｍｅｅｓ　ａ
ｎｄＪａｍｅｓ　Ｅｄ、）の［写真処理の理論（Ｔｈｅ
　Ｔｈｅｏｒｙｏｆ　　Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｐ
ｒｏｃｅｓｓ　）　Ｊの、特に第１７章に等の文献に記
載がある。別の態様では、パーオキシダーゼの存在下で
ロイコ染料を酸化して対応する染料型を提供することに
より検知可能な変化が得られる。代表的なロイコ染料に
はロイコマラカイトグリーン及びロイコフェノールフタ
レインのような化合物が挙げられる。オキシクロミック
（ｏｘｉｃｈｒｏｍｉｃ　）化合物と呼ばれる、他のロ
イコ染料は米国特許第３，８８０，６５８号に記載がち
シ、更に、このような化合物は適当なその置換基で普及
し得ると述べている。米国特許第３８０６５８号に記載
のある非安定化オキシクロミック化合物は本発明の実施
に好ましいと考えられる。別の態様において、バーオキ
シダーゼの存在下で酸化され得、かつフェノール基もし
くは活性化メチレン基を有するような発色剤とで酸化縮
合され得る化合物を含む指示薬組成物によって前記検出
可能な変化が提供され得る。このような酸化性化合物の
代表例としてベンジジン及びその類似物質、ｐ−フェニ
レンジアミン、ｐ−アミンフェノール、４−アミノアン
チピリン等のような化合物を挙げることができる。沢山
の自家カップリング化合物を含む広範囲の前記発色剤が
、上記メース及びジェイムズの文献並びにコサール（Ｋ
ｏｓａｒ　）のｒＬｔｇｈ、ｔＳｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ｓ
ｙｓｔｅｍ　Ｊ　２１５−２４９頁（１９６５年）に記
載されている。

本発明の指示薬組成物はその酸化状態で自家カップリン
グする４−メトキシ−１−ナフトールもシくは１−７−
シヒドロキシナフタレン及び４−アミノアンチピリン（
ＨＣＩ　）の併用剤を含む。後者の組成物では、酸化さ
れたピリン化合物がジヒドロキシナフタレンとカップリ
ングする。本明細書に記載の要素に有用な種々の指示薬
組成物の成分濃度は試料中のグリセリン濃度、検出装置
の精度、生成された染料等に天きく依存するもので、当
業者によって容易に測定できる。後記の例において代表
的な値を示す。

過酸化水素を検出する他の手段も本発明を成功裡に実施
する上で用いることもできる。例えば本明細書中に記載
されている酵素及び他の試薬はロールズＣＲＩＬＷ１８
　）、レベッカ、エル−（Ｒｅｂｅｃｃａ。

Ｌ、）がｒＥｌｅｃｔｒｏｄｅ　Ｈｏ１ｄ　Ｐｒｏｍｉ
ｅ　ｉｎ　ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＵｓｅｓ　Ｊ　（Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅ
ｗｓ　。

１９７６年１月５日、１９頁）に記載するように酸素に
鋭敏なポーラログラフイー電極の膜に組み入れることが
できる。

別の方法として、生成された過酸化水素を測定する代わ
りに酸素に敏感な電極を用いて配素消費量を測定し、こ
うして前記第・１表の反応（１）で生成されたグリセリ
ンの量を決定することができるが、これは第１表反応（
３）における、前記量の酸素を消費するものである。

本明細書に記載されている新規な分析組成物のその他の
成分の濃度は被分析溶液（即ち、希釈もしくは未希釈の
血清又はグリセリン及び／もしくはトリグリセリドの他
の複合水溶液）に依存して広く変化することもできる。

下記第■表では本明細書に記載されている新規な分析組
成物の様々な成分の一般的に有用でかつ好ましい濃度範
囲についての手近な参考試料となるであろう。

以下余白 第■表 グリセリンキナーゼ　　　０．０５−１　　　　　　　
　　　０．２グリセ・リン酸　　　　　　□−□ｏ４オ
キシクーゼ ９Ａｌ１７ｍｌ これらの範囲以外でも有用な結果を得られることは言う
までもない。

前記第■表において、酵素の１国際年位は３７℃ｔ　ｐ
Ｈ７で１分間１μｍｏｌの基質の転化を来たす酵素の量
として定義する。

当業界で良く認識されているように、各々の酵素はｐＨ
活性の性質を有する。即ち、酵素の活性は−（によって
変化する。これらのデータは下記の例においてα−グリ
セロホスフェート・オキシダーゼに関して詳しく記載さ
れている。そのデータで示スように、Ｌ−α−グリセロ
ホスフェート・オキシダーゼのｐＨ活性の性質は約ｐｉ
−１５及び８，５の間でピークになる。前記新規反応工
程において各々の酵素が最も活性になるＰＨの範囲は第
１Ｉ［ｆｉに示される。

第１１Ｉ宍 、Ｈ値 リパーゼ　　　　　　　　　　　　　５−９グリセリン
キナーゼ　　　　　　　　７−９）ぐ−オキシダーゼ　
　　　　　　６−８前記弐から、本明細書に記載されて
いる分析組成物を約６，０及び約８．０の間、非常に好
ましくは約７．０及び約８．０の間のＰＨに緩衝させる
ことが最も望ましいことは容易に分るであろう。この種
の緩衝作用を得る方法は当業界で公知であシ、かつ試薬
組成物に適当な濃度の緩衝剤物質を溶解し、分散し、さ
、もなければ分布させるか、又は別法として、再組成可
能な混合物を与えるときには乾燥形態で提供することか
らなる。前記ｐＨ値に緩衝させるのに適当な緩衝剤は［
生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）ｊ第５巻、４６７
頁（１９６６年）において、グツド（Ｇｏｏｄ）ＪＥ詳
しく記載している。特に好ましい緩衝剤はリン酸カルシ
ウムのようなリン酸塩である。

生じた検知可能な物質の濃度は、任意の公知方法例えば
、標準色図と比較する方法、分光分析法等を用いて検知
できることはいうまでもない。

後に記載する例において、次の酵素調製法及び標準化し
た操作及び組成物を用いた。

標準溶液 グリセリン標準溶液の正確な濃度はガーランド及びラン
ドルの方法（ｒ　ｎａｔｕｒｅＪ第１９６巻９８７−９
８８頁（１９６２年））によって測定した。

過酸化水素溶液はＡ２４０　（２４０ｎｒｎにおける吸
光度）を測定し、Ｅ２４０　＝４３．６を用いて適切に
計算することによって標準（スタンダード）とした。

血清試料をケスラー（Ｋｅｓｓｌｅｒ）及びレダラー（
Ｌｅｄｅｒｅｒ　）の半一自動化螢光測定法（ｒＦ′ｉ
ｕ□ｒｏｍｅｔｒｉｃＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　
Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ、Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ　
１ｎＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊｒ
Ｔｅｃｈｎｉｃａｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉａ。

Ｌ、Ｔ、Ｓｈｅｇｇｓ　、　Ｊｒ、、　Ｅｄ、　Ｍｅｄ
ｉｃａｌ　Ｉｎｃ　＠　、　Ｎ、Ｙ＊　、　Ｎ、Ｙ。

３４１頁（−１９６６年））により、トリグリセリドの
濃度に関して分析した。

総容量１．ＱｍＪに含まれるグリセリンを検出する為に
インキュベートする混合物 リン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ８）　　　　　　　２００
μｍｏｌ西洋ワサヒの）４−万千シダーゼ　　　　　　
　４．２フｔゲロカリン（ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌ　１　
ｉｎ）単位ＭｇＳＯ４２，５ｔＬｍｏ　Ｉ ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　２．４　μｍｏｌトリトｙＸ−１００１０ｍ
９ ４−アミノアンチピレン塩酸塩　　　　　９６μｇ１．
７−シヒドロキシナフタレン　　　　　３２μＩ（エタ
ノール中の０．８％溶液として添加）及びα−グリセロ
ホスフェート・オキシダーゼ　　４単位（過剰のグリセ
リンキナーゼはα−グリセロホスフェート・オキシダー
ゼ製剤中に存在していた。）トリグリセリド定量用の、
インキ−ベート混合物には上記成分の他にカンジダルー
ゴザのリパーゼが１０ｍ９（８，単位／ｍ９）含まれて
いた。全成分を５分間の間平衡状態に保ち、そして（初
期）Ａ４９゜を測定した。グリセリンスタンダード（５
−１００ｎｍｏｌ）もしくは血清（２０ｔｔｌｌ）のい
ずれか一方を添加することによって反応を開始し、そし
て２０ないし３０分間続けた。次いで（最終）Ａ４９゜
を測りた。このスタンダードの系の変動を必要な場合に
示す。

未知の検体のトリグリセリドグリセリン濃度は次のよう
に測定した。標準グリセリン検出系の存在下でインキュ
ベートした検体の湿４９０　（Ａ　４ｑ。

（最終値）−Ａ４９゜（初期値））を、す・ぐ−ゼＭと
前記標準グリセリン検出系の存在下でインキュベートし
た同検体の△Ａ４９ｏから差引いた。グリセリンもしく
は予じめ分析した血清検体のいずれか一方をスタンダー
ドとして用いた検量線の使用によってこのジノ９−ゼＭ
の吸光度における依存変化から°トリグリセリド濃度を
決定した。

ストレプトコッカスファエ力リスの培養ストレプトコッ
カスファエカリス（下記第■表に示した種類）は、０．
１％グルコース、１％トリプトン、１％酵母エキス、０
．６５チに２ＨＰＯ４及び１．５係寒天を含有する斜面
（５ｌａｎｔ）上に保った。

前記斜面コロニーの懸濁水（フラスコ１個につき１．０
ｍｌ懸濁水うちの０．２　ｍｌ　）を各培地２５ｍ１で
充填したフラスコに接種する為に用いた。これらはニー
ーブランズウィックサイクロサームインキュベークーシ
エ１゛カー（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　Ｐｓｙｃｒ
ｏｔｈｅｒｍＩｎｃｕｂａｔｏｒ　５ｈａｋｅｒ）中、
３０℃で２２時間の間、１２　Ｏｒｐｍ　（２インチス
ロー）の振盪を行った。

細胞を含まない抽出物の調製 １００ｍ１の培地からのセル（細胞）を遠心分離（４℃
、１０，０００ｘｇ、１０分間）Ｋよって取得し、冷０
．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）４Ｑｍｌ
で洗浄し、再び遠心分離し、そして緩衝液１ｃ）ｍｌに
懸垂させた。次いで細胞を、ロセット冷却槽（Ｒｏｓｅ
ｔｔ　ｃｏｏｌｉｎｇ　ｃｅｌｌ　）中、７分間（ｆラ
ジソ：／（Ｂｒａｎｓｏｎ）Ｊ　−１７Ａソニファイア
（５ｏｎｉｆｉｅｒ　）を４０のセットで運転して）ソ
ニケーショ７　（５ｏｎｉｃａｔｉｏｎ）破壊した。温
度は８℃未満に保った。１０，０００　ｘｉで１０分間
遠心分離して得た上澄液を酵素源として用いた。可溶性
蛋白質の量は全例におい−でソニケーションの指示期間
に最高に達した。牛血清アルブミンをスタンダードとし
て用いて、蛋白質濃度はロウリイ（Ｌｏｗｒｙ　）外の
方法（Ｌｏｗｒｙ　、　Ｄ　、Ｈ，、Ｒｏｓｅｂｏｒｏ
ｖｇｈ　。

Ｎ−８−ｐ　Ｆａｒｒ　ｒ　Ａ−Ｌ−及びＲａｎｄａｌ
ｌ、Ｒ，Ｊ、ＪＪ。

Ｂｉ：ｏｌ、　ＣｈａｎＪ第１９３号２６５頁（１９５
１年））によって測定した。

第■表の結果はストレフ０トコツカスフアエカリス三菌
程から単離したα−グリセロホスフェート・オキシダー
ゼを比較するものである。各側ともこの菌をブドウ糖培
地において３０℃で２２時間好気的に培養した。遠心分
離で細胞を集め、そして次にソニケーション破壊した。

通常、１０，０００ｘｇで遠心分離して得た上澄液を酵
素源（粗抽出物）として用い尼。しかし、前記オキシダ
ーゼは１００．０００ｄ’で１時間遠心分離した後にさ
えも溶液中に残存していた。全例において溶存酵素の減
少割合は粗製の抽出物の量に比例し、そしてり、Ｌ−α
−グリセロホスフェート及び前記抽出物の両者に完全に
依存するものであった。明らかに、三菌種は全て酸素一
連鎖型（ｏｘｙｇｅｎ−１ｉｎｋｅｄ）活性を呈した。

ＡＴＣＣ１１７００菌株からの酵素の最適ＰＨは５．８
であシ、そしてＡＴＣＣ１９６３４菌株のオキシダーゼ
はｐＨ７，０で最高値を示すことが報告されている。こ
の傾向は第■表でも見られる。

１２７５５菌株の活性は類推してＡＴＣＣ１９６３４の
菌株のものと似ていた。

第■表 ２１℃、０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液中、下記ＰＨ
において、０．１３ＭＤＬ−α−グリセロホスフェート
塩を基質として反応を実施した０ ７．３　　　　　　　　　　１．４９ ＡＴＣＣ１９６３４６，１３，９４ ７，５６，９０ ＡＴＣＣ１２７５５５，９４，９３ ６，８７，１０ 電極分析 ニューブランズウィックディー・オー・アナライザー（
’Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　Ｄ、Ｏ，Ａｎａｌｙｚ
ｅｒ　）で溶存酸素の減少を測定することによって、Ｌ
−α−グリセロホスフェート・オキシダーゼを分析した
。

電磁攪拌機で絶えず攪拌しながら、Ｎ２及び空気の両者
を飽和させた水に対して、この酸素電極の目盛を測定し
た。

全量７．５　ｍｌに緩衝液及びり、Ｌ−α−グリセロホ
スフェートを含むインキュベート混合物を２１℃におい
て平衡状態にしておいた。次いで、酵素の添加によって
反応を開始し、そして溶存酸素の減少割合を前記曲線の
直線部分から算出した。各実験について正確な状態及び
濃度はしかるべきところに定めた。

α−グリセロホスフェート・オキシダーゼの分光分析 １００　ｐｍｌのリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７，０）
、６６μＩの０−ジアニシジン、２５μｇの西洋わさｏ
＝ｏノｚ−オキシダーゼ（４，６プルプロガリン単位）
及び２００μｍｏｌのり、Ｌ−α−グリセロホスフェ−
）　（ＰＨ７，０）を全量１、Ｏｍｌに含む試薬を用い
てα−グリセロボスフェート・オキシダーゼを分析した
。この試薬は３７℃で平衡状態にし、そして酵素の一部
を添加することによって反応を開始シタ。４３０　ｎｍ
にオイて！＝１．０８Ｘ１０’（７）反応跡の初期直線
スロープから活性を算出した。

１２７５５菌株（７）α−グリセロホスフェート−オキ
シダーゼの詳細なＰＨ活性を第１図に示す。最適な活性
は６．３ないし７．５の広いｐＨ範囲で観察され、ｐＨ
６，０未満及びｐＨ３，Ｑよシ上では活性は急激に低下
した。又第１図にはｔｒｉｓ　−ＨＣｔ（ムーΔ）もし
くはグリシン−ＫＯＩ（（Ｘ）緩衝剤のいずれか一方に
よる酵素の外見上の阻害も示す。ｐ）１７．７において
０．１　？ｖｉ　リン酸カリウム緩衝液中の活性は０．
１Ｍグリシン−ＫＯＨ中で観察される活性の４倍であっ
た。しかしながら、０．１Ｍグリシン−ＫＯＨ及び０．
０７ＭＩＪン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，７）の両方の
存在下においてインキーベートスるとき（０，１Ｍリン
酸カリウム緩衝液の存在下の）最初の活性の８２チかも
とにもどった。このことはｔｒｉｓ　−ＨＣｌ及びグリ
シン−ＫＯＨが阻害物質ではなくて、むしろリン酸カリ
ウム緩衝剤が酵素を活性化することを示唆するものであ
る。酢酸ナトリウム緩衝液におけるｐＨ６，５での活性
がリン酸カリウム緩衝液で観察された活性の少くとも９
０チであるので、酢酸ナトリウム緩衝液もまたこの酵素
（第１図）を賦活化すると思われる。

精製 ・α−グリセロホスフェート・オキシダーゼ−グリセリ
ン検出系の予備検査では、粗製のα−グリセロホスフェ
ート（α−ＧＰ）オキシダーゼ製剤が不純物を含有する
ことを示していた。これらの不純物のいくつかは血清試
験において粗製のオキシダーゼ酵素の使用を明らかに妨
害した。これは前記オキシダーゼ酵素用基質が正常のト
リグリセリド濃度に比較できる濃度で血清中に存在する
ことが明らかなためである。これらの不純物の成る種の
ものは血清中に存在する基質上に作用して過酸化水素を
生成したが、もちろんこれは好ましい検知技術を妨害す
るものであった。

蛋白質分別技法を用いた精製結果を第Ｖｉに示すＯ α−グリセロホスフェート・オキシダーゼの安定性 前記酵素溶液は一２０℃で冷凍貯蔵するとき、少くとも
４ケ月間完全に安定であった。くシρ）えし冷凍及び解
凍を行っても酵素を変性させなかった。又、この酵素は
トリトンＸ−１００が２−の濃度であっても阻害されな
かった。

下記の例は本発明の詳しい態様を説明するのに役立つで
あろう。

例１　グリセリン及び過酸化水素に関する検量線グリセ
リン反応曲線を第２図に示す。α−グリセロホスフェー
ト・オキシダーゼ法によるグリセリン及びトリグリセリ
ドの定量において、上記のように混合物を調製した。基
質の添加によって反応を開始しそして３７℃１５分間で
実質的に完了した。この第２図中、グリセリン濃度（、
）と染料生成量体）の好ましい関係をカップリング反応
２，３及び４に関して観察した。

例２　トリグリセリド基質の定量測定 水浴中でオリーブ油（３，６μｍｏｌ／ｍｌ）を０．４
４トリトンｘ−ｔｏｏ（ロームアンドハース社カラ入手
できるオクチルフェノキシポリエトキシエタノール）に
ソニケイテイングすることによってトリグリセリド乳液
を調製した。

カップリング反応１．２．３及び４によるトリグリセリ
ド基質の定量測定はが−ランド及びランドルの方法によ
る定量測定法と比べた。カンジダルーゴサからのリパー
ゼを十分量添加して触媒としすばやく（１分以下で）か
つ完全にトリグリセリドを加水分解した。３０分間イン
キュベートした後のΔＡ４３０を第２図に類似のグリセ
リン濃度反応曲線に対照することによってトリグリセリ
ドグリセリンを測定した。第■表に表すこれらの結果は
、二つの方法間で良好な一致を示す。α−グリセロホス
フェート・オキシダーゼ法で測定したトリグリセリドの
値は金側ともやや高いが、その差は試料２においてだけ
１０％よシ大きかつたにすぎない。

第■表 １　　１８．４　　　１９．０ ２　　３６．４　　　４２．０ ３　　７３．６　　　７８．０ ４　　１１０．０　　　１１４．Ｏ ｐＨ８，０の０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液の好ましい
緩衝系によって、濃度が０１５０ないし６．５０ｍＭに
亘るトリグリセリドグリセリンに関して、１０の血清検
体を分析した。

対照混液はグリセリン検知用の標準成分しか含んでいな
かった。試料混液はカンジダルーゴサの１ルぐ−ゼと他
にグリセリン検知用の標準成分とを含有していた。全混
液は３７℃で５分間平衡状態にし、そして初期のＡ４９
゜を測定した。各血清検体２０μｔを添加することによ
って反応を開始し、そして２０分間インキュベートした
後、最終Ａ４９゜を測定した。対照のΔＡ４９゜を検体
のΔＡ４９゜から引いた後、トリグリセリドグリセリン
濃度を第２図のような水性グリセ、リン検量線から決定
した。

ケスラー及びレデラーの参照方法に対照した結果を第■
表に示す。これら三方法の間に好ましい一致が認められ
た。

第■表 α−グリセロホスフェート・オキシダーゼによる血清ト
リグリ方法 １　６．５９　５６０．１５　６．４８　５５０．８０
２　４．８２　４０９．７０　４．９０　４１６．５０
３　３．７６　３１９．６０　３．９７　３３７．４５
４　３．３０　２８０．５０　３．７０　３１４．５０
５　２．００　１７０．００　１．９０　１６１．５０
６　１．７１　１４５．３５　１．１０　９３．５０７
　１．０６　９０．１０　０．５０　４２．５０８　０
．５９　５０．１５　０．６３　５３．５５９　１．２
５　１０６．２５　１．３５　１１４．７５１０　１．
００　８５．００　０．９５　８０．７５例４ 本明細書に記載の方法は、二つの別々にプールした血清
検体をくシかえして分析することによって正確に試験し
た。一方は正常なトリグリセリド濃度をしておシそして
一方は高−トリグリセリドの濃度をしていた。この結果
は第１表に示す。正常及び異常な血清各々について５，
１多及び２．６チの変動係数（ｃｏりを算出した。

第１表 トリグリセリド定量測定に関するα−グリセロホスフェ
ート・Ｍ １．６０　　　　　　　４．９０ １．６６　　　　　　　　４．８２ １．６１　　　　　　　４．８０ １．４２　　　　　　　５．２５ １．６２　　　　　　４．７６ １．５５　　　　　　５．００ １．５４　　　　　　４．７８ １．７０　　　　　　　４．９２ １．６６　　　　　　４．９６ １．５４　　　　　　４．８３ ４．９１ ４．７９ ４．９０ ４．８０ ４．８９ ０．１３ ２．６０ 平均値１．５９ Ｓ、Ｄ、±　０．０８１ 変動係数　５．１０ 例５　代りの電子受容体 酸素以外の電子受容一体を例証する為に、以下の成分を
含有する反応混合物を調製した。

０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７にする）０．２
ＭＤ、Ｌ−α−グリセロホスフェート第■表に明記する
電子受容体とその濃度各側において、この混合物を３７
℃で平衡状態に保ち、そして酵素の添加によって反応を
開始した。この酵素の活性は２．６−シクロロフエノー
ルインドフエノールに関してＥ６ｏｏ＝１６ＸＩ　Ｏ、
Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ６）に関してＥ４ｏｏ＝Ｉ×１０３及び
２−（ｐ−ヨードフェニル）−３−（ｐ−二トロフェニ
ル）−５−フェニル−２Ｍ−テ」ラソリウムクロリド（
ＩＮＴ）に関してＥ５ｏ５＝１８．５×１０３を用いて
上記のように算出した。

これらの結果を第■表に示す。

本明細書に記載の方法はもちろん全体試薬系に用いた様
々の試薬及び−酵素のいずれを定量するのにも用いるこ
とができる。例えば、ＡＴＰは分析用試料によって導入
されるＡＴＰを除く全試薬からなる組成物を甲いて測定
することができる。同様にして、グリセリンキナーゼ、
リパーゼ及びα−グリセロホスフェートは披分析物以外
の他の所要物質の全てを含む組成物を用いて測定できる
。

グリセリンもしくはトリグリセリドの定性もしくは半定
量分析に適した試験組成物を得る為に、含浸もしくは他
の方法によって当業界で公知の種類の吸収物質のマトリ
ックスに本明細書に記載の分析組成物を入れてもよい。

りゞリセリンもしくはトリグリセリドの分析用に適合で
きる、典型的な生成物質及び要素は例えば、次の米国特
許第３０９２４６５号、同第３４１８０９９号、同第３
４１８０８３号、同第２８９３８４３号、同第２８９３
８４４号、同第２９１２３０９号、同第３００１８８７
９・し、同第３８０２８４２号、同第３７９８０６４号
、同第３２９８７３９号、同第３９１５６４７号、同第
３９１７４５３号、同第３９３３５９４号、同第３９３
６３５７号等に記載されている。

本発明はその好ましい態様に関し、特に詳しく説明した
が、本発明の精神及び範囲内で種々の変更や改変がなし
うろことが了解されよう。

【図面の簡単な説明】

第１図はストレゾトコッカスファエカリスＡＴＣＣ１２
７５５菌種からのα−グリ七コロリン酸オキシダーゼつ
いて、そのＰＨ活性を示すものである。図中、印（０）
はリン酸緩衝液によるもので、（ロ）、（Δ−△）、（
×）はそれぞれ酢酸ナトリウム、ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、グ
″リシンーＫＯＨ緩衝液によるものである。 第２図はグリセリン反応曲線（ｇｌｙｃｅｒｏｌｒｅｓ
ｐｏｎｓｅ　ｃｕｒｖｅ　）である。図中（、）はグリ
セリン濃度を示し、Ｘは染料生成を示す。 以下余白 図面の滲透（内容に変更なＬｌ 第１図　　°“ ΔＡ４９０／１５分 手続補正書（方式） 昭和６１年７月１７　　日 特許庁長官　黒　１）明　雄　殿 １、事件の表示 昭和６１年特許願第１２２７０号 ２、発明の名称 トリグリセリド検出用組成物 ３、　補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 名称　　イーストマン　コダック　カンパニー４、代理
人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、
補正命令の日付 ６、補正の対象 図　　　面 ７、補正の内容 図面の浄書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 浄書図面　　　　　１通 手続補正書 昭和６１年２月ｚＯ日 特許庁長官　宇　買　道　部　殿 １、事件の表示 昭和６１年特許閤第ｊ／冬、２−．７０１号２、発明の
名称 トリグリセリド検出用組成物 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号靜光
虎ノ門ビル　電話（５０４）　０７２１５、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ６、補正の内容 ｌ）明細書第１頁第１４〜１５行「本発明は・・・Ｋ関
する。」を削除し、その後に以下の文を加入する。 ｒ本発明はトリグリセリド含有水性液体、特に血清トリ
グリセリドの分析に用いるのに通した。トリグリセリド
検出用組成物に関する。」２）同第５頁第１４行〜第８
頁第７行、「本発明の目的は・・・改良するものである
。」を削除し、その後に以下の文を加入する。 ｒ本発明の目的はトリグリセリド、特に血清トリグリセ
リドを定量測定するための組成物であって、厳密でかつ
狭い一管理の必要性がなく、使用する試薬の安定性にす
ぐれたトリグリセリド検出用組成物を提供することにあ
る。 本発明に従えば、（ａ）リノＪ？−ゼ、（ｂ）グリセリ
ンキナーゼ、　（Ｃ）アデノシントリホスフェート、　
（ｄ）α−グリセロホスフェート・オキシダーゼ、及び
（、）過酸化活性を示す物質を含む水性液体中のトリグ
リセリド検出用組成物が提供される。」 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）リパーゼ （ｂ）グリセリンキナーゼ （ｃ）アデノシントリホスフェート （ｄ）α−グリセロホスフェート・オキシダーゼ （ｅ）過酸化活性を示す物質 からなることを特徴とする水性液体中のトリグリセリド
   検出用組成物。