JPS58165799A - グリセリンの測定試薬 - Google Patents
グリセリンの測定試薬Info
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- JPS58165799A JPS58165799A JP58041633A JP4163383A JPS58165799A JP S58165799 A JPS58165799 A JP S58165799A JP 58041633 A JP58041633 A JP 58041633A JP 4163383 A JP4163383 A JP 4163383A JP S58165799 A JPS58165799 A JP S58165799A
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- measuring
- reagent
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/61—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving triglycerides
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はグリセリンの酵素測定法及びこの方法を実施す
るための測定試薬に関する。
るための測定試薬に関する。
トリグリセリド（長鎖脂肪酸のグリセリンエステル）の
測定は医学診断法にとって著しく重要である。血中１の
トリグリセリド濃度の上昇は動脈硬化の顕著な危険要因
〒ある。高いトリグリセリド値、すなわち高トリグリセ
リド血症においては冠動脈不全及び心筋硬塞が低いトリ
グリセリド値におけるよりしげしげ起こる。高トリグリ
セＩＪ ）％血症は動脈硬化及び冠状脈疾患の発生を促
進するのｆ１治療を早目に開始するために早期に発見し
なければならない。従って、トリグリセリドもしくはグ
リセリンの測定のための迅速で信頼できる方法が必要と
されている。
測定は医学診断法にとって著しく重要である。血中１の
トリグリセリド濃度の上昇は動脈硬化の顕著な危険要因
〒ある。高いトリグリセリド値、すなわち高トリグリセ
リド血症においては冠動脈不全及び心筋硬塞が低いトリ
グリセリド値におけるよりしげしげ起こる。高トリグリ
セＩＪ ）％血症は動脈硬化及び冠状脈疾患の発生を促
進するのｆ１治療を早目に開始するために早期に発見し
なければならない。従って、トリグリセリドもしくはグ
リセリンの測定のための迅速で信頼できる方法が必要と
されている。
トリグリセリド測定のための公知で使用可能す方法はリ
ノぞ−ゼ／エステラーゼによりトリグリセリドを酵素的
に加水分解し、かつ遊離したグリセリンをグリセロキナ
ーゼ／ピルビン酸キナーゼ／乳酸デヒドロゲナーぜを用
いて測定することよりなる（ ＡＪ、Ｗａｈｌｅｆｅｌ
ｄ、 ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ ＥｎｚｙＩＩＩａｔ
ｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆ’ｉ、 Ｈ，Ｕ、 Ｂｅｒ
ｇｍｅｙｅｒ 。
ノぞ−ゼ／エステラーゼによりトリグリセリドを酵素的
に加水分解し、かつ遊離したグリセリンをグリセロキナ
ーゼ／ピルビン酸キナーゼ／乳酸デヒドロゲナーぜを用
いて測定することよりなる（ ＡＪ、Ｗａｈｌｅｆｅｌ
ｄ、 ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ ＥｎｚｙＩＩＩａｔ
ｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆ’ｉ、 Ｈ，Ｕ、 Ｂｅｒ
ｇｍｅｙｅｒ 。
Ｅｄ、ＡＱａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ 、 Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ 、 Ｌｏｎｄｏｎ 。
ｏｒｋ 、 Ｌｏｎｄｏｎ 。
しかしながら、この公知法は大きな欠点を示す。血清自
体の色（ビリルビン、ヘモグロビン）並び（：濁り（＝
よる妨害を除去するために、試狛空値測定を常に実施し
なければならず、このことは分析あたりの必要時間並び
に試薬使用量、従って費用を高める。更に、多数の不安
定な助触媒及び酵素が存在するので、使用溶液の安定性
は比較的低い。
体の色（ビリルビン、ヘモグロビン）並び（：濁り（＝
よる妨害を除去するために、試狛空値測定を常に実施し
なければならず、このことは分析あたりの必要時間並び
に試薬使用量、従って費用を高める。更に、多数の不安
定な助触媒及び酵素が存在するので、使用溶液の安定性
は比較的低い。
ＵＶ−試験のほか（二もホルマザン形成を基礎とする呈
色テストも公知である。後者のものは試薬空値（二対す
る測定を可能とするが、比較的複雑〒妨害をうけやすい
。
色テストも公知である。後者のものは試薬空値（二対す
る測定を可能とするが、比較的複雑〒妨害をうけやすい
。
更（二、グリセリンデヒドロゲナーゼ（西ドイツ国特許
第２８３１５８０号明細書）又はグリセリンオキシダー
ゼ（西ドイツ国特許出願公告第２８１７０８７号公報）
を用いてグリセリンを測定する方法及び試薬が公知であ
る。この方法Ｃ：よれば、こｎ以前に公知の方法の欠点
を（ロ） 、１避することができるが、その他の
測定法の感度や特異性に関しての改良が所望である。
第２８３１５８０号明細書）又はグリセリンオキシダー
ゼ（西ドイツ国特許出願公告第２８１７０８７号公報）
を用いてグリセリンを測定する方法及び試薬が公知であ
る。この方法Ｃ：よれば、こｎ以前に公知の方法の欠点
を（ロ） 、１避することができるが、その他の
測定法の感度や特異性に関しての改良が所望である。
従って、前記欠点を示さない方法及び試薬に対する必要
がある。容易に、良好な収率↑入手可能な酵素〒実施す
ることができ、かつ改良された感度と特異性を供する方
法が必要１ある。
がある。容易に、良好な収率↑入手可能な酵素〒実施す
ることができ、かつ改良された感度と特異性を供する方
法が必要１ある。
この課題は本発明により、酸素の存在下に水性媒体中で
グリセリンをグリセリンデヒドロゲナーゼ及びグリセリ
ンオキシダーゼと一緒に恒温保持し、酸素消費量又は生
成したＨ２０□を測定することにより解決する。
グリセリンをグリセリンデヒドロゲナーゼ及びグリセリ
ンオキシダーゼと一緒に恒温保持し、酸素消費量又は生
成したＨ２０□を測定することにより解決する。
意外にも、本発明により測定の高めた特異性及び感度が
達せられる。反応機構は公知〒けないが、はじめにグリ
セリンデヒドロゲナーゼによりジヒドロキシアセトンが
生じ、とのジヒドロキシアセトンはグリセリンオキシダ
ーゼにより酸素使用及びＨ２Ｏ２の形成下に酸化される
。
達せられる。反応機構は公知〒けないが、はじめにグリ
セリンデヒドロゲナーゼによりジヒドロキシアセトンが
生じ、とのジヒドロキシアセトンはグリセリンオキシダ
ーゼにより酸素使用及びＨ２Ｏ２の形成下に酸化される
。
本発明により、グリセリンデヒドロゲナーゼ及びその補
酵素ＭＡＤの存在下にグリセリンオキシダーゼ（Ｇｌｙ
ｃ−ＯＤ ） ｉ用いて測定を行なった。グリセリンデ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，、Ｌ １．ｃｉ ）及びグリ
セリンオキシダーゼは公知であり、例えば微生物から得
られるかもしくは市販されている。グリセリンデヒドロ
ゲナーゼ（Ｏｌｙｃ−ＤＨ）の存在下にグリセリンオキ
シダーゼｆの測定の感度及び特異性が更に改良されるこ
とが判明した。
酵素ＭＡＤの存在下にグリセリンオキシダーゼ（Ｇｌｙ
ｃ−ＯＤ ） ｉ用いて測定を行なった。グリセリンデ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，、Ｌ １．ｃｉ ）及びグリ
セリンオキシダーゼは公知であり、例えば微生物から得
られるかもしくは市販されている。グリセリンデヒドロ
ゲナーゼ（Ｏｌｙｃ−ＤＨ）の存在下にグリセリンオキ
シダーゼｆの測定の感度及び特異性が更に改良されるこ
とが判明した。
本発明の方法は予め又は同時にグリセリンの遊離下にト
リグリセＩＪ ｙを酵素的に鹸化することによっても、
又はトリグリセリドをあらかじめ化学的に鹸化すること
によっても実施することができる。化学的鹸化には例え
ばアルコール性水酸化カリ溶液が好適受あり、酵素的鹸
化のためにはエステラーゼを有するり／ｅ−ゼ又はエス
テラーゼ単独が有利である。
リグリセＩＪ ｙを酵素的に鹸化することによっても、
又はトリグリセリドをあらかじめ化学的に鹸化すること
によっても実施することができる。化学的鹸化には例え
ばアルコール性水酸化カリ溶液が好適受あり、酵素的鹸
化のためにはエステラーゼを有するり／ｅ−ゼ又はエス
テラーゼ単独が有利である。
酸素使用量又はＨ２０□生成の測定はこれに公知の方法
１行なわれる。
１行なわれる。
酸素消費量の測定のだめの好適な方法は例えばガスクロ
マトグラフィー及び電気化学的測定法↑ある。酸素電極
を用いてポーラログラフイー測定を行なうことは、この
方法が特に測定の自動的実施に好適であるので有利であ
る。この種の測定法は公知↑ある。水性媒体中の酸素消
費量のポーラログラフイー測定のために西ドイツ国特許
出願公開第２１３０３４０号公報及び同第２１３０３０
８号公報に記載された方法が特に好適〒あることが判明
した。生じた過酸化水素は滴定法１も電位差滴定法、ポ
ーラログラフイー法及び比色定量法並びに酵素法によっ
ても測定することができる。カタラーゼ又はペルオキシ
ダーゼを用いる酵素法は、この方法が著しく特異的で信
頼できるだけ雫なく、過酸化水素を形成する主反応とも
最も容易な方法受組み合わせることができるの〒有利ｆ
ある。β−ジケトン、例えばアセチルアセトン及びメタ
ノールもしくはエタノール又はメチレングリコールの存
在下にカタラーゼを用いて測定することも、１種以上の
色原体の存在下にペルオキシダーゼを用いて測定するこ
とも好適マすることが判明した。カタラーゼ、アセチル
アセトン及びメタノールを用いて測定する際、メタノー
ルが酸化されてホルムアルデヒドとなり、このホルムア
ルデヒドはアセチルアセトンと呈色反応を起こし、これ
を測定することが１きる。ペルオキシダーゼを用いて測
定する際、発色団として反応の後測光法で測定すること
のできる化合物を使用する。好適な発色団の例は２．２
′−アミノベンズチアゾリンスルホン酸（ＡＢＴＳ）’
ｔ’ある。
マトグラフィー及び電気化学的測定法↑ある。酸素電極
を用いてポーラログラフイー測定を行なうことは、この
方法が特に測定の自動的実施に好適であるので有利であ
る。この種の測定法は公知↑ある。水性媒体中の酸素消
費量のポーラログラフイー測定のために西ドイツ国特許
出願公開第２１３０３４０号公報及び同第２１３０３０
８号公報に記載された方法が特に好適〒あることが判明
した。生じた過酸化水素は滴定法１も電位差滴定法、ポ
ーラログラフイー法及び比色定量法並びに酵素法によっ
ても測定することができる。カタラーゼ又はペルオキシ
ダーゼを用いる酵素法は、この方法が著しく特異的で信
頼できるだけ雫なく、過酸化水素を形成する主反応とも
最も容易な方法受組み合わせることができるの〒有利ｆ
ある。β−ジケトン、例えばアセチルアセトン及びメタ
ノールもしくはエタノール又はメチレングリコールの存
在下にカタラーゼを用いて測定することも、１種以上の
色原体の存在下にペルオキシダーゼを用いて測定するこ
とも好適マすることが判明した。カタラーゼ、アセチル
アセトン及びメタノールを用いて測定する際、メタノー
ルが酸化されてホルムアルデヒドとなり、このホルムア
ルデヒドはアセチルアセトンと呈色反応を起こし、これ
を測定することが１きる。ペルオキシダーゼを用いて測
定する際、発色団として反応の後測光法で測定すること
のできる化合物を使用する。好適な発色団の例は２．２
′−アミノベンズチアゾリンスルホン酸（ＡＢＴＳ）’
ｔ’ある。
他の例はトリンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ ）による指示系
〒あり（Ａｎｎ、 Ｃ！ｌｉｎ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ第６
巻（１９６９）、第２４〜２７頁）、ここ１はフェノー
ルと４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）をＰＯＤの
存在下にＨ２Ｏ２を作用させて酸化的にカップリングさ
せ色素にする。フェノールのかわりに、他の芳香族アル
コール、例えばｐ−クロルフェノール、アニリン誘導体
、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナ
フチルアミン誘導体、アミノキノリン、ヒドロキシキノ
リン、ジヒドロフェニル酢酸及び同様に反応する物質を
使用することもできる。４−アミノアンチピリンのかわ
りに４−アミノアンチビリン誘導体、例えば４−アミン
アンチピリンアミド、フェニレンジアミンスルホン酸、
ＭＢＴＨ（メチルベンゾチアゾロンヒドラゾン）、日−
ＭＢＴＨ（スルホン化メチルベンゾチアゾロンヒドラゾ
ン）、ＭＢＴＨ銹導体反導体−ＭＢＴＨ誘導体並びに同
様に反応する化合物を使用する。
〒あり（Ａｎｎ、 Ｃ！ｌｉｎ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ第６
巻（１９６９）、第２４〜２７頁）、ここ１はフェノー
ルと４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）をＰＯＤの
存在下にＨ２Ｏ２を作用させて酸化的にカップリングさ
せ色素にする。フェノールのかわりに、他の芳香族アル
コール、例えばｐ−クロルフェノール、アニリン誘導体
、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナ
フチルアミン誘導体、アミノキノリン、ヒドロキシキノ
リン、ジヒドロフェニル酢酸及び同様に反応する物質を
使用することもできる。４−アミノアンチピリンのかわ
りに４−アミノアンチビリン誘導体、例えば４−アミン
アンチピリンアミド、フェニレンジアミンスルホン酸、
ＭＢＴＨ（メチルベンゾチアゾロンヒドラゾン）、日−
ＭＢＴＨ（スルホン化メチルベンゾチアゾロンヒドラゾ
ン）、ＭＢＴＨ銹導体反導体−ＭＢＴＨ誘導体並びに同
様に反応する化合物を使用する。
ペルオキシダーゼ及び色原体、例えばｐ−クロルフェノ
ール／４−アミノアンチピリン又はＡＢＴＳの存在下で
反応を行なうことは特に有利〒あり、従って本発明の範
囲において優れている。この方法においては短かい反応
時間で吸光度差及びグリセリン濃度間の直線的関係が確
認されたの〒１本発明方法のこの実施形式は動力学的測
定に特に好適〒あるが、終点測定法にも使用可能↑ある
。
ール／４−アミノアンチピリン又はＡＢＴＳの存在下で
反応を行なうことは特に有利〒あり、従って本発明の範
囲において優れている。この方法においては短かい反応
時間で吸光度差及びグリセリン濃度間の直線的関係が確
認されたの〒１本発明方法のこの実施形式は動力学的測
定に特に好適〒あるが、終点測定法にも使用可能↑ある
。
ＮＡＤを化学量論量を越える量を添加することもできる
が、触媒量ＮＡＤ及びＮＡＤ−再生系を加えるのが有利
である。好適なＭＡＤ−再生系は例えば西ドイツ国特許
出願公開第２８３４７０５号公報に記載されている。本
発明の範囲！使用する廟利なＮＡＤ−再生システムは乳
酸デヒドロゲナーゼ及びその基質ピルベートからなる。
が、触媒量ＮＡＤ及びＮＡＤ−再生系を加えるのが有利
である。好適なＭＡＤ−再生系は例えば西ドイツ国特許
出願公開第２８３４７０５号公報に記載されている。本
発明の範囲！使用する廟利なＮＡＤ−再生システムは乳
酸デヒドロゲナーゼ及びその基質ピルベートからなる。
本発明のこれら実施形においてはｐＨ値を７．０〜９．
０に調節すべきであり、こうしてこの範囲においてすべ
ての関与する酵素、すなわちグリセリンオキシダーゼ（
Ｇｌｙｃ−ＯＤ ）、Ｇｌｙｃ −ＤＨ及び場合により
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ ）はこの方法にとって良好
な活性を示す。
０に調節すべきであり、こうしてこの範囲においてすべ
ての関与する酵素、すなわちグリセリンオキシダーゼ（
Ｇｌｙｃ−ＯＤ ）、Ｇｌｙｃ −ＤＨ及び場合により
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ ）はこの方法にとって良好
な活性を示す。
両方の酵素グリセリンオキシダーゼ及びグリセリンデヒ
ドロゲナーゼはグリセリンに関して競合し、かつグリセ
リンデヒドロゲナーゼは酸素を使用しないしＨ２０□を
形成することもないが、意外にもこの実施形においてこ
の反応は分子状酸素を使用し、かつＨ２Ｏ２の形成下に
スムーズに定量的に進行する。
ドロゲナーゼはグリセリンに関して競合し、かつグリセ
リンデヒドロゲナーゼは酸素を使用しないしＨ２０□を
形成することもないが、意外にもこの実施形においてこ
の反応は分子状酸素を使用し、かつＨ２Ｏ２の形成下に
スムーズに定量的に進行する。
グリセリンオキシダーゼ及びグリセリンデヒドロゲナー
ゼを組み合わせて使用することにより、感度は少なくと
も０．００１モル／ｌまで下がる。
ゼを組み合わせて使用することにより、感度は少なくと
も０．００１モル／ｌまで下がる。
測定の実施は試薬空位に対する終点法によつても動力学
的方法によっても実施することができる。
的方法によっても実施することができる。
本発明方法の実施形はトリグリセＩＪ ｒの酵素的鹸化
と同時に実施することもできるが、この場合グリセリン
を遊離し、本発明によりすぐに測定するのｔある。
と同時に実施することもできるが、この場合グリセリン
を遊離し、本発明によりすぐに測定するのｔある。
この方法は唯一の標準を用いて較正することによりグリ
セリン濃度を正確に測定することができるので、自動分
析法にとって特に好適↑ある。このことは自動分析装置
↑整え、図面中にグラフとして示した結果に十分に示さ
れている。第１〜第１θ図を例中↑詳細に説明する。
セリン濃度を正確に測定することができるので、自動分
析法にとって特に好適↑ある。このことは自動分析装置
↑整え、図面中にグラフとして示した結果に十分に示さ
れている。第１〜第１θ図を例中↑詳細に説明する。
更に、本発明の課題はグリセリンデヒドロゲナーゼ、Ｎ
ＡＤ、グリセリンオキシダーゼ及びＨ２Ｏ２測定系から
なるグリセリンの測定試薬である。一番有利な実施形に
２いて、この試薬は主にグリセリンデヒドロゲナーゼ、
ＮＡＤ、グリセリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、
少なくとも１種の色原体及び緩衝剤から、個々に又は混
合して構成されている。色原体としてはＡＢＴ Ｓが有
利ｆｆｉ、９る。これ以外の有利な色指示薬系としては
トリンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ ）系がある。
ＡＤ、グリセリンオキシダーゼ及びＨ２Ｏ２測定系から
なるグリセリンの測定試薬である。一番有利な実施形に
２いて、この試薬は主にグリセリンデヒドロゲナーゼ、
ＮＡＤ、グリセリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、
少なくとも１種の色原体及び緩衝剤から、個々に又は混
合して構成されている。色原体としてはＡＢＴ Ｓが有
利ｆｆｉ、９る。これ以外の有利な色指示薬系としては
トリンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ ）系がある。
その他の廟利な実施形においては試薬は主にグリセリン
デヒドロゲナーゼ、グリセリンオキシダーゼ、ＮＡＤ、
カタラーゼ、アセナルアセトン、メタノール及び緩衝剤
から、個々に又は混合してなる。
デヒドロゲナーゼ、グリセリンオキシダーゼ、ＮＡＤ、
カタラーゼ、アセナルアセトン、メタノール及び緩衝剤
から、個々に又は混合してなる。
前記有利な試薬の組み合わせは前記必須成分の他に付加
的に常用の溶剤、安定剤又は／及び界面活性剤を含有し
ていてよい。これらすべての添加物は専門家に公知であ
り、過酸化水素の検出システムにおいて常用受ある。
的に常用の溶剤、安定剤又は／及び界面活性剤を含有し
ていてよい。これらすべての添加物は専門家に公知であ
り、過酸化水素の検出システムにおいて常用受ある。
本発明による試薬は更に付加的に脂肪分解酵素、例えば
り、ｅ−ゼ／エステラーゼ又はエステラーゼ単独を含有
しているのが有利↑あり、こうしてトリグリセリドの形
で存在する結合グリセリンの測定にも使用することがで
きる。
り、ｅ−ゼ／エステラーゼ又はエステラーゼ単独を含有
しているのが有利↑あり、こうしてトリグリセリドの形
で存在する結合グリセリンの測定にも使用することがで
きる。
有利な実施形においては、不発明による試薬は付加的に
ＮＡＤ−再生糸管含有している。 ・ＩＮＡ
Ｄ再生系にとっても前記方法で記載したと同じことが言
える。有利なＮＡＤ−再生系は乳酸デヒドロゲナーゼ（
ＬＤＨ）及びピルベートからなる。ＮＡＤ再生系の存在
は、触媒量のＮＡＩ）ｔ’十分であることを可能とする
。
ＮＡＤ−再生糸管含有している。 ・ＩＮＡ
Ｄ再生系にとっても前記方法で記載したと同じことが言
える。有利なＮＡＤ−再生系は乳酸デヒドロゲナーゼ（
ＬＤＨ）及びピルベートからなる。ＮＡＤ再生系の存在
は、触媒量のＮＡＩ）ｔ’十分であることを可能とする
。
本発明による試薬の本質的な成分は次の量比で含有され
ているのが有利である。
ているのが有利である。
グリセリンオキシダーゼ ｌＯ〜２００ｔｒ／ｍ
グリセリンデヒドロゲナーゼ １０〜２００ Ｕ／ｄ
ＮＡＤ １〜５０ｍＭｏ
ｌ／４ＮＡＤ再生系を添加する場合、有利に 乳酸デヒドロゲナーゼ ５〜１００ Ｕ／ｌｄビル（
−ト １〜５０ ｍＭｏ１／ｌからなる
。
グリセリンデヒドロゲナーゼ １０〜２００ Ｕ／ｄ
ＮＡＤ １〜５０ｍＭｏ
ｌ／４ＮＡＤ再生系を添加する場合、有利に 乳酸デヒドロゲナーゼ ５〜１００ Ｕ／ｌｄビル（
−ト １〜５０ ｍＭｏ１／ｌからなる
。
有利なＩ（２０□−検出系は
ペルオキシダーゼ ０．５〜２０Ｕ／＋＋＋／４−
アミノアンチピリン ０．２〜５ ｍＭＯ１／ｌフェ
ノール誘導体 １〜１００ ｍＭｏ１／ｌからな
る。
アミノアンチピリン ０．２〜５ ｍＭＯ１／ｌフェ
ノール誘導体 １〜１００ ｍＭｏ１／ｌからな
る。
グリセリンをまずトリグリセリドから遊離させる場合、
試薬は付加的にリパーゼ及び／又はニステラーぜ、有利
（：コレステリンエステラーゼを含有しており、この際
試薬の前記有利な量組成には、この場合２〜５０Ｕ／ｍ
ｌが有利である。
試薬は付加的にリパーゼ及び／又はニステラーぜ、有利
（：コレステリンエステラーゼを含有しており、この際
試薬の前記有利な量組成には、この場合２〜５０Ｕ／ｍ
ｌが有利である。
本発明はグリセリンを測定するための優れた特異性と感
度を有する簡単在方法及び試薬を提供する。この方法は
特（二自動分析装ｆｔ、：使用するために好適である。
度を有する簡単在方法及び試薬を提供する。この方法は
特（二自動分析装ｆｔ、：使用するために好適である。
次に、実施例につき本発明を更に詳説する。
例１
試薬：
試薬組成
ト リ シ ン ｐＩ（ｓ 、０
１００ｍＭｏｌ（ＮＨ４）２日０４
１６０ｒｎＭｏｌＺｎＳＯ４
Ｘ ７Ｈ２００，１ｍＭ’ｏＩＫ２Ｓｏ４５ＱｍＭｏ１ ＭｇＳＯ４Ｘ ７ Ｈ２Ｏ２０ｍＭｏｌｐ−クロルフェ
ノール Ｉ ＱｍＭＱ１４−アミノアン
チピリンアミド ０．５ｍＭｏｌコール酸ナトリ
ウム ３．５ｍＭｏｌ界而活性剤面
（Ｄｏｂａｎｏｌ） ０．０９％界面活性剤２
（ＧｅｎａｐｏｌＸ８０） ０，０６％ＮＡＤ
５ｍＭ０ｌピルベート
５ｍＭ０１乳酸デヒドロゲナーゼ １
００００ Ｕ／ｌコレステリンエステラーゼ
８０００ Ｕ／ｌグリセリンデヒドロゲナーゼ
３００００ Ｕ／ｌグリセリンオキシダーゼ
８ （＋ ０００ Ｕ／ｌペルオキシダーゼ
１５００ Ｕ／Ｌ試料： １〜ｌ ＯｍＭｏ１／ｌの範囲のグリセリン水溶液。
１００ｍＭｏｌ（ＮＨ４）２日０４
１６０ｒｎＭｏｌＺｎＳＯ４
Ｘ ７Ｈ２００，１ｍＭ’ｏＩＫ２Ｓｏ４５ＱｍＭｏ１ ＭｇＳＯ４Ｘ ７ Ｈ２Ｏ２０ｍＭｏｌｐ−クロルフェ
ノール Ｉ ＱｍＭＱ１４−アミノアン
チピリンアミド ０．５ｍＭｏｌコール酸ナトリ
ウム ３．５ｍＭｏｌ界而活性剤面
（Ｄｏｂａｎｏｌ） ０．０９％界面活性剤２
（ＧｅｎａｐｏｌＸ８０） ０，０６％ＮＡＤ
５ｍＭ０ｌピルベート
５ｍＭ０１乳酸デヒドロゲナーゼ １
００００ Ｕ／ｌコレステリンエステラーゼ
８０００ Ｕ／ｌグリセリンデヒドロゲナーゼ
３００００ Ｕ／ｌグリセリンオキシダーゼ
８ （＋ ０００ Ｕ／ｌペルオキシダーゼ
１５００ Ｕ／Ｌ試料： １〜ｌ ＯｍＭｏ１／ｌの範囲のグリセリン水溶液。
測定配合物：
測定光： ５４６ ｎｍ
層厚：１ｍ
温度：２５℃
キュベツト中に試薬１−を加え、試料００１−で開始す
る。試薬中値に対して２０分後の吸光度を測定する。定
量測定にとってはこのΔＥを標準を介してグリセリン濃
度に関係づける。
る。試薬中値に対して２０分後の吸光度を測定する。定
量測定にとってはこのΔＥを標準を介してグリセリン濃
度に関係づける。
試料中値を一緒に実施することは心安で／ｉないｏ５４
６ｎｍ及び２５℃〒の吸光度に対するグリセリン濃度を
書き込むことにより得られる曲線を第１図に記載する。
６ｎｍ及び２５℃〒の吸光度に対するグリセリン濃度を
書き込むことにより得られる曲線を第１図に記載する。
２５℃で時間に応じる吸光度変化を第２図中に記載する
。
。
例２
試薬二側１に記載した試薬を使用する。
試料： トリグリセリド約４５０１１ｖ／ｄｌまでの種
々の人血清 測定配合物： 測定光 ５４６ ｎｍ 層厚 ］ｍ 温度 ２５℃〜３７℃ キュベツト中に試薬１．０−を加え、血清０・０１ｔｎ
ｔ↑開始する。試薬中値に対する２５分後の吸光を測定
する。定量測定のためにはとの△Ｅをグリセリン標準を
介してトリグリセリド濃度に関係づける。５４６ ｎｍ
及び２５℃におけるトリグリセリド濃度を書き込み得ら
れた曲線を第３図に示す。試料中値の実施は必要ではな
い。
々の人血清 測定配合物： 測定光 ５４６ ｎｍ 層厚 ］ｍ 温度 ２５℃〜３７℃ キュベツト中に試薬１．０−を加え、血清０・０１ｔｎ
ｔ↑開始する。試薬中値に対する２５分後の吸光を測定
する。定量測定のためにはとの△Ｅをグリセリン標準を
介してトリグリセリド濃度に関係づける。５４６ ｎｍ
及び２５℃におけるトリグリセリド濃度を書き込み得ら
れた曲線を第３図に示す。試料中値の実施は必要ではな
い。
時間に応じた吸光度変化をｆｌＪ図に記載する。
）例３〜８ 試料： 例３．５及び７にはトリグリセリド１００．２００及び
５００ ｍＪｉｌ ／ｃａｌに相応するグリセリン標準
溶液を使用した。
）例３〜８ 試料： 例３．５及び７にはトリグリセリド１００．２００及び
５００ ｍＪｉｌ ／ｃａｌに相応するグリセリン標準
溶液を使用した。
例４．６及び８にはトリグリセリド約１゜Ｏ，２００及
び６ ｏ ｏ ｍｙ／ｄ／を含有する人血清を使用した
。
び６ ｏ ｏ ｍｙ／ｄ／を含有する人血清を使用した
。
測定配合物二
例２に記載したと同様。
この測定を例２に記載したと同様に実施した。得られた
結果を、前記種々の量の時間に応じた吸光度変化を示す
曲線群の形で第５因〜第１０図に記載する。この際曲線
１はそれぞれの試薬中値を示し、曲線２．３及び４は前
記のトリグリセリＰの増加量！得られる。
結果を、前記種々の量の時間に応じた吸光度変化を示す
曲線群の形で第５因〜第１０図に記載する。この際曲線
１はそれぞれの試薬中値を示し、曲線２．３及び４は前
記のトリグリセリＰの増加量！得られる。
添付図面は本発明によるグリセリン到定法及び測定試薬
を用いた実験結果並びに比較実験結果をそれぞれグラフ
として表わした図である。 第１図及び第３図はそれぞれ実施例１及び２により測定
した吸光度（Ｋｓｔｓ）とグリセリン濃度（トリグリセ
リドη７’ｄｌ ）との関係をグラフに示した図である
。第２図及び第４図はそれぞれ実施例】及び２により測
定した吸光度（Ｅ５４６ ）と時間との関係をグラフに
示した図である。第５〜第１０図も同様にそれぞれ実施
例３〜８の条件下に測定ｌ〜だ吸光度（”５４６ ）と
時間との関係をグラフに示した図〒ある。 （２３）
を用いた実験結果並びに比較実験結果をそれぞれグラフ
として表わした図である。 第１図及び第３図はそれぞれ実施例１及び２により測定
した吸光度（Ｋｓｔｓ）とグリセリン濃度（トリグリセ
リドη７’ｄｌ ）との関係をグラフに示した図である
。第２図及び第４図はそれぞれ実施例】及び２により測
定した吸光度（Ｅ５４６ ）と時間との関係をグラフに
示した図である。第５〜第１０図も同様にそれぞれ実施
例３〜８の条件下に測定ｌ〜だ吸光度（”５４６ ）と
時間との関係をグラフに示した図〒ある。 （２３）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 酸素の存在下に水性媒体中↑グリセリンをグリセ
リンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ及びグリセリンオキシダ
ーゼと一緒に恒温保持し、酸素消費量又は生成したＨ２
０□を測定することを特徴とするグリセリンの測定法。 λ 酸素消費量をポーラログラフイーで測定する特許請
求の範囲第１項記載の測定法。 ３− 生成したＨ２Ｏ２をカタラーゼ又はペルオキシダ
ーゼを用いて酵素的に測定する特許請求の範囲第１項記
載の測定法。 ４、 ペルオキシダーゼ及び原色体を添加し、着色もし
くは吸光度変化を測定する特許請求の範囲第３項記載の
測定法。 ５、 測定を動力学的に予め決めた短かい時間間隔で実
施する特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に
記載の測定法。 ６、 ｐＨ７，０〜９．０′ｔ％作業する特許請求の
範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の測定法。 ７、 酸素の存在下に水性媒体中のグリセリンをグリセ
リンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ及びグリセリンオキシダ
ーゼと一緒に恒温保持し、酸素消費量又は生成したＨ２
０□を測定するグリセリンの測定法において、ＮＡＤを
ＮＡＤ−再生系と一緒に添加することを特徴とするグリ
セリンの測定法。 ８、 ＮＡＤ−再生系としてピルベート及び乳酸デヒ
ドロゲナーゼを使用する特許請求の範囲第７項記載の測
定法。 ９、 作業をｐＨ７，０〜９．０″′ｒ４行なう特許請
求の範囲第７項又は第８項記載の測定法。 １０、 グリセリンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ、グリ
セリンオキシダーゼ及びＨ２Ｏ２測定系からなることを
特徴とするグリセリンの測定試薬。 １１、 Ｈ２０□の測定系がペルオキシダーゼ、少な
ぐとも１種の原色体及び緩衝剤からなる特許請求の範囲
第１０項記載の測定試薬。 １２．原色体がｐ−クロルフェノール及び４−アミノア
ンチピリンアミドからなる特許請求の範囲第１１項記載
の測定試薬。 １３、 ｐ−クロルフェノール５〜１５ ａＭｏｌ
／ ｍｌ及び４−アミノアンチピリンアミド０．１〜１
．０μＭｏｌ／７１Ｌ／を含有する特許請求の範囲第１
２項記載の測定試薬。 １４− 原色体が２．２′−アジノジー（３−エチル−
ベンズチアゾリンスルホン酸−６）−ジアンモニウム塩
からなる特許請求の範囲第１１項記載の測定試薬。 １５ グリシルグリシン緩衝剤又はトリシン緩衝剤、
−ｐＨ７，０〜９．０を含有する特許請求の範囲第１１
項記載の測定試薬。 １６、 グリセリンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ、グリ
セリンオキシダーゼ及びＨ２０□の測定系からなるグリ
セリンの測定試薬において、エステル化グリセリンを鹸
化するための薬剤を付加的に含有することを特徴とする
グリセリンの測定試薬。 １７、 Ｈ２０□の測定系がベルオキシダーぜ、少な
くとも１種の原色体及び緩衝剤からなる特許請求の範囲
第１６項記載の測定試薬。 １８、 原色体がｐ−クロルフェノール及び４−アミ
ノアンチピリンアミＰからなる特許請求の範囲第１７項
記載の測定試薬。 １９、 ｐ−クロルフェノール５−１５μＭｏｌ／ｍ
Ａ’及び４−アミンアンチピリンアミド０．１〜１．０
μＭｏｌ ／ ｙＬｌを含有する特許請求の範囲第１８
項記載の測定試薬。 ２０、 原色体が２．２′−アジノジ・（３−エチル
−ベンズチアゾリンスルホン酸−６）−ジアンモニウム
塩からなる特許請求の範囲第１７項記載の測定試薬。 ２１、 グリシルグリシン緩衝剤又はトリシン緩衝剤
、ｐＨ７，０〜９．０を含有する特許請求の範囲第１７
項記載の測定試薬。 ２２ グリセリンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ、 グリ
セリンオキシダーぜ及びＨ２０□測定系からなるグリセ
リンの測定試薬において、付加的にＮＡ、Ｄ−再生系を
含有することを特徴とするグリセリンの測定試薬。 ２３、 ＮＡＤ−再生系がピルベート及び乳酸デヒド
ロゲナーゼからなる特許請求の範囲第２２項記載の測定
試薬。 ２４、 グリセリンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ、グリ
セリンオキシダーゼ及びＨ２０□測定系からなり、かつ
エステル化グリセリンを鹸化するための薬剤を含有する
グリセリンの測定試薬において、付加的にＮＡＤ再生系
を含有することを特徴とするグリセリンの測定試薬。 ２５、 ＮＡＤ−再生系が ピルベート及び乳酸デヒ
ドロゲナーぜからなる特許請求の範囲第２４項記載のグ
リセリンの測定試薬。 ２６、 グリセリンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ、 グ
リセリンオキシダーゼ及びＨ２Ｏ２測定系からなるグリ
セリンの測定試薬において、付加的に界面活性剤を含有
することを特徴とするグリセリンの測定試薬。 ２７、 グリセリンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ、
グリセリンオキシダーゼ及びＨ２Ｏ２測定系からなり、
かつエステル化グリセリンを鹸化するための薬剤を含有
するグリセリンの測定試薬において、付加的に界面活性
剤を含有することを特徴とするグリセリンの測定試薬 ２８ グリセリンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ、グリセ
リンオキシダーゼ及びＨ２０□測定系からなるグリセリ
ンの測定試薬が担持材料、例えば紙に含浸されているこ
とを特徴とするグリセリンの測定試薬。 ２９ グリセリンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤｌ グリ
セリンオキシダーゼ及びＨ２Ｏ２測定系からなり、かつ
エステル化グリセリンを鹸化するための薬剤を含有する
グリセリンの測定試薬が担持材料、例えば紙に含浸され
ていることを特徴とするグリセリンの測定試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3210095.7 | 1982-03-19 | ||
| DE19823210095 DE3210095A1 (de) | 1982-03-19 | 1982-03-19 | Verfahren und reagenz zur bestimmung von glycerin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58165799A true JPS58165799A (ja) | 1983-09-30 |
| JPS622799B2 JPS622799B2 (ja) | 1987-01-21 |
Family
ID=6158722
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58041633A Granted JPS58165799A (ja) | 1982-03-19 | 1983-03-15 | グリセリンの測定試薬 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0089606B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58165799A (ja) |
| AT (1) | ATE23194T1 (ja) |
| DE (2) | DE3210095A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3211167A1 (de) * | 1982-03-26 | 1983-09-29 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Testsystem und verfahren zur bestimmung von substanzen in fluessigkeiten |
| JPS59140900A (ja) * | 1983-01-28 | 1984-08-13 | Toyo Jozo Co Ltd | 新規な酵素的高感度測定法 |
| US4654310A (en) * | 1984-01-10 | 1987-03-31 | Ly Uy Vu | Instrumentless quantitative analysis system |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6049477B2 (ja) * | 1977-04-19 | 1985-11-01 | 協和醗酵工業株式会社 | グリセロ−ル酸化酵素およびその製造法ならびにグリセロ−ル酸化酵素を用いるグリセロ−ルの定量法 |
| DE2831580C2 (de) * | 1978-07-18 | 1980-09-18 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Glycerin |
-
1982
- 1982-03-19 DE DE19823210095 patent/DE3210095A1/de not_active Withdrawn
-
1983
- 1983-03-15 AT AT83102556T patent/ATE23194T1/de active
- 1983-03-15 DE DE8383102556T patent/DE3367254D1/de not_active Expired
- 1983-03-15 JP JP58041633A patent/JPS58165799A/ja active Granted
- 1983-03-15 EP EP83102556A patent/EP0089606B1/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0089606B1 (de) | 1986-10-29 |
| EP0089606A2 (de) | 1983-09-28 |
| ATE23194T1 (de) | 1986-11-15 |
| JPS622799B2 (ja) | 1987-01-21 |
| DE3210095A1 (de) | 1983-09-29 |
| DE3367254D1 (en) | 1986-12-04 |
| EP0089606A3 (en) | 1985-06-05 |
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