JPS6338199B2 - - Google Patents

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JPS6338199B2
JPS6338199B2 JP58039813A JP3981383A JPS6338199B2 JP S6338199 B2 JPS6338199 B2 JP S6338199B2 JP 58039813 A JP58039813 A JP 58039813A JP 3981383 A JP3981383 A JP 3981383A JP S6338199 B2 JPS6338199 B2 JP S6338199B2
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JP
Japan
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hydroxybutyric acid
nad
composition
acid
electron carrier
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JP58039813A
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JPS59162899A (ja
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Yukio Shigeta
Masaru Harano
Shigeki Yamada
Yoshinori Takahashi
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Arkray Inc
Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
Original Assignee
Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
Kyoto Daiichi Kagaku KK
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Publication date
Application filed by Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd, Kyoto Daiichi Kagaku KK filed Critical Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
Priority to JP58039813A priority Critical patent/JPS59162899A/ja
Priority to DE19843408062 priority patent/DE3408062A1/de
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Priority to US06/922,178 priority patent/US4803158A/en
Publication of JPS6338199B2 publication Critical patent/JPS6338199B2/ja
Granted legal-status Critical Current

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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/805Test papers

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  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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  • Wood Science & Technology (AREA)
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  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】
(a) 産業䞊の利甚分野 本発明は、新芏なβ−ヒドロキシ酪酞の濃床を
簡易・迅速に定量できる固盞䞀䜓化組成物に関す
るものである。 (b) 埓来の技術及びその問題点 β−ヒドロキシ酪酞β−オキシ酪酞は、脂
肪酞代謝の䞭間産物でケトン䜓の䞀皮であり、糖
尿病患者や糖尿病動物の䜓液血液や尿等に他
のケトン䜓ずずもに倚く存圚する。以䞋、本発明
を、䜓液䞭のβ−ヒドロキシ酪酞を枬定する堎合
を䟋にずり詳现に説明する。 膵内分泌障害によるむンスリン䞍足など炭氎化
物代謝障害があるずきには、肝臓での脂肪酞の酞
化が盛んになる。その結果、アセトン・アセト酢
酞・β−ヒドロキシ酪酞等のケトン䜓が異垞増加
し、組織、血液、尿䞭にケトン䜓が過剰に蓄積さ
れるケト−ゞスの状態。埓぀お、高床の膵内
分泌障害特に重症糖尿病の堎合、或いは糖質制限
投䞎の際には䜓液䞭ケトン䜓の消長に泚意するこ
ずが必芁である。 ずころで、重症糖尿病におけるケト−ゞス状態
の際には、これらのケトン䜓のうち特に血䞭β−
ヒドロキシ酪酞の䞊昇が著しくなり、β−ヒドロ
キシ酪酞アセトンアセト酢酞の比が増倧
し、β−ヒドロキシ酪酞が糖質代謝異垞を最も鋭
敏に反映するずされおいる。 血液䞭のβ−ヒドロキシ酪酞の定量法ずしおは
りむリアム゜ン等のβ−ヒドロキシ酪酞脱氎玠酵
玠を甚いる方法が知られおいる〔バむオケミカル
ゞダヌナルBiochemical Journal82å·»90頁、
1962幎〕。この方法はβ−ヒドロキシ酪酞脱氎玠
酵玠ずゞホスホピリゞルヌクレオチドDPN
を反応させ、生成した還元型ゞホスホピリゞルヌ
クレオチドDPNHの340nにおける特異吞
収の吞光床を枬定し、その分子吞光係数からβ−
ヒドロキシ酪酞量を求めるものである。埓぀お、
分析には高床の熟緎ず長時間を芁し、䞔぀高玚な
玫倖郚分光光床蚈を必芁ずする点で問題があ぀
た。 この欠点を是正するために、玫倖郚分光光床蚈
を必芁ずしない血䞭ケトン䜓の高感床簡易比色法
が開発された特開昭55−35232。この方法は、
たずβ−ヒドロキシ酪酞にβ−ヒドロキシ酪酞脱
氎玠酵玠ずニコチンアミドアデニンゞヌクレオチ
ドNADを䜜甚させお酵玠的に酞化しおアセ
ト酢酞ずなし、血䞭に元から含たれおいたアセト
酢酞ず共に−ニトロプニルゞアゟニりムフル
オロボレヌトず反応させおアゟ化合物ずなす。こ
れを次亜燐酞で還元しお安定なヒドラゟ化合物に
転じ、390nの波長を甚い比色法により党アセ
ト酢酞量を求める。別途、β−ヒドロキシ酪酞脱
氎玠酵玠を䜜甚させないで同様に比色しお血䞭の
元のアセト酢酞量のみを求め、䞊蚘党アセト酢酞
量から差挔算をなし、β−ヒドロキシ酪酞量を求
めるものである。しかしこの方法も、血液詊料の
前凊理陀蛋癜や耇雑な定量操䜜のため枬定に
熟緎ず長時間を芁し、䞔぀特別の噚具や高玚な分
光光床蚈も必芁であり、日垞の臚床怜査法ずしお
は未だ倚くの問題を有しおいる。 䞀方、β−ヒドロキシ酪酞をニコチンアミドア
デニンゞヌクレオチドNADの存圚䞋でβ−
ヒドロキシ酪酞脱氎玠酵玠により酞化脱氎玠
しお生成した還元型NADNADHに、電子䌝
達䜓を介しおテトラゟリりム塩を還元せしめ、生
成する有色のホルマザンの呈色床を枬定しおβ−
ヒドロキシ酪酞を迅速、簡易に定量でき、優れた
結果を埗るこずができる方法が芋いだされた。 曎に、β−ヒドロキシ酪酞脱氎玠酵玠、
NAD、及びテトラゟリりム塩を吞収性担䜓に
含浞させ、次いで也燥させた詊隓具がオヌ゚ン
Owenによ぀お開発された。〔米囜特蚱第
4351899号、発明の名称代謝酞の半定量枬定
Semi−Quantitative Assay of Metabolic
Acid〕 オヌ゚ンの組成物における枬定原理は、䞋匏に
瀺す劂くたずβ−ヒドロキシ酪酞を電子受容䜓で
あるNADの存圚䞋にβ−ヒドロキシ酪酞脱氎玠
酵玠により酞化脱氎玠しおアセト酢酞ずな
す。このずき生じる還元型NADNADHが電
子䌝達䜓を介しおテトラゟリりム塩を還元しお有
色のホルマザンを生成させ、このホルマザンの呈
色状態を比色しおβ−ヒドロキシ酪酞量を求める
ものである。 この詊隓具に怜䜓の䞀滎を塗垃すれば、数分の
埌怜䜓䞭のβ−ヒドロキシ酪酞の濃床に応じた色
を組成物䞊に呈する。これを予め䜜成した暙準比
色衚ず肉県比色するだけでβ−ヒドロキシ酪酞濃
床を枬定するこずが可胜である。 しかしながらこの詊隓具は、電子䌝達䜓ずしお
メルドラブルヌ、PMSが䜿甚されおいるこず及
び詊薬を吞収性担䜓に含浞させおいるため、呈色
等の安定性が悪く、たた、長時間の詊隓具の保存
にも耐えうるものではなか぀た。 ずころで、この詊隓具は保存安定性を高めるた
め、詊薬の内、PH緩衝剀のみを他の詊薬ず別の吞
収性担䜓に保持させおいる。オヌ゚ンが開瀺しお
いるように、アルカリ性緩衝剀ず他の詊薬を䞀緒
にするず保存安定性が埗られないためである。 この点を確認するために、発明者らは以䞋に瀺
す怜蚎を行぀た。 怜蚎 (1) β−ヒドロキシ酪酞脱氎玠酵玠 60IUml (2) β−NAD 21 (3) メルドラブルヌ 0.25 (4) INT 8.9 (5) グリシン−氎酞化ナトリりム緩衝液
1MPH8.8 (6) リン酞1K−リン酞2K緩衝液 1MPH8.8 䞊蚘(1)〜(4)の詊薬を溶解したものず、(5)〜(6)の
詊薬を溶解したものを別々に䜜補し、䞡者を合わ
せお含浞溶液を䜜補したずころ、瞬時に赀玫色に
着色した。この混合含浞溶液に吞収性玙東掋濟
玙補、濟玙500に浞挬し、也燥したずころ、
赀玫色に着色し、詊薬玙ずしお党く䜿甚できなか
぀た。 怜蚎 怜蚎で䜜補した(1)〜(4)の詊薬を溶解した液ず
(5)〜(6)の詊薬を溶解しお䜜補した液のそれぞれに
怜蚎で甚いた濟玙を浞挬、含浞し、皮の詊薬
残枣含有濟玙を䜜補した。(5)〜(6)の詊薬也燥残枣
含有濟玙は癜色であ぀たが、(1)〜(4)の詊薬也燥残
枣含有濟玙はうす青色を呈しおいた。 怜蚎及びより本発明に甚いられおいる詊薬
の堎合、オヌオンの䞻匵する通り党おの詊薬を䞀
緒にするず䜿甚できない䜍の着色が芋られるが、
アルカリ性緩衝液を別にすれば詊隓片の着色を抑
えられるこずが理解される。 しかしながら、アルカリ性緩衝剀を他の詊薬ず
別の吞収性担䜓に含浞させたオヌ゚ンの詊隓具は
䜿甚においお䞍䟿であるばかりか、粟床の悪い結
果しかもたらさない。即ち、䜿甚に際しおは別々
の容噚から取り出した皮類の詊薬含有玙を重ね
た䞊から詊料を滎䞋するずいう面倒さがあり、た
た、぀に詊薬含有玙を重ねた䞊から詊料を滎䞋
するために、䞡方の詊薬含有玙に詊料を均䞀に䟛
絊するこずができないため、粟床に悪い結果しか
埗られおいなか぀た。粟床が悪いこずは、オヌ゚
ン自身が、発明の名称に半定量枬定ずいう衚珟を
甚いおいるこずからも理解できる。 (c) 問題点を解決するための手段 以䞊のような珟状に鑑み、本発明者等は鋭意研
究の結果、β−ヒドロキシ酪酞をニコチンアミド
アデニンゞヌクレオチドNADの存圚䞋でβ
−ヒドロキシ酪酞脱氎玠酵玠により酞化脱氎
玠する工皋に電子䌝達䜓及びテトラゟリりム塩
を存圚せしめ、生成するホルマザンの呈色床を枬
定するためのものにおいお、PHを〜に維持す
るPH緩衝剀、β−ヒドロキシ酪酞脱氎玠酵玠、
NAD、電子䌝達䜓、テトラゟリりム塩が、芪氎
性の倩然又は合成のフむルム圢成重合䜓が疎氎性
の倩然又は合成のフむルム圢成重合䜓に分散され
たものであるバむンダヌず共に、氎䞍浞透性の支
持䜓䞊に構成させるこずによ぀お保存安定性の優
れたβ−ヒドロキシ酪酞の定量甚組成物を芋出し
た。 本発明の組成物の保存安定性が優れおいる理由
は、倩然又は合成のフむルム圢成重合䜓が䞍安定
な詊薬を芆うこずによ぀お空気䞭の酞玠や湿床に
よる酞化から守぀おいるこずず、接觊させるず䞍
安定な詊薬を芆うこずによ぀お隔離しおいるこず
にある。特に疎氎性のフむルム圢成重合䜓䞭に芪
氎性のフむルム圢成重合䜓を分散させ、油䞭氎滎
゚マルゞペンずしたものは詊薬を芆う効果が高く
保存安定性を高めるのに絶倧な効果を有しおい
る。 本発明におけるβ−ヒドロキシ酪酞脱氎玠酵玠
ずしおは、β−ヒドロキシ酪酞を酞化しおアセト
酢酞を生成させるものならば劂䜕なるものでも甚
いられる。これには、ロドシナヌドモナススプ
ロむドRhodopseudomonas spheroi−desや
シナヌドモナスレモむグネPseudomonas
lemoigneiなどの现菌を起源ずするもの、牛の
心臓や豚の肝臓などの動物組織から抜出したもの
などが挙げられる。 NADは、酞化還元系反応で氎玠原子受容䜜甚
を有する補酵玠であり、肝臓・膵臓などの動物組
織や酵母などから抜出されたものが挙げられ、そ
のナトリりム塩やリチりム塩なども䜿甚可胜であ
る。 電子䌝達䜓ずしおは、生成したNADH氎玠䟛
䞎䜜甚を掻性化するものであれば、いずれも甚い
られる。䟋えばフラピン酵玠の䞀皮であるゞアホ
ラヌれやメルドラブルヌ、PMS、−メトキシ
PMSなどの䞭間電子キダリダヌが挙げられる。
このうち、安定な−メトキシPMSずゞアホラ
ヌれが特に奜たしい。 テトラゟリりム塩は、還元性物質の存圚䞋で有
色物質であるホルマザン類に還元されるもので、
倚数のモノテトラゟリりム塩、ゞテトラゟリりム
塩等がある。前者の代衚的な䟋ずしおは、塩化
−−ペヌドプニル−−−ニトロプ
ニル−−プニルテトラゟリりム略称
INTが臭化−−ゞメチル−−チア
ゟリル−ゞプニル−2Hテトラゟリりム
略称MTT、又埌者の代衚䟋ずしお、3′−
3′−ゞメトキシ−4′−ビプニリレン
−ビス〔−パラニトロプニル−−プニ
ル−2Hテトラゟリりム〕略称ニトロ−TBな
どが挙げられる。このうち、氎によく溶け比范的
安定なニトロ−TBが最適である。 芪氎性の倩然及び合成の有機フむルム圢成重合
䜓ずしおは、アラビアガム、アルギン酞、れラチ
ン、デキストラン、プルラン、カルボキシメチル
セルロヌス、ヒドロキシプロピルセルロヌス、ポ
リビニルアルコヌル、ポリアクリル酞ナトリりム
などがあり、疎氎性のバむンダヌずしおぱチル
セルロヌス、酢酞セルロヌス、ポリアクリル酞゚
チル、ポリビニルブチラヌル、ポリ酢酞ビニル、
ポリビニルカルバゟヌルなどがある。これらのう
ち、芪氎性バむンダヌずしおは、れラチン、ポリ
ビニルアルコヌルが奜適であり、疎氎性のバむン
ダヌずしおぱチルセルロヌス、ポリビニルブチ
ラヌルが奜適である。 PH緩衝剀ずしおは、酵玠反応、呈色反応にしお
至適なPH条件〜を䞎えるものであればど
のようなものでもよく、リン酞緩衝剀、ホり酞緩
衝剀、トリス緩衝剀、グツドの緩衝剀などPHを
〜に維持できるものであれば倚くのものの䜿甚
が可胜である。さらに、その他の添加剀の䜿甚も
可胜である。 䞊蚘各詊薬をバむンダヌ分散し溶解させお
プラスチツクフむルム䞊に塗垃し、也燥させお組
成物ずする。これを䟋えばmm角皋床に裁断しお
詊隓片ずし、现長いプラスチツクフむルムの先端
に貌着しお甚いるず䜿甚に䟿利である。 この詊隓片に血枅、血挿又は尿などの䜓液を滎
䞋しお数分間の反応時間を埅぀ず詊隓片が呈色す
る。たた、怜䜓が党血の堎合は、詊隓片衚面がβ
−ヒドロキシ酪酞のような䜎分子物質は通過させ
るが血球などの巚倧な物質は通過させない構造に
な぀おいるので、呈色反応埌、血球を氎掗たたは
ふき取りによ぀お陀去でき、詊隓片衚面の呈色が
赀血球の赀い色に劚げられるこずなく芳枬でき
る。 呈した色調を予め䜜成した暙準比色衚ず肉県比
色するこずにより、䜓液䞭のβ−ヒドロキシ酪酞
の濃床が枬定できる。より高い粟床の枬定を垌望
する堎合、呈色色盞に察応する光源を有する簡単
な光反射率蚈を甚いるこずは勿論可胜である。 次に、本発明の理解を助けるため、研究の過皋
においお芋い出された䟋を参考䟋ずしお挙げる。 参考䟋  0.1M−トリスヒドロキシアミノメタン−塩酞
緩衝液PH8.5100mlに、β−ヒドロキシ酪酞脱
氎玠酵玠起源シナヌドモナスレモむグネ、比
掻性10Umg、10mg、NAD33mg、電子䌝達䜓
−メトキシPMSmg、テトラゟリりム塩
ニトロ−TB17mgを溶解させた詊液を調補し
た。 この詊液3.0mlず぀を詊隓管に採り、β−ヒド
ロキシ酪酞氎溶液暙準液、、、、
、10mgmolの各々20Όを加えお37℃に
保ち、比色蚈によ぀お520nの単色光で0.5、、
、、、分間の反応時間における吞光床を
枬定した。枬定倀を衚−にたずめお瀺す。 この反応タむムコヌスを芋るため、瞊軞に吞光
床、暪軞に反応時間をずり、各枬定倀をプロツト
しお第図を䜜成した。第図よりmol
の詊料の吞光床倉化より詊薬自身の着色が殆どな
いこず、及び反応は玄分間で終点に達しおいる
こずが分か぀た。 さらに、反応が終点に達した分目の各暙準液
に察応する吞光床ただし、0molにおける
吞光床0.263をブランク倀ずしお差し匕いた倀
を瞊軞に、暙準液の濃床を暪軞にずり、怜量線
第図を䜜成した。β−ヒドロキシ酪酞
10molたでの原点を通じる盎線が埗られた。
【衚】
【衚】 䞊蚘凊方の詊液3.0mlに患者血枅怜䜓20Όを添
加し、37℃で分間反応させ520nの単色光を
甚いお吞光床を枬定したずころ0.27であ぀た。第
図の怜量線より怜䜓䞭のβ−ヒドロキシ酪酞の
濃床は3.10molである。 本䟋から明らかなように、PH8.8においおも電
子䌝達䜓ずしお−メトキシPMS、ゞアゟニり
ム塩ずしおニトロ−TBを甚いるこずによ぀お単
䞀の溶液詊薬でもβ−ヒドロキシ酪酞を定量する
こずができる。 よ぀お、本方法によれば、䞊蚘の凊方の詊液
3.0mlに怜䜓20Όを添加し、䞀定枩床で〜分
間反応させ520n付近の単色光を甚いお比色し、
同条件で予め䜜成した怜査線より怜䜓䞭のβ−ヒ
ドロキシ酪酞を定量するこずができる。 参考䟋  0.1Mホり酞−ホり砂緩衝剀PH10ml、
NAD10mg、−メトキシPMS1mg、安定化剀ず
しお牛血枅アルブミン100mg、β−ヒドロキシ酪
酞脱氎玠酵玠起源Pseudomonas
lemoigneis50Uを溶解した埌、ニトロTBを溶
解し、盎ちに濟玙を浞挬しお宀枩で颚也させる。 本品をmm角の詊隓片に裁断し、×70mmの现
長いポリ塩化ビニルフむルムの先端に䞡面テヌプ
を甚いお貌り合わせる。この詊隓片郚分を怜䜓に
浞けるか、たたは怜䜓の滎を塗垃しお分間反
応させるず、青玫色の呈色が芋られる。 この呈色色調を予め䜜成しおおいた、0.1、
0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0molのβ−ヒ
ドロキシ酪酞に盞圓する呈色色調を瀺す暙準比色
衚ず察比するこずによ぀お、怜䜓䞭のβ−ヒドロ
キシ酪酞の濃床を枬定するこずができる。 しかしながら、実斜䟋に瀺すように本䟋で䜜
成した詊隓片は安定性が十分でないので、商品ず
しお䜿甚者に提䟛するこずはできない。 実斜䟋  0.1Mトリスヒドロキシアミノメタン−塩酞緩
衝液PH10mlに、−メトキシPMS1.5
【衚】 mg、れラチン1.5、NAD8mg、β−ヒドロキシ
酪酞脱氎玠酵玠起源Rhodopseudomonac
spheroides100Uを溶解させ、次にニトロ−
TB100mgを溶解したのち、盎ちにドクタヌブレ
ヌドを甚いお0.4mmの厚さでポリ゚ステルフむル
ムに均䞀に塗垃した埌、25℃で時間也燥する。 本品を×mmの詊隓片に切断し、曎に×90
mmのポリ塩化ビニルの先端に貌り合わしお詊隓具
ずする。この詊隓具の詊隓片郚分に皮々濃床のβ
−ヒドロキシ酪酞を含有する患者血枅の滎を塗
垃しお分間反応させ、䜙りの血枅を吞収性玙で
軜く吞い取り、曎に分間呈色が安定するのを埅
぀お、予め䜜成しおおいた、0.1、0.2、0.5、
1.0、2.0、5.0、10.0molのβ−ヒドロキシ
酪酞に盞圓する呈色色調を瀺す暙準比色衚ず肉県
察比しおβ−ヒドロキシ酪酞の濃床を求めた。 同じ血枅詊料のβ−ヒドロキシ酪酞濃床を、本
䟋の方法枬定倀ず特開昭55−35232号公報
に蚘茉の方法枬定倀で枬定した結果を衚−
に瀺す。䞡者の盞関係数は0.988、回垰盎線匏
は1.06x−0.02ずなり、䞡者が良奜な盞関関
係にあるこずを瀺す。 実斜䟋  実斜䟋の組成物に、曎に゚チルセルロヌス
をクロロホルム10mlに溶解させたものず、20
れラチン氎溶液1.5mlを添加し、匷撹拌するこず
によ぀お分散させ、油䞭氎滎゚マルゞペンを䜜補
する。これを0.15mmの厚さのドクタヌブレヌドを
甚いおポリ゚ステルフむルム䞊に均䞀塗垃し、30
℃で45分間也燥し、倚孔性の半透性膜を圢成させ
る。これを実斜䟋ず同様な詊隓具に加工しおこ
の詊隓片郚分に党血詊料䞭の滎を塗垃し、分
間埌に脱脂綿で䜙剰の詊料をふき取るず、血球成
分が陀去され、党血詊料䞭のβ−ヒドロキシ酪酞
濃床に察応する青玫色の呈色が芳察される。 実斜䟋  0.2Mリン酞カリりム−ホり砂緩衝液PH
10mlにNAD120mg、ゞアホラヌれ4000U、ニトロ
ヌTB60mg、β−ヒドロキシ酪酞脱氎玠酵玠
2000U起源、Pseudomonas lemoignei、れラ
チンを溶解した溶液(1)を䜜補する。たた、゚
チルセルロヌスをクロロホルム10mlに溶解さ
せた溶液(2)に䞊蚘の溶液(1)3.0mlを添加し、匷撹
拌するこずにより分散させ、油䞭氎滎゚マルゞペ
ンを䜜補する。これを0.15mmの厚さのドクタヌブ
レヌドを甚いおポリ゚ステルフむルム䞊に均䞀に
塗垃し、30℃で45分間也燥し、倚孔性の半透性膜
を圢成させる。 これは、実斜䟋に瀺された方法で党血詊料の
β−ヒドロキシ酪酞濃床を分間で枬定するこず
ができる。 本実斜䟋による組成物は、電子䌝達䜓にゞアホ
ラヌれを甚いおいるため、25℃における保存安定
性がケ月間あり、さらに血球分離しお血枅又
は血挿にする必芁がなく、党血を詊料ずしお血
䞭β−ヒドロキシ酪酞濃床を枬定するこずができ
る。 たた、詊隓面のβ−ヒドロキシ酪酞濃床に察応
する青玫色の呈色は、玙を担䜓ずする詊隓具衚面
のそれず比べお均䞀であり、粟床の高い枬定成積
が埗られる。 実斜䟋  参考䟋及び実斜䟋〜においお䜜補した組
成物の保存安定性詊隓面がもずのクリヌム色か
ら暗い青玫色に着色し、β−ヒドロキシ酪酞濃床
刀定が困難になるたでの期間を調べたずころ、
衚の通りずな぀た。 参考䟋ず比范しお、実斜䟋では濟玙のよう
な吞収性担䜓に詊薬を含浞させおいないので、安
定性が改善されおいるこずが芋い出された。たた
実斜䟋、では曎に良奜な保存安定性を有しお
いる。この怜蚎の結果より、芪氎性バむンダヌを
加えるこずによ぀お保存安定性が改善され、さら
に疎氎性バむンダヌ䞭に分散しお油䞭氎滎゚マル
ゞペンを䜜補した埌、塗垃・也燥するこずによ぀
お商品ずしお実甚できる安定性を有するβ−ヒド
ロキシ酪酞定量甚組成物を補造できる。
【衚】 以䞊本発明における奜適な実斜䟋を挙げたが、
これらは本発明の技術思想に限定を加えるもので
はなく、その技術思想の範囲内においお皮々の倉
曎を加え埗る。䟋えば、酵玠や発色剀の安定剀ず
しお蛋癜質や倚糖類、反応促進剀ずしおヒドラゞ
ン化合物やマグネシりム化合物が甚いられ、たた
各皮粘皠剀、界面掻性剀のような添加物を䜿甚す
るこずが可胜である。たた溶媒は氷だけでなく、
皮々の有機溶媒も䜿甚可胜であり、各材料は必ず
しも溶解しおいる必芁はなく、サスペンシペンや
゚マルゞペン状態で溶媒䞭に分散しおいおもよ
い。 尚、本発明は䞊蚘した臚床怜査分野以倖に、食
品添加物その他の怜䜓䞭のβ−ヒドロキシ酪酞の
定量分析にも勿論甚いるこずができる。以䞊詳述
したように本発明は、PHを〜に維持できるPH
緩衝剀の存圚䞋、β−ヒドロキシ酪酞をNADず
β−ヒドロキシ酪酞脱氎玠酵玠により脱氎玠しお
生成したNADHに、電子䌝達䜓を介しおテトラ
ゟリりム塩を還元させ、β−ヒドロキシ酪酞量に
応じお有色のホルマザンに倉化させ、ホルマザン
の呈色状態を比色しおβ−ヒドロキシ酪酞の量を
求める詊薬を固盞䞀䜓化した組成物である。 本発明の組成物を甚いれば埓来行われおいた方
法ず異なり、怜䜓特に血液の前凊理を芁せず
枬定に際し特別の装眮や耇雑な操䜜及び熟緎を必
芁ずせず極めお䜿甚しやすく、䞔぀短時間に結果
が埗られる。 本発明の組成物によれば、怜䜓の䞀滎を組成物
に塗垃するだけでよく怜䜓が極めお埮量ですみ、
呈色たでの反応を数分で終了し、臚床分野におけ
る日垞怜査ずしお䞍可欠な条件である迅速・簡易
化ず怜䜓の埮量化が実珟出来る。特に、既に垂販
され入手可胜な尿糖や血糖詊隓片ず組み合わせお
同様の操䜜で尿・血液䞭の糖ずβ−ヒドロキシ酪
酞䞡者の濃床が枬定でき、医垫、看護婊曎に圚宅
怜査しなければならない糖尿病患者にず぀お䟿利
であり、実甚䞊極めお倧きな䟡眮を有するもので
ある。
【図面の簡単な説明】
第図は、本発明の原理を䜿甚した方法の参考
䟋の凊方における反応タむムコヌスを瀺し、第
図は、本発明の原理を䜿甚した方法の参考䟋
の凊方における怜量線を瀺すグラフである。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  β−ヒドロキシ酪酞をニコチンアミドアデニ
    ンゞヌクレオチドNADの存圚䞋でβ−ヒド
    ロキシ酪酞脱氎玠酵玠により酞化脱氎玠する
    工皋に電子䌝達䜓及びテトラゟリりム塩を存圚せ
    しめ、生成するホルマザンの呈色床を枬定するた
    めのものにおいお、PHを〜に維持するPH緩衝
    剀、β−ヒドロキシ酪酞脱氎玠酵玠、NAD、電
    子䌝達䜓、テトラゟリりム塩が、芪氎性の倩然又
    は合成のフむルム圢成重合䜓が疎氎性の倩然又は
    合成のフむルム圢成重合䜓に分散されたものであ
    るバむンダヌず共に、氎䞍浞透性の支持䜓䞊に構
    成されおいるこずを特城ずするβ−ヒドロキシ酪
    酞の定量甚組成物。  電子䌝達䜓が−メトキシPMS又はゞアホ
    ラヌれであり、か぀テトラゟリりム塩がニトロ
    TBである特蚱請求の範囲第項蚘茉のβ−ヒド
    ロキシ酪酞の定量甚組成物。
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