CN110079581A - 一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒由相互独立的试剂R1和试剂R2组成；所述试剂R1由以下组分组成：TRIS缓冲液：12‑13g/L；L‑天门冬氨酸钾：40‑60g/L；苹果酸脱氢酶：2.5‑4KU/L；抗细胞型AST单抗：15mg/L‑25mg/L；NADH：6‑8g/L；溶剂为纯化水；所述试剂R2由以下组分组成：TRIS缓冲液：12‑13g/L；α‑酮戊二酸:10‑12g/L；溶剂为纯化水。本发明所述的检测试剂盒及检测方法定量能力好、耗时短、能批量快速检测、重复性好、稳定性好、操作简单、价格低廉，可应用于多种品牌开放通道的临床生化分析仪。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的检测试剂盒及检测方法。
背景技术
天门冬氨酸转氨酶(AST)广泛分布于心、肝、肺、骨骼肌、肾、胰腺等组织细胞中。在心肌细胞中的含量最高，其次为肝细胞。AST有2种同工酶，一种是位于胞浆内的天门冬氨酸转氨酶胞浆同工酶(s-AST)；另一种是位于细胞线粒体内的天门冬氨酸转氨酶线粒体同工酶(m-AST)。血清中的2种同工酶浓度的变化有着不同的临床意义，其中m-AST同工酶能够比较客观地反映一些疾病的严重程度，作为一些疾病指导治疗及预后判断的指标。近年来对m-AST的研究越来越多，现有m-AST的检测方法主要如下所述：因m-AST含量低，电泳法需要复杂的染色过程及高精密度的光密度扫描计，不适用于临床大规模标本分析；离子交换柱层析法，此方法不适于大批量操作；酶免疫法自动化程度较低；放射免疫法有放射污染；试剂保存期限短等以上方法均不能作为临床常规项目开展的问题。以上检测方法均操作繁琐，精度低，定量能力差，且耗时长，不能快速检测。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种定量能力好、耗时短、能批量快速检测、重复性好、稳定性好、操作简单、价格低廉，可应用于多种品牌开放通道的临床生化分析仪的天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的检测试剂盒及检测方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的检测试剂盒，所述试剂盒由相互独立的试剂R1和试剂R2组成；
所述试剂R1由以下组分组成：
TRIS缓冲液： 12-13g/L；
L-天门冬氨酸钾： 40-60g/L；
苹果酸脱氢酶： 2.5-4KU/L；
抗细胞型AST单抗： 15mg/L-25mg/L；
NADH： 6-8g/L；
溶剂为纯化水；
所述试剂R2由以下组分组成：
TRIS缓冲液： 12-13g/L；
α-酮戊二酸： 10-12g/L；
溶剂为纯化水。
进一步的，所述试剂R1试剂的配制方法为：将TRIS缓冲液溶于纯化水，搅拌均匀，配制得试剂R1缓冲液，按照试剂R1组分含量将L-天门冬氨酸钾、苹果酸脱氢酶、抗细胞型AST单抗、NADH依次溶于制得的试剂R1缓冲液中，混合均匀后用HCL调节其PH为9.05±0.2。
进一步的，所述试剂R2试剂的配制方法为：将TRIS缓冲液溶于纯化水，搅拌均匀，配制得试剂R2缓冲液，按照试剂R2组分含量将α-酮戊二酸溶于制得的试剂R2缓冲液中，混合均匀后用HCL调节其PH为5.86±0.1。
一种应用上述检测试剂盒测定天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的方法，包括如下步骤：
1)将25ul待测样本与200ul试剂R1混合，37℃孵育5min后，加入50ul试剂R2混合均匀，孵育1min用全自动生化仪在主波长340nm处测定其吸光度A1；
2)用全自动生化仪在主波长340nm处连续检测2min，记录每个测光点的吸光度A2与A1的差值与相差的分钟的比值，计算各个测光点的吸光度变化率△A/min的平均值，即为待测样本的吸光度变化率(△A样本/min)；
3)利用如下公式计算待测样本的m-AST浓度：
样品m-AST浓度(U/L)＝△A样本/min/△A校准品/min*校准品浓度(U/L)；
4)自动生化仪上的检测方法为速率法，反应方向为下降反应，从开始到结束需10分钟。
相对于现有技术，本发明所述的一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的检测试剂盒及检测方法具有以下优势：
本发明所述的一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的检测试剂盒及检测方法定量能力好、耗时短、能批量快速检测、重复性好、稳定性好、操作简单、价格低廉，可应用于多种品牌开放通道的临床生化分析仪。
本检测试剂盒中的试剂R1中的L-天门冬氨酸钾解决了L-天门冬氨酸难溶于水的问题，试剂配制操作更简单，缩短了操作时间；试剂R1中只应用了一种苹果酸脱氢酶便可达到预期的检测效果，减少了成本，试剂配制更加简单，缩短了操作时间；试剂R1中添加了抗细胞型AST单抗，其特异性好，价格低廉，容易获得。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的检测试剂盒，所述试剂盒由相互独立的试剂R1和试剂R2组成；
所述试剂R1由以下组分组成：
TRIS缓冲液： 12-13g/L；
L-天门冬氨酸钾： 40-60g/L；
苹果酸脱氢酶： 2.5-4KU/L；
抗细胞型AST单抗： 15mg/L-25mg/L；
NADH： 6-8g/L；
溶剂为纯化水；
所述试剂R2由以下组分组成：
TRIS缓冲液： 12-13g/L；
α-酮戊二酸： 10-12g/L；
溶剂为纯化水。
所述试剂R1试剂的配制方法为：将TRIS缓冲液溶于纯化水，搅拌均匀，配制得试剂R1缓冲液，按照试剂R1组分含量将L-天门冬氨酸钾、苹果酸脱氢酶、抗细胞型AST单抗、NADH依次溶于制得的试剂R1缓冲液中，混合均匀后用HCL调节其PH为9.05±0.2。
所述试剂R2试剂的配制方法为：将TRIS缓冲液溶于纯化水，搅拌均匀，配制得试剂R2缓冲液，按照试剂R2组分含量将α-酮戊二酸溶于制得的试剂R2缓冲液中，混合均匀后用HCL调节其PH为5.86±0.1。
一种应用上述检测试剂盒测定天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的方法，包括如下步骤：
1)将25ul待测样本与200ul试剂R1混合，37℃孵育5min后，加入50ul试剂R2混合均匀，孵育1min用全自动生化仪在主波长340nm处测定其吸光度A1；
2)用全自动生化仪在主波长340nm处连续检测2min，记录每个测光点的吸光度A2与A1的差值与相差的分钟的比值，计算各个测光点的吸光度变化率△A/min的平均值，即为待测样本的吸光度变化率(△A样本/min)；
3)利用如下公式计算待测样本的m-AST浓度：
样品m-AST浓度(U/L)＝△A样本/min/△A校准品/min*校准品浓度(U/L)；
4)自动生化仪上的检测方法为速率法，反应方向为下降反应，从开始到结束需10分钟。
实施1：
一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的检测试剂盒，所述试剂盒由相互独立的试剂R1和试剂R2组成；
所述试剂R1由以下组分组成：
TRIS缓冲液： 12g/L；
L-天门冬氨酸钾： 50g/L；
苹果酸脱氢酶： 3KU/L；
抗细胞型AST单抗： 20mg/L；
NADH： 7g/L；
溶剂为纯化水；
R1试剂的配制：将TRIS缓冲液溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R1缓冲液，按照上述试剂R1组分含量将L-天门冬氨酸钾、苹果酸脱氢酶、抗细胞型AST单抗、NADH依次溶于制得的R1缓冲液中，混合均匀后用HCL调节其pH为9.10。
所述试剂R2由以下组分组成：
TRIS缓冲液： 12g/L；
α-酮戊二酸： 11g/L；
R2试剂的配制：将TRIS缓冲液溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R2缓冲液，按照试剂R2组分含量将α-酮戊二酸溶于制得的R2缓冲液中，混合均匀后用HCL调节其pH为5.9。
一种应用上述检测试剂盒测定天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的方法，包括如下步骤：
1)将25ul待测样本与200ul试剂R1混合，37℃孵育5min后，加入50ul试剂R2混合均匀，孵育1min用全自动生化仪在主波长340nm处测定其吸光度A1；
2)用全自动生化仪在主波长340nm处连续检测2min，记录每个测光点的吸光度A2与A1的差值与相差的分钟的比值，计算各个测光点的吸光度变化率△A/min的平均值，即为待测样本的吸光度变化率(△A样本/min)；
3)利用如下公式计算待测样本的m-AST浓度：
样品m-AST浓度(U/L)＝△A样本/min/△A校准品/min*校准品浓度(U/L)。
采用速率法，反应方向为下降反应从开始到结束仅需10分钟，耗时短，操作简单，精度高，定量能力好，具体测定参数见表1。
表1实施例1测定参数
实施2：
一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的检测试剂盒，所述试剂盒由相互独立的试剂R1和试剂R2组成；
所述试剂R1由以下组分组成：
TRIS缓冲液： 12.114g/L；
L-天门冬氨酸钾： 60g/L；
苹果酸脱氢酶： 2.5KU/L；
抗细胞型AST单抗： 25mg/L；
NADH： 8g/L；
溶剂为纯化水；
R1试剂的配制：将TRIS缓冲液溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R1缓冲液，按照上述试剂R1组分含量将L-天门冬氨酸钾、苹果酸脱氢酶、抗细胞型AST单抗、NADH依次溶于制得的R1缓冲液中，混合均匀后用HCL调节其pH为9.20。
所述试剂R2由以下组分组成：
TRIS缓冲液： 12.5g/L；
α-酮戊二酸： 12g/L；
R2试剂的配制：将TRIS缓冲液溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R2缓冲液，按照试剂R2组分含量将α-酮戊二酸溶于制得的R2缓冲液中，混合均匀后用HCL调节其pH为5.8。
一种应用上述检测试剂盒测定天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的方法，包括如下步骤：
1)将25ul待测样本与200ul试剂R1混合，37℃孵育5min后，加入50ul试剂R2混合均匀，孵育1min用全自动生化仪在主波长340nm处测定其吸光度A1；
2)用全自动生化仪在主波长340nm处连续检测2min，记录每个测光点的吸光度A2与A1的差值与相差的分钟的比值，计算各个测光点的吸光度变化率△A/min的平均值，即为待测样本的吸光度变化率(△A样本/min)。
3)利用如下公式计算待测样本的m-AST浓度。
样品m-AST浓度(U/L)＝△A样本/min/△A校准品/min*校准品浓度(U/L)。
采用速率法，反应方向为下降反应从开始到结束仅需10分钟，耗时短，操作简单，精度高，定量能力好，具体测定参数见表2。
表2实施例2测定参数
实施例3
一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的检测试剂盒，所述试剂盒由相互独立的试剂R1和试剂R2组成；
所述试剂R1由以下组分组成：
TRIS缓冲液： 12.8g/L；
L-天门冬氨酸钾： 55g/L；
苹果酸脱氢酶: 3KU/L；
抗细胞型AST单抗: 22mg/L；
NADH: 7.5g/L；
溶剂为纯化水；
R1试剂的配制：将TRIS缓冲液溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R1缓冲液，按照上述试剂R1组分含量将L-天门冬氨酸钾、苹果酸脱氢酶、抗细胞型AST单抗、NADH依次溶于制得的R1缓冲液中，混合均匀后用HCL调节其pH为9.18。
所述试剂R2由以下组分组成：
TRIS缓冲液： 12.8g/L；
α-酮戊二酸： 11.5g/L；
R2试剂的配制：将TRIS缓冲液溶于纯化水，搅拌均匀，配制得R2缓冲液，按照试剂R2组分含量将α-酮戊二酸溶于制得的R2缓冲液中，混合均匀后用HCL调节其pH为5.79。
一种应用上述检测试剂盒测定天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的方法，包括如下步骤：
1)将25ul待测样本与200ul试剂R1混合，37℃孵育5min后，加入50ul试剂R2混合均匀，孵育1min用全自动生化仪在主波长340nm处测定其吸光度A1；
2)用全自动生化仪在主波长340nm处连续检测2min，记录每个测光点的吸光度A2与A1的差值与相差的分钟的比值，计算各个测光点的吸光度变化率△A/min的平均值，即为待测样本的吸光度变化率(△A样本/min)；
3)利用如下公式计算待测样本的m-AST浓度：
样品m-AST浓度(U/L)＝△A样本/min/△A校准品/min*校准品浓度(U/L)。
采用速率法，反应方向为下降反应从开始到结束仅需10分钟，耗时短，操作简单，精度高，定量能力好，具体测定参数见表3。
表3实施例3测定参数
本发明所述的一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的检测试剂盒及检测方法定量能力好、耗时短、能批量快速检测、重复性好、稳定性好、操作简单、价格低廉，可应用于多种品牌开放通道的临床生化分析仪。
本检测试剂盒中的试剂R1中的L-天门冬氨酸钾解决了L-天门冬氨酸难溶于水的问题，试剂配制操作更简单，缩短了操作时间；试剂R1中只应用了一种苹果酸脱氢酶便可达到预期的检测效果，减少了成本，试剂配制更加简单，缩短了操作时间；试剂R1中添加了抗细胞型AST单抗，其特异性好，价格低廉，容易获得。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由相互独立的试剂R1和试剂R2组成；
所述试剂R1由以下组分组成：
溶剂为纯化水；
所述试剂R2由以下组分组成：
TRIS缓冲液： 12-13g/L；
α-酮戊二酸： 10-12g/L；
溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1试剂的配制方法为：将TRIS缓冲液溶于纯化水，搅拌均匀，配制得试剂R1缓冲液，按照试剂R1组分含量将L-天门冬氨酸钾、苹果酸脱氢酶、抗细胞型AST单抗、NADH依次溶于制得的试剂R1缓冲液中，混合均匀后用HCL调节其PH为9.05±0.2。
3.根据权利要求1所述的一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R2试剂的配制方法为：将TRIS缓冲液溶于纯化水，搅拌均匀，配制得试剂R2缓冲液，按照试剂R2组分含量将α-酮戊二酸溶于制得的试剂R2缓冲液中，混合均匀后用HCL调节其PH为5.86±0.1。
4.一种应用权利要求1-3任一项所述的检测试剂盒测定天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将25ul待测样本与200ul试剂R1混合，37℃孵育5min后，加入50ul试剂R2混合均匀，孵育1min用全自动生化仪在主波长340nm处测定其吸光度A1；
2)用全自动生化仪在主波长340nm处连续检测2min，记录每个测光点的吸光度A2与A1的差值与相差的分钟的比值，计算各个测光点的吸光度变化率△A/min的平均值，即为待测样本的吸光度变化率(△A样本/min)；
3)利用如下公式计算待测样本的m-AST浓度：
样品m-AST浓度(U/L)＝△A样本/min/△A校准品/min*校准品浓度(U/L)；
4)自动生化仪上的检测方法为速率法，反应方向为下降反应，从开始到结束需10分钟。
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