CN106190996B

CN106190996B - 一种葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体

Info

Publication number: CN106190996B
Application number: CN201610778492.6A
Authority: CN
Inventors: 邹炳德; 邹继华; 汪屹; 贾江花
Original assignee: Meikang Biological Polytron Technologies Inc
Current assignee: Meikang Biological Polytron Technologies Inc
Priority date: 2016-08-30
Filing date: 2016-08-30
Publication date: 2019-05-21
Anticipated expiration: 2036-08-30
Also published as: CN106190996A

Abstract

一种葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体；该突变体为将具有SEQID.No.1所示的氨基酸序列的葡萄糖6磷酸脱氢酶中的44位甘氨酸突变为缬氨酸、319位的甘氨酸突变为缬氨酸获得的突变体，与突变前的SEQID.No.1所示的氨基酸序列的葡萄糖6磷酸脱氢酶相比，具有更高的热稳定性。本发明具有热稳定性高、抑制率高，该突变酶能够作为多种小分子检测试剂盒的原料，使所得试剂盒具有较高的稳定性和灵敏度。

Description

一种葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体说是提供一种热稳定性高、抑制率高的葡萄糖6磷酸脱氢酶(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)突变体，该突变酶可以作为诊断试剂盒的重要原料。

背景技术

在临床检验领域，小分子激素以及治疗药物的检测的方法主要有RIA，Elisa，化学发光，质谱，均相酶免技术等。其中RIA技术由于有放射性污染，目前已经被淘汰；Elisa技术是较RIA技术更为先进，没有放射性污染，然而整个过程为非均相模式，需要多次洗板，一轮检测需要至少2小时以上，出报告时间太长；化学发光技术具有灵敏度高的特点，检测时间只需十几分钟，但是该方法仪器及试剂的成本均较高，往往只有大医院才具备开展该项目的实力，而且容易给患者增加经济负担；质谱法检测的优点是准确性高，一次可以检测不止一种小分子，但是样本前处理麻烦，自动化处理系统尚未推广，且所需质谱仪价格昂贵，初始投资大，国内开展的医院并不多，且多用于研究，临床应用更少；均相酶免技术的优势是反应是在均一的液体中进行，不需要分离，可在普通的生化仪上进行，反应时间10分钟左右即可出报告，该方法容易在各层级的医院中推广。

目前，均相酶免技术主要分为两类，一种是，克隆酶供体免疫分析(CDEIA)(美国专利：US4708929)，DNA重组技术可分别合成某种功能酶(如β-D半乳糖苷酶)分子的两个片段.大片段称为酶受体(EA)，小分子称作酶供体(ED)，两者单独均无酶活性，一定条件下结合形成四聚体方具酶活性。克隆酶供体免疫测定的反应模式为竞争法，测定原理为:标本中的抗原和酶供体(ED)标记的抗原与特异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不再能与酶受体(EA)结合，而游离的ED标记的抗原上的ED可和EA结合，形成具有活性的酶，加入底物测定酶活性，酶活力的大小与标本中抗原含量成比例。

另一种为：酶增强免疫测定技术(EMIT)(美国专利：US3875011)，其基本原理是半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受到影响而活性被抑制。反应后酶活力大小与标本中的半抗原量呈一定的比例，从酶活力的测定结果就可推算出标本中半抗原的量。

两种均相酶免技术都可以在生化仪上应用，相比较而言，EMIT技术所开发出来的试剂稳定性优于CDEIA，这是因为，EMIT技术所用的酶——葡萄糖6磷酸脱氢酶的稳定性优于CDEIA技术所用的酶——β-D半乳糖苷酶的ED、EA片段。所以前者的所开发试剂可以是液体的，而后者往往做成干粉形式。

即便如此，基于EMIT技术的试剂盒往往其稳定性也不够理想，液体试剂的有效期并不长，这与被标记后的葡萄糖6磷酸脱氢酶的稳定性有关。正是由于葡萄糖6磷酸脱氢酶的稳定性欠佳，加上小分子标记的影响，使得标记物的稳定性更差，从而导致试剂盒的有效期缩短。同时，使用EMIT技术的一个重要特点是葡萄糖6磷酸脱氢酶的活性中心必须能够被抗体所抑制，且应该有足够的抑制效率，已到达一定的灵敏度。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种具有热稳定性高、抑制率高的葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体，该突变酶能够作为多种小分子检测试剂盒的原料，使所得试剂盒具有较高的稳定性和灵敏度。

由于来自于Leuconostoc mesenteroides的葡萄糖6磷酸脱氢酶(其氨基酸序列1即SEQID.No.1所示序列，其核苷酸序列为序列2即SEQID.No.2所示序列)具有较高的比酶活和较低Km值的特点(非-专利文件1：Lee W.T.Lee WT,Flynn TG,Lyons C,Levy HR."Cloning of the gene and amino acid sequence for glucose 6-phosphatedehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides."J.Biol.Chem.266:13028-13034(1991))，因此该酶具有较高的应用前景，将其选为原始序列，利用基因工程技术来进行改造，以期提高其稳定性。

具体而言是利用随机突变的方法，提高葡萄糖6磷酸脱氢酶的稳定性，方法如下：

(1)以葡萄糖6磷酸脱氢酶的序列为模版，进行易错PCR扩增，建立突变文库；

(2)将所述突变文库转入大肠杆菌，并利用96孔板进行培养，并诱导表达；

(3)将细菌进行原位裂解，并利用测活试剂，筛选出热稳定性高的葡萄糖6磷酸脱氢酶；

本发明以核苷酸序列2为模板，设计

SEQID.No.3所示序列即引物序列3 5’-ATGGTTTCTGAAATCAAAACCC-3’和

SEQID.No.4所示序列即引物序列4 5’-ACCTTTGAAAACCCAAGCGTC-3’；

进行易错PCR，通过合理控制PCR反应体系中锰离子的浓度，将突变频率控制在1～2个核苷酸突变/1Kb核苷酸。将所获得的含突变核苷酸的片段纯化后，以含核苷酸序列2的pET-22b质粒(载体)为模板进行全质粒PCR(WHOP-PCR)(非-专利文件2:Miyazaki,K.(2003).Creating random mutagenesis libraries by megaprimer PCR of wholeplasmid(MEGAWHOP).Directed Evolution Library Creation,Springer:23-28)，所得产物用限制性内切酶DpnI进行酶切消化，去除模板质粒。之后，转化TOP10感受态细胞，涂布于含氨苄抗生素的LB固体平板上，所得克隆约为8000个，故该随机突变所获得的库容量约为8000个。

将所得克隆用涂布棒混匀后，收集于离心管中，抽质粒，所得质粒转化BL21(ED3宿主菌或称为宿主细胞)，以备下一步筛选用。接着，将上述转化子接种于96孔板中，所用培养基为150ul LB/每孔，含氨苄抗生素，该孔板作为保留板。次日按照相同顺序转接至另一块96孔板中，所用培养基为150ul LB/每孔，同时添加氨苄抗生素和IPTG进行诱导，于37℃下培养6小时，3800rpm离心收菌，去掉培养基，该孔板作为分析板。

在分析板中加入150ul裂解液(100mM Tris，pH8.0；0.4mg/ml脱氧胆酸钠；0.8mg/ml CTAB；20mM KCl；80mM MgSO₄)。于室温下裂解半小时后，3800rpm离心15分钟，取50ul裂解液于一块新的96孔板中。另取50ul裂解液于96孔PCR板中，置于96孔PCR仪中，在50℃下加热处理15分钟，转移至另一块96孔板中。在上述两块中分别加入100ul的反应液(Tris，100mM，pH7.4；葡萄糖溶液，100mM；NADP，5mM；ATP，5mM；MgCl₂，5mM；己糖激酶，10KU/L；BSA，0.05mg/ml)。通过30分钟的显色，利用酶标仪记录其340nm处吸光值。通过计算两者吸光度的比值，判断热处理后的粗酶液的残留酶活比例。对于热稳定性提高了的突变株，其理论上的酶活残留比例将较野生型高。

本发明通过对8000多个突变株的筛选后，总共筛选获得了3个热稳定性有所提高的突变株。经测序分析，发现这3个突变株的突变序列分别为：突变株A：131G→T，突变株B：131G→T，956G→T，突变株C：1045G→T；相应的氨基酸突变分别为：突变株A：44G→V，突变株B：44G→V，319G→V，突变株C：349D→Y；通过分析发现，这三个突变株总共有三个位点的突变，即44G→V，319G→V，349D→Y突变，因此，为了了解每个突变位点的影响，额外构建了第四个突变株D：319G→V。再分别对四个突变株进行表达纯化以及酶学性质验证。最终发现，单位点突变株A、C、D对热稳定性的提高非常有限，即T₅₀较野生型均提高小于0.5℃，其中突变株C还使得比酶活损失约50％，双位点突变株的T₅₀较野生型提高约3.5℃，明显较44位点和319位点单独突变的和要高，这推测可能是由于一定的协同作用使得稳定性有较大幅地提高。鉴于此，选择突变株B：44G→V，319G→V作为后续模版。

考虑到该酶可用于均相酶免技术，因此考虑合适的小分子偶联位点也十分重要，一个好的酶应当是具有较高的比酶活，且在偶联了小分子后其比酶活、稳定性等均不会有太大的损失，更重要的是，当相应的小分子抗体与小分子-酶偶联物结合后，能够较大程度地抑制酶活，这样才能使所开发的试剂盒有较高的灵敏度。

通过分析葡萄糖6磷酸脱氢酶的序列，该酶没有含半光氨酸，因此可以考虑在该酶内突变引入半胱氨酸，通过巯基可以定向偶联小分子，在通过分析该酶的晶体结构发现位于216位的丝氨酸处于底物结合位点附近，且丝氨酸与半胱氨酸结构类似，可以考虑为突变位点。因此分别在野生型及突变株B的基础上引入突变216S-C，获得突变株E和F。通过对这两个新获得的突变株进行表达纯化，以及相应的酶学性质分析，发现其比酶活与野生型相差无几。

为了验证所获得的突变株是否有抑制率，拟利用生物素、亲和素系统来验证，众所周知，生物素与亲和素能够特异性结合，且其具有非常高的亲和力，应用十分广泛，其中生物素的分子量约243，相当于小分子，而亲和素的分子量约为240KD，由4个60KD的单体组成，相当于抗体。通过该实验，发现突变株E具有50％左右的抑制率，而出人意料地，突变株F具有60％左右的抑制率，且稳定性较高，因此突变株F具有较好的应用前景。

综上可以获得，本发明的一种葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体，其为将具有SEQID.No.1所示的氨基酸序列中的44位甘氨酸突变为缬氨酸、319位的甘氨酸突变为缬氨酸获得的葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体，与突变前的SEQID.No.1所示的氨基酸序列葡萄糖6磷酸脱氢酶相比，具有更高的热稳定性。

更进一步的，本发明的一种葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体，其为将具有SEQID.No.1所示的氨基酸序列中的44位甘氨酸突变为缬氨酸、319位的甘氨酸突变为缬氨酸、以及216位的丝氨酸突变为半光氨酸获得的葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体，与突变前的SEQID.No.1所示的氨基酸序列葡萄糖6磷酸脱氢酶相比，具有更高的热稳定性及抑制率。

本发明还提供一种编码上述葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体的基因。

本发明所提供的葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体，具有比酶活高、热稳定性好、抑制率高等特点，适合应用于基于均相酶免试剂盒的开发。

这里值得说明的是，本发明还提供一种包含上述葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体的基因的重组载体，本发明所使用的载体为pET-22b；本发明还提供一种包含上述重组载体的宿主细胞，本发明的宿主菌(宿主细胞)为BL21(DE3)。根据一般常识，任何简单的进行载体更换，如pET-20b，pET-28b，pET-32a，pQE30，pTrc99a等，或者进行宿主菌更换，如Rosetta，Origami，M15等，都应当被认为具有相同的技术效果，都将被认为落入权利要求保护范围之内。任何在突变酶的N端或C端添加纯化标签，已经信号肽的行为，也应当被认为落入权利要求保护范围之内。

作为一般地，可以利用已经公知的酶的表达纯化技术来进行果糖氨基酸氧化酶的制备。例如，接种相应的突变株菌种，待OD₆₀₀生长至0.5～1时，进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，此时为了有利于其表达，可以选择低温诱导，如25℃，20℃，16℃等，根据诱导温度及表达情况，确定最适的诱导时间，以获得最佳的表达量。表达之后可以利用常规方法进行离心，超声破碎，SDS-PAGE检测表达量等。至于纯化时，可以利用重组酶所带的标签选择相应的方法。例如，若重组质粒含有His-tag，可以利用镍柱进行亲和纯化。

术语解释：

抑制率：抗体与小分子-酶偶联物结合后，对酶活的抑制比例，抑制率越高，越有利于基于竞争法的试剂盒的灵敏度。

T₅₀:是指在该温度下孵育30min后，所残留的酶活为原来50％时的温度，用于评价酶的热稳定性，温度越高稳定性越好，反之亦然。

小分子：是指分子量在100～2000之间，优选200～1000之间的小分子化合物，包括但不限于临床上检测常用的激素和药物等。

偶联：某一化合物通过共价键与酶上的氨基、羧基、巯基等相连。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但并不限于下述实施例。

实施例1

突变文库的构建

1、对于序列2所示的序列，利用全基因合成的方法进行合成(去除终止密码子)，并克隆至pET-22b载体上，所用酶切位点为NdeI和XhoI。以此得到的质粒pET-G6PD为以下易错PCR和WHOP-PCR的模板。

2、易错PCR反应体系及条件

表1 反应体系为100ul：

名称	体积(ul)
		dNTP Mixture(各2.5mM)	8
dTTP(100mM)	0.8
		dCTP(100mM)	0.8
10*PCR Buffer	10
		上游引物(5mM)，序列3	20
下游引物(5mM)，序列4	20
		MnCl<sub>2</sub>(5mM)	10
Mg<sup>2+</sup>(25mM)	14
		Taq酶(5U/ul)	1
模板(10ng/ul)	5
		水	12

反应条件为：

95℃5min；94℃30sec；55℃30sec；72℃2min；30个循环；72℃10min；4℃保存。

上述的MnCl₂用量可以适当进行调整，以便获得合适的突变频率，即1～2核苷酸突变/1Kb核苷酸。

3、WHOP-PCR反应体系及条件

将易错PCR获得的片段，大小约1.4Kb进行胶回收后，用作下一轮WHOP-PCR的引物。

表2 WHOP-PCR反应体系，50ul：

WHOP-PCR反应条件：

98℃30sec；98℃10sec；60℃10sec；72℃2.5min；24个循环；72℃5min；4℃保存。

4、酶切及转化

在50ul的WHOP-PCR的产物加入1ul的DpnI进行酶切，于37℃下反应2小时，以彻底除去模板DNA。

将上述酶切后的产物分5管转化TOP10感受态细胞，次日得到总共8000个单克隆以上的库容量。

实施例2

突变文库的筛选

1、培养、诱导、表达

将所得克隆用涂布棒混匀后，收集于离心管中，抽质粒，所得质粒转化BL21(ED3)，以备下一步筛选用。接着，将上述转化子接种于96孔板中，其中最后一个孔接种野生型菌株以作为对照，所用培养基为150ul LB/每孔，含氨苄抗生素，该孔板作为保留板。次日按照相同顺序转接至另一块96孔板中，所用培养基为150ul LB/每孔，同时添加氨苄抗生素和IPTG进行诱导，于37℃下培养6小时，3800rpm离心收菌，去掉培养基，该孔板作为分析板。

2、筛选

在分析板中加入150ul裂解液(100mM Tris，pH8.0；0.4mg/ml脱氧胆酸钠；0.8mg/ml CTAB；20mM KCl；80mM MgSO₄)。于室温下裂解半小时后，3800rpm离心15分钟，取50ul裂解液于一块新的96孔板中。另取50ul裂解液于96孔PCR板中，置于96孔PCR仪中，在50℃下加热处理15分钟，转移至另一块96孔板中。在上述两块中分别加入100ul的反应液(Tris，100mM，pH7.4；葡萄糖溶液，100mM；NADP，5mM；ATP，5mM；MgCl₂，5mM；己糖激酶，10KU/L；BSA，0.05mg/ml)。通过30分钟的显色，利用酶标仪记录其吸光值。通过计算两者吸光度的比值，判断热处理后的粗酶液的残留酶活比例。对于热稳定性提高了的突变株，其理论上的酶活残留比例将较野生型高。

本发明通过对8000多个突变株的筛选后，总共筛选获得了3个热稳定性有所提高的突变株。经测序分析，发现这3个突变株的突变序列分别为：突变株A：131G→T，突变株B：131G→T，956G→T，突变株C：1045G→T；相应的氨基酸突变分别为：突变株A：44G→V，突变株B：44G→V，319G→V，突变株C：349D→Y；通过分析发现，这三个突变株总共有三个位点的突变，即44G→V，319G→V，349D→Y突变，因此，为了了解每个突变位点的影响，额外构建了第四个突变株D：319G→V。将所获得的突变株A，B，C，D分别转化至BL21(ED3)中，并接种于LB培养基中，诱导表达，所获得的菌体用于纯化，其方法为常规方法，如由于表达时带有6*His标签，利用镍柱即可纯化。

实施例3

葡萄糖6磷酸脱氢酶的酶活测定及热稳定性分析

经纯化后的葡萄糖6磷酸脱氢酶，在100mM Tris，pH8.0的缓冲液中稀释成约0.1ug/ml。

取50ul该葡萄糖6磷酸脱氢酶于96孔PCR中，于40～50℃范围内选择8个梯度热处理30min，4℃保存。

将经热处理过的50ul葡萄糖6磷酸脱氢酶转移至96孔板上，同时取未加热过的葡萄糖6磷酸脱氢酶50ul于同一块96孔板上。于37℃保温10min。

加入事先已孵育至37℃的反应液(Tris，100mM，pH7.4；葡萄糖溶液，100mM；NADP，5mM；ATP，5mM；MgCl₂，5mM；己糖激酶，10KU/L；BSA，0.05mg/ml)，于37℃下反应30min。

利用酶标仪记录其在340nm处的吸光度。

将热处理过的葡萄糖6磷酸脱氢酶的吸光值除以未热处理过的葡萄糖6磷酸脱氢酶的吸光值，所得数值即为在该温度下的残留酶活比例，根据不同温度下的残留酶活比例，计算T₅₀，如表3所示。

表3 随机突变获得的突变株的热稳定性分析

实施例4

216位半胱氨酸的点突变的引入

第一轮PCR分别以野生型及突变株B为模板，分别用含有点突变的引物序列3(5’-ATGGTTTCTGAAATCAAAACCC-3’)、序列5即SEQID.No.5(5’-TCTTTGTCGGTGAAACATTCCGGTTTTTCC-3’)作为上游引物扩增，获得含有点突变的目的片段。PCR体系为50ul：

表4 PCR体系

PCR反应条件为：

98℃30sec；98℃10sec；60℃10sec；72℃30sec；30个循环；72℃5min；4℃保存。

所得目的两个目的片段经纯化后，分别用于下一轮WHOP-PCR的引物，其模版分别为野生型和突变株A，其具体反应体系见表5

表5 WHOP-PCR反应体系

PCR反应条件为：

在50ul的WHOP-PCR的产物中加入1ul的DpnI进行酶切，于37℃下反应2小时，以彻底除去模板DNA。然后转化BL21(DE3)，经测序验证后，发现突变株E：216S→C，突变株F：216S→C，44G→V，319G→V，均与理论序列相符。将所获得的突变株E、F分别接种于LB培养基中，诱导表达，所获得的菌体用于纯化，其方法为常规方法，如由于表达时带有6*His标签，利用镍柱即可纯化。对突变株E、F进行热稳定性分析，具体先表6所示。

表6 突变株E、F的热稳定性分析

实施例5

抑制率实验

将纯化好的突变株E、F加入1mM TCEP处理30min以上，再脱盐至50mM PB，pH8.0的缓冲液中，备用。将小分子BMCC-Biotin(Thermo,货号21900)用DMSO溶解至2mg/ml，备用。按照以下反应体系进行反应：

表7:偶联反应体系

将反应1和反应2置于室温反应至少30min。

再将其透析至25mM Tris，pH7.4的缓冲液中，并将其稀释至酶活1000～2000U/L范围内备用。按照下表进行抑制率实验。

表8:抑制率实验反应体系

由表8的实验结果可以看出，利用生物素亲和素系统验证突变株E和突变株F时，均有一定的抑制率，其中，突变株E有50％左右的抑制率，突变株F则更高，将近60％的抑制率，这种抑制率的提高可能与另外两个突变位点有关，其使得结构更加紧密，亲和素结合后遮蔽活性中心的程度更高。这种更高的抑制率有利于试剂盒的灵敏度的提高。

经以上实验分析可知，突变株F具有较高的热稳定性，相比野生型的T₅₀提高了约3℃～4℃，且其比没有并没有明显的下降，更重要的是其具有较高的抑制率。因此，基于本发明所提供的葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体，可应用于均相酶免技术，开发出具有高灵敏度，高稳定性的试剂盒。

Claims

1.一种葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体，其特征在于：该突变体为将以SEQID.No.1所示的氨基酸序列的葡萄糖6磷酸脱氢酶中的44位甘氨酸突变为缬氨酸、319位的甘氨酸突变为缬氨酸获得的突变体，与突变前的SEQID.No.1所示的氨基酸序列的葡萄糖6磷酸脱氢酶相比，具有更高的热稳定性。

2.根据权利要求1所述的葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体，其特征在于：该突变体为将以SEQID.No.1所示的氨基酸序列的葡萄糖6磷酸脱氢酶中的44位甘氨酸突变为缬氨酸、319位的甘氨酸突变为缬氨酸、216位的丝氨酸突变为半光氨酸获得的突变体，与突变前的SEQID.No.1所示的氨基酸序列葡萄糖6磷酸脱氢酶相比，具有更高的热稳定性及抑制率。

3.一种编码上述权利要求1-2任一项所述的葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体的基因。

4.一种包含权利要求3所述的葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体的基因的重组载体。

5.一种包含权利要求4所述的重组载体的宿主细胞。

6.一种权利要求1或2所述的葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体在制备基于均相酶免试剂盒中的应用。