CN104725392A - 半抗原spe-ede及其相应的人工抗原与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种半抗原SPE-EDE及其相应的人工抗原与应用。本发明保护式(Ⅰ)所示化合物。本发明还保护一种制备式(Ⅰ)所示化合物的方法,包括如下步骤:使盐酸大观霉素与乙二醇二环氧甘油醚反应,生成式(Ⅰ)所示化合物。本发明还保护所述式(Ⅰ)所示化合物与载体蛋白的偶联物(人工抗原)。本发明还保护以以上任一所述偶联物为免疫原得到的抗体。本发明还保护一种试剂盒,包括所述偶联物和所述抗体。本发明还保护以上任一所述偶联物、所述抗体或所述试剂盒在检测大观霉素或大观霉素衍生物(如盐酸大观霉素)中的应用。本发明对于检测大观霉素及其衍生物具有重大的实用价值,操作简单、成本低廉、可以满足检测限的需要。
Description
技术领域
本发明涉及一种半抗原SPE-EDE及其相应的人工抗原与应用。
背景技术
大观霉素(spectinomycin,SPE)是由壮观链霉菌产生的一种氨基糖苷类广谱抗生素。该药物能有效地治疗和预防由链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌及支原体引起的多种畜禽疾病,尤其对大肠杆菌及支原体引起的混合感染具有良好的治疗效果,并能作为饲料添加剂有效促进动物生长,因而被广泛应用于畜牧业生产中。
由于大观霉素对人体会造成潜在的危害,特别是肾脏毒性和耳毒性,因而国内外对动物性食品中大观霉素的残留都明确了其最大残留限量。欧盟2002年颁布了关于大观霉素在所有食品动物的肌肉、脂肪、肝、肾中的最大残留限量分别为300、500、1000和1500μg/kg。中国农业部于2003年也颁布了关于大观霉素在动物组织中的最大残留限量,在肌肉、脂肪、肝、肾中最大残留限量分别为500、2000、2000和5000μg/kg。
传统的检测大观霉素方法有气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、微生物法等,但都需要昂贵的仪器,检测成本高,不能满足进行现场快速检测的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种半抗原SPE-EDE及其相应的人工抗原与应用。
本发明保护式(Ⅰ)所示化合物;
式(Ⅰ)。
本发明还保护一种制备式(Ⅰ)所示化合物的方法,包括如下步骤:使盐酸大观霉素与乙二醇二环氧甘油醚反应,生成式(Ⅰ)所示化合物。
所述方法中,盐酸大观霉素与乙二醇二环氧甘油醚的质量配比具体可为37.5∶20。
所述方法中,所述反应的条件具体可为:4℃、15min。
所述方法具体如下:将37.5mg盐酸大观霉素溶于5mL3g/100ml NaHCO3水溶液,冰浴条件下边搅拌边加入0.5mL乙二醇二环氧甘油醚-二甲基甲酰胺溶液,然后4℃搅拌15min,得到式(Ⅰ)所示化合物;所述乙二醇二环氧甘油醚-二甲基甲酰胺溶液的制备方法为:将20mg乙二醇二环氧甘油醚溶于0.5mL二甲基甲酰胺,得到0.5mL乙二醇二环氧甘油醚-二甲基甲酰胺。
所述方法具体如下:将37.5mg盐酸大观霉素溶于5mL3g/100ml NaHCO3水溶液,冰浴条件下边搅拌边加入0.5mL所述乙二醇二环氧甘油醚-二甲基甲酰胺溶液,然后4℃搅拌15min,得到含有式(Ⅰ)所示化合物的溶液。
本发明还保护所述式(Ⅰ)所示化合物与载体蛋白的偶联物(人工抗原)。所述载体蛋白具体可为牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白。
本发明还保护以上任一所述方法制备得到的化合物与载体蛋白的偶联物(人工抗原)。所述载体蛋白具体可为牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白。
所述偶联物的制备方法具体如下:
(1)将50mg载体蛋白溶于5mL0.1mol/L Na2CO3水溶液;
(2)将所述含有式(Ⅰ)所示化合物的溶液加入步骤(1)得到的溶液中,室温搅拌16h;
(3)取步骤(2)得到的溶液,在PBS缓冲液(pH7.4、0.01mol/L)中4℃透析,得到偶联物溶液。
以牛血清白蛋白为例,偶联物的结构式如下:
本发明还保护以上任一所述偶联物在制备免疫原中的应用;所述免疫原的用途为制备与大观霉素或大观霉素衍生物结合的抗体。
本发明还保护以上任一所述偶联物为免疫原得到的抗体。
本发明还保护一种试剂盒,包括以上任一所述偶联物。所述试剂盒还包括以上任一所述偶联物为免疫原得到的抗体。所述试剂盒具体包括(a)和(b):(a)式(Ⅰ)所示化合物与鸡卵清白蛋白的偶联物或以上任一所述方法制备得到的化合物与鸡卵清白蛋白的偶联物;(b)式(Ⅰ)所示化合物与牛血清白蛋白的偶联物为免疫原得到的抗体或以上任一所述方法制备得到的化合物与牛血清白蛋白的偶联物为免疫原得到的抗体。
本发明还保护以上任一所述偶联物、所述抗体或所述试剂盒在检测大观霉素或大观霉素衍生物(如盐酸大观霉素)中的应用。
一般小分子化合物(分子质量<5000Da)不具有免疫原型,不能直接刺激动物产生抗体,只有与大分子的载体蛋白偶联形成完全抗原才具有免疫原性,才能刺激动物产生抗体。大观霉素分子质量只有368.8Da,因此必须与大分子的载体蛋白进行偶联才能用于动物免疫。在小分子抗体制备中,用于连接半抗原分子与载体蛋白的间隔臂具有十分重要的作用。采用本发明提供的免疫原免疫动物,可以得到高效价、高灵敏度的抗体,表明免疫原的设计是非常成功的。
应用本发明提供的人工抗原和抗体检测大观霉素或大观霉素衍生物,具有灵敏度高、检测快速、仪器要求简单、成本低等优点,尤其适于现场监控和大量样本的筛选,对大观霉素在动物性食品中的残留检测具有重要的现实意义。
附图说明
图1为SPE-EDE-BSA的合成路线图。
图2为实施例5中的标准曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。下述实施例中的搅拌,均为采用磁力搅拌器搅拌(采用上海青浦沪西仪器厂的90-3型磁力搅拌器)。
盐酸大观霉素(SPE):阿拉丁试剂公司。乙二醇二环氧甘油醚(EDE):Alfa Aesar公司。牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司。二甲基甲酰胺(DMF):Sigma公司,货号D4551。MK3型酶标仪;Thermo公司。新西兰大白兔:北京市实验动物中心。
实施例1、免疫原和包被原的制备
SPE-EDE-BSA的合成路线示意图见图1。
一、半抗原的制备
将37.5mg盐酸大观霉素溶于5mL3g/100ml NaHCO3水溶液,冰浴条件下边搅拌边逐滴加入0.5mL EDE-DMF溶液(20mg EDE溶于0.5mL DMF,得到0.5mL EDE-DMF溶液),然后4℃搅拌15min,得到半抗原溶液(半抗原即为SPE-EDE)。
半抗原如式(Ⅰ)所示。
式(Ⅰ)。
二、免疫原的制备
1、将50mg BSA溶于5mL0.1mol/L Na2CO3水溶液。
2、将步骤一得到的半抗原溶液边搅拌边逐滴加入步骤1得到的BSA溶液中,然后室温搅拌16h。
3、取步骤2得到的溶液,装入透析袋,在PBS缓冲液(pH7.4、0.01mol/L)中4℃透析(共3天,每天换液2次),然后收集透析袋中的溶液,即为免疫原溶液(免疫原即为SPE-EDE-BSA),-20℃保存备用。
三、包被原的制备
用OVA代替BSA,其它同步骤二,得到包被原溶液(包被原即为SPE-EDE-OVA)。
实施例2、多克隆抗体的制备
将实施例1制备的免疫原溶液用灭菌生理盐水稀释成2mg/mL的溶液(以蛋白量计),加入等体积的弗氏完全佐剂进行乳化,得到首次免疫制剂。将实施例1制备的免疫原溶液用灭菌生理盐水稀释成2mg/mL的溶液(以蛋白量计),加入等体积的弗氏不完全佐剂进行乳化,得到加强免疫制剂。
取4月龄的雌性新西兰大白兔:采用颈背部多点皮内注射的方式进行首次免疫,首次免疫制剂的剂量为1mg/每只大白兔(以蛋白量计);分别于首次免疫2周后、4周后、6周后、8周后和10周后各加强免疫一次,采用颈背部多点皮下注射的方式,加强免疫制剂的单次剂量为1mg/每只大白兔(以蛋白量计);最后一次加强免疫10天后,心脏采血,分离血清(抗体),-20℃保存备用。
实施例3、最佳包被浓度和最佳抗体工作浓度的确定
采用方阵法。采用碳酸盐缓冲液(pH9.5、0.05mol/L)将实施例1制备的包被原溶液进行1∶1000~1∶50000倍(体积比)梯度稀释。采用PBS缓冲液(pH7.4、0.01mol/L)将实施例2制备的血清(抗体)进行1∶1000~1∶100000倍(体积比)梯度稀释。采用间接ELISA法测定最佳抗原包被浓度及最佳抗体工作浓度。以OD490nm值接近1.5时对应的抗原包被浓度和抗体使用浓度为最佳抗原包被浓度和最佳抗体工作浓度。
包被原(SPE-EDE-OVA)的最佳包被浓度为0.3μg/mL(以蛋白量计),抗体最佳工作浓度为1∶1500。
实施例4、抗体效价的确定(间接ELISA法)
1、采用实施例1制备的包被原溶液(采用pH9.5、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液调整蛋白浓度)包被酶标板,100μL/孔;包被浓度为0.3μg/mL(以蛋白量计),然后4℃孵育16小时。
2、封闭并洗板。
3、每孔加入100μL实施例2制备的血清的梯度稀释液(采用pH7.4、0.01mol/L的PBS缓冲液进行梯度稀释),室温孵育2h,洗板。
4、每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,室温孵育2h,洗板。
5、加入TMB显色液,避光显色15min。
6、每孔加入100μL2mol/L硫酸中止反应;读OD450值。
步骤3中,采用将未经任何免疫的4月龄的雌性新西兰大白兔的血清作为实施例2制备的血清的阴性对照。步骤3中,采用pH7.4、0.01mol/L的PBS缓冲液作为血清稀释液的空白对照。
每个稀释度设置三个复孔,结果取平均值。
空白对照设置3个复孔,结果取平均值。
以P/N≥2.1,P-N≥0.2作为阳性血清的判断标准。其中P/N=(标本OD490nm值-空白对照OD490nm值)/(阴性对照OD490nm值-空白对照OD490nm值);P-N=标本OD490nm值-阴性对照OD490nm值。
结果见表1。SPE-EDE-BSA免疫得到的血清(多克隆抗体)的效价为1∶5000。
表1血清(多克隆抗体)的效价检测结果
OD490nm值 | 稀释倍数 |
1.065 | 1∶2500 |
0.624 | 1∶5000 |
0.313 | 1∶10000 |
0.136 | 1∶20000 |
0.093 | 1∶40000 |
0.056 | 1∶80000 |
0.061 | 1∶160000 |
0.059 | 1∶320000 |
实施例5、抗体标准曲线的建立(间接竞争ELISA法)
1、采用实施例1制备的包被原溶液(采用pH9.5、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液调整蛋白浓度)包被酶标板,100μL/孔;包被浓度为0.3μg/mL(以蛋白量计),然后4℃孵育16小时。
2、封闭并洗板。
3、每孔加入50μL盐酸大观霉素溶液(由盐酸大观霉素和pH7.4、0.01mol/L的PBS缓冲液组成;盐酸大观霉素的浓度分别为0.1、0.3、0.9、2.7和8.1ng/mL;将只加入pH7.4、0.01mol/L的PBS缓冲液的孔作为对照孔);每个浓度设置3个复孔。
4、每孔加入50μL实施例2制备的血清的1500倍稀释液(采用pH7.4、0.01mol/L的PBS缓冲液进行稀释),室温孵育2h,洗板。
4、每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,室温孵育2h,洗板。
5、加入TMB显色液,避光显色15min。
6、每孔加入100μL2mol/L硫酸中止反应;读OD450值。
步骤3中,盐酸大观霉素溶液每个浓度设置3个复孔,对照孔设置3个复孔。
以盐酸大观霉素浓度为横坐标,以ln[B/(B0-B)]为纵坐标建立标准曲线,B为加入盐酸大观霉素溶液后得到OD490nm值,B0为加入PBS缓冲液后得到的OD490nm值。
标准曲线见图2。
线性回归方程为y=-0.6664x+0.8376,其中r=0.9985。根据标准曲线的回归方程得出SPE抑制中浓度(IC50)为3.5ng/mL。
结果表明,本发明提供的人工抗原可以制备出高效价、高灵敏度的抗体。
Claims (10)
1.式(Ⅰ)所示化合物;
式(Ⅰ)。
2.一种制备式(Ⅰ)所示化合物的方法,包括如下步骤:使盐酸大观霉素与乙二醇二环氧甘油醚反应,生成式(Ⅰ)所示化合物。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于:盐酸大观霉素与乙二醇二环氧甘油醚的质量配比为37.5∶20。
4.如权利要求2或3所述的方法,其特征在于:所述反应的条件为:4℃、15min。
5.如权利要求2所述的方法,其特征在于:所述方法如下:将37.5mg盐酸大观霉素溶于5mL3g/100ml NaHCO3水溶液,冰浴条件下边搅拌边加入0.5mL乙二醇二环氧甘油醚-二甲基甲酰胺溶液,然后4℃搅拌15min,得到式(Ⅰ)所示化合物;所述乙二醇二环氧甘油醚-二甲基甲酰胺溶液的制备方法为:将20mg乙二醇二环氧甘油醚溶于0.5mL二甲基甲酰胺,得到0.5mL乙二醇二环氧甘油醚-二甲基甲酰胺。
6.权利要求1所述化合物与载体蛋白的偶联物,或,权利要求2至5中任一所述方法制备得到的化合物与载体蛋白的偶联物。
7.权利要求6所述偶联物在制备免疫原中的应用;所述免疫原的用途为制备与大观霉素或大观霉素衍生物结合的抗体。
8.以权利要求6所述偶联物为免疫原得到的抗体。
9.一种试剂盒、包括权利要求6所述偶联物。
10.权利要求6所述偶联物、权利要求8所述抗体或权利要求9所述试剂盒在检测大观霉素或大观霉素衍生物中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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