CN102827076A

CN102827076A - 一种氟喹诺酮类药物通用半抗原、人工抗原、广谱单克隆抗体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN102827076A
Application number: CN2012103156633A
Authority: CN
Inventors: 赵国先; 王建平; 刘彦政; 刘静; 张会彩
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Yingmao Bio Tech Co ltd
Priority date: 2012-08-25
Filing date: 2012-08-25
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2032-08-25
Also published as: CN102827076B

Abstract

本发明公开了一种氟喹诺酮类药物通用半抗原、人工抗原、广谱单克隆抗体及其制备方法与应用，设计合成了一种含有氟喹诺酮类药物母核结构的通用半抗原、人工抗原，制备出了能识别多种氟喹诺酮类药物的广谱单克隆抗体。本发明的氟喹诺酮类药物通用半抗原、人工抗原以及单克隆抗体可以用于氟喹诺酮类药物的免疫分析和筛选，提高检测效率，缩短检测时间，降低检测成本。

Description

一种氟喹诺酮类药物通用半抗原、人工抗原、广谱单克隆抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及食品安全领域，具体涉及一种氟喹诺酮类药物的通用半抗原、人工抗原和广谱单克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术

第三代喹诺酮类药物是一类人工合成的具有6-氟-7-哌嗪-4-喹诺酮环基本结构的抗菌药，也称为氟喹诺酮类药物。氟喹诺酮类药物毒性低，半衰期长，抗菌谱广，抗菌活性强，广泛用于动物和人类多种感染性疾病的治疗。沙拉沙星就是氟喹诺酮类药物的典型代表。

随着氟喹诺酮类药物在食品动物中的广泛应用，其在动物源性食品中的残留问题也引起广泛的关注。氟喹诺酮类药物的残留除了其毒副作用直接危害人体健康外，更为严重的是动物源性食品中残留的药物容易诱导人类致病菌产生耐药性，从而不利于该类药物在人类疾病的治疗。因此，必须十分重视此类药物在动物源性食品中的残留问题。美国和欧盟都规定了该类药物的最高残留限量，中国农业部也颁发了氟喹诺酮类药物的最高残留限量，为阻止此类药物的滥用和残留起到了巨大的作用。

目前，对动物源性产品中氟喹诺酮类药物的残留检测主要采用高效液相色谱法、液-质联用法、气相色谱法等仪器分析方法。但是仪器分析法受样品的净化、浓缩等步骤的影响较大，测定方法复杂，需要专业技术人员，耗费时间长，无法对大批次产品进行检测，而且成本较高，不适宜进行推广普及。而免疫分析法，是现在兽药残留检测的重要方法，其方便、快捷，可应用于大批量样品的筛选，宜于推广普及。免疫分析法的核心试剂是抗体。现有的文献报道大多是利用某一种氟喹诺酮类药物分子中的羧基直接与载体蛋白连接作为免疫原来制备抗体，所得抗体不能识别所有氟喹诺酮类药物。

因此，提供一种广谱适用的氟喹诺酮类药物免疫分析用抗体就成为该技术领域急需解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种氟喹诺酮类药物的通用半抗原。

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：

一种氟喹诺酮类药物的通用半抗原，其分子结构式如式1所示：

式1。

本发明的目的之二是上述氟喹诺酮类药物通用半抗原的制备方法。

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：

一种氟喹诺酮类药物通用半抗原的制备方法，包括如下步骤：

(a)用沙拉沙星与2-氯乙胺在75～85℃、pH＝7.5～8.5条件下反应；

(b)反应完全后，在55～65℃、pH＝5.5～6.5条件下析出结晶，得到式1结构的氟喹诺酮类药物通用半抗原。

本发明的目的之三是提供一种氟喹诺酮类药物的通用人工抗原。

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：

一种氟喹诺酮类药物的通用人工抗原，其分子结构式如式2所示：

式2。

一种优选技术方案，其特征在于：所述的载体蛋白为卵清蛋白或牛血清白蛋白。

本发明的目的之四是提供一种氟喹诺酮类药物通用人工抗原的制备方法。

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：

一种氟喹诺酮类药物通用人工抗原的制备方法，包括如下步骤：

(a)将式1结构的半抗原溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解得A液，将载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲溶液中，得B液；

(b)将所述溶液A滴加至所述溶液B中，充分搅拌得到溶液C；

(c)向溶液C中逐滴加入质量分数为25％的戊二醛水溶液，室温反应4～5小时后，4000转/分钟离心5分钟；

(d)将步骤(c)所得液体置于透析袋中，在4～20℃用磷酸盐缓冲透析3～4天。

本发明的目的之五是提供一种上述氟喹诺酮类药物通用人工抗原制备的广谱单克隆抗体。

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：

一种氟喹诺酮类药物通用人工抗原产生的广谱单克隆抗体，是能与所述的氟喹诺酮类药物通用人工抗原发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。

本发明的最后一个目的是提供氟喹诺酮类药物的广谱单克隆抗体的应用。所述单克隆抗体用于动物源性食品中氟喹诺酮类药物的免疫检测。

本发明的有益效果为，以沙拉沙星为模板合成的半抗原含有氟喹诺酮类药物的共有结构6-氟-7-哌嗪-4-喹诺酮环。在制备的人工抗原中是以引入的氨基为连接位点将半抗原与载体蛋白偶联，这样就将氟喹诺酮类药物的共有结构暴露给动物免疫系统。另外，在氟喹诺酮类药物中，沙拉沙星的分子结构相对较大也较复杂，其他多种氟喹诺酮类药物的分子结构可被视为沙拉沙星分子结构的一部分。因此，以沙拉沙星为分子模板制备的抗体能同时识别沙拉沙星、二氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氨氟沙星、氧氟沙星等8种氟喹诺酮类药物。所得抗体用于氟喹诺酮类药物的多残留免疫检测，满足了现场快速检测的要求，提高了检测效率，缩短了检测时间，降低了检测成本。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业渠道获得。

实施例1

实验1：氟喹诺酮类药物通用半抗原的合成

(a)在50ml三口瓶中，加入8ml蒸馏水，加热至80℃，向瓶中加入1mmol沙拉沙星标准品，并滴加氢氧化钠溶液至溶解，向所得溶液中慢慢加入1mmol的2-氯乙胺，缓慢搅拌2小时，期间继续滴加氢氧化钠溶液保持pH＝8.0；

(b)将步骤(a)的溶液温度降至60度，加盐酸中和至pH＝6.0，析出固体，将所得固体抽滤，水洗，得到沙拉沙星半抗原。产物的分子结构式如式1所示：

式1。

该产物熔点225℃；红外光谱(IR)表征数据：(KBr)V_max3600，3392，3075，2975，2825，1733，1627，1490，1259，1157，806，730，540cm^-1。与沙拉沙星本身的红外数据比较，多出了氨基。

实验2：氟喹诺酮类药物通用人工抗原的制备

(a)将40mmol的沙拉沙星半抗原置于3毫升N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解得溶液A；将50mg载体蛋白溶解于2mL磷酸盐缓冲溶液中，得到溶液B；

(b)将上述溶液A慢慢加入到溶液B中，充分搅拌得溶液C；

(c)向溶液C中逐滴加入质量分数为25％的戊二醛水溶液20μL，室温反应4小时后，4000转/分钟离心5分钟；

(d)将步骤(c)所得液体置于透析袋中，在5℃用磷酸盐缓冲透析3天，得到式2所示的人工抗原：

式2。

实施例2

实验1：氟喹诺酮类药物通用半抗原的合成

(a)在50ml三口瓶中，加入8ml蒸馏水，加热至75℃，向瓶中加入1mmol沙拉沙星标准品，并滴加氢氧化钠溶液至溶解，向所得溶液中慢慢加入1.5mmol的2-氯乙胺，缓慢搅拌2.5小时，期间继续滴加氢氧化钠溶液保持pH＝7.5；

(b)将步骤(a)的溶液温度降至55度，加盐酸中和至pH＝5.5，析出固体，将所得固体抽滤，水洗，得到沙拉沙星半抗原。产物的分子结构式如式1所示：

式1。

产物结构与表征数据同上。

实验2：氟喹诺酮类药物通用人工抗原的制备

(a)将60mmol的沙拉沙星半抗原置于5毫升N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解得溶液A；将45mg载体蛋白溶解于3mL磷酸盐缓冲溶液中，得到溶液B；

(b)将上述溶液A慢慢加入到溶液B中，充分搅拌得溶液C；

(c)向溶液C中逐滴加入质量分数为25％的戊二醛水溶液20μL，室温反应5小时后，4000转/分钟离心5分钟；

(d)将步骤(c)所得液体置于透析袋中，在4℃用磷酸盐缓冲透析3天，得到式2所示的人工抗原：

式2。

实施例3

实验1：氟喹诺酮类药物通用半抗原的合成

(a)在50ml三口瓶中，加入8ml蒸馏水，加热至85℃，向瓶中加入1mmol沙拉沙星标准品，并滴加氢氧化钠溶液至溶解，向所得溶液中慢慢加入2mmol的2-氯乙胺，缓慢搅拌3小时，期间继续滴加氢氧化钠溶液保持pH＝8.5；

(b)将步骤(a)的溶液温度降至65度，加盐酸中和至pH＝6.5，析出固体，将所得固体抽滤，水洗，得到沙拉沙星半抗原。产物的分子结构式如式1所示：

式1。

产物结构与表征数据同上。

实验2：氟喹诺酮类药物通用人工抗原制备

(a)将50mmol的沙拉沙星半抗原置于3毫升N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解得溶液A；将60mg载体蛋白溶解于3mL磷酸盐缓冲溶液中，得到溶液B；

(b)将上述溶液A慢慢加入到溶液B中，充分搅拌得溶液C；

(c)向溶液C中逐滴加入质量分数为25％的戊二醛水溶液40μL，室温反应5小时后，4000转/分钟离心5分钟；

(d)将步骤(c)所得液体置于透析袋中，在20℃用磷酸盐缓冲透析4天，得到式2所示的人工抗原：

式2。

实验3：单克隆抗体的制备：

以制备的式2结构的人工抗原作为免疫原，免疫5只Balb/C小鼠，免疫剂量为100-300μg/只，免疫方法如下：将免疫原与等量弗氏完全佐剂充分乳化，在颈背部皮下多点注射。间隔2-3周，将免疫原与等量弗氏不完全佐剂乳化后，加强免疫一次，共加强免疫6次。

最后一次免疫后7天，选取上述血清效价最高的小鼠脱颈椎处死。无菌条件下，取出脾脏，分离脾细胞，按10∶1的比例与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合。用沙拉沙星为标准抑制物筛选阳性杂交瘤细胞。然后采用有限稀释法获得分泌抗沙拉沙星单克隆抗体的单株杂交瘤细胞。

将以上获得的单株杂交瘤细胞扩大培养，注射到空白小鼠的腹腔中，每只小鼠1×10⁶-2×10⁶个杂交瘤细胞。两周后，采集小鼠的腹水。采用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水进行提纯，获得针对沙拉沙星的单克隆抗体。

实验4：单克隆抗体的性能测定：

(1)抗血清最低检测限(LOD值)和半数抑制量(IC₅₀)的检测

利用方阵滴定法确定前述沙拉沙星单克隆抗体和式2结构的人工抗原的工作浓度。采用不同浓度的沙拉沙星标准品做实验溶液，其浓度如下：0.5、1、2、4、8、16、32、64、128(单位：ng/mL)，采用6组平行试验(n＝6)

间接竞争酶联免疫吸附法(ELISA)：用上述实施例2制备的工作浓度的沙拉沙星人工抗原包被酶标板，4℃过夜或者37℃2小时。然后，甩净拍干板内溶液，PBST洗涤3-5次，每次3min。加入封闭液37℃孵育30min。把板内液体甩净拍干，将实验溶液和抗体溶液同时加入酶标板孔中，同时设置零标准对照孔(将实验溶液换为稀释液，其他一致)和空白对照孔(将抗体溶液换为稀释液，其他一致)，37℃孵育1小时。然后将孔内液体甩净拍干，PBST洗涤3-5次每次3min。加入酶标二抗，37℃孵育1小时。甩净拍干，PBST洗涤3-5次，每次3min。加入显色液，37℃显色20min。然后加入终止液，用酶标仪在波长450nm处测定吸光度值(OD)。以吸光度为纵坐标，以标准品实验溶液浓度的Log值为横坐标，绘制半对数标准曲线图，标准曲线的平行测定次数为6次，实验重复性好。

根据标准曲线得出10％抑制量(LOD)和半数抑制量(IC₅₀)，检测灵敏度。抑制率按下式计算：

式中OD_max为不加实验溶液时的吸光值(即零标准对照孔)，OD_x为实验溶液浓度为x时的吸光值，OD_min为空白对照孔的吸光值。

结果表明，沙拉沙星单克隆抗体对沙拉沙星的半数抑制量(IC₅₀)为17ng/mL，最低检测限(LOD)为1.5ng/mL。

(2)抗体的特异性检测：

抗体的特异性是指它同特异性抗原的结合能力，与该类抗原类似物结合能力的比较，常用交叉反应率作为评价的标准。抗体对抗原类似物的交叉反应率大，说明该抗体适合作为多残留免疫检测试剂。

将氟喹诺酮类药物(环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氨氟沙星、二氟沙星、氧氟沙星)进行系列稀释，分别与上述实施例3制备的沙拉沙星单克隆抗体进行反应，制作标准曲线。在曲线上分别找到这7种类似物产生50％抑制时的半数抑制量(IC₅₀)，计算沙拉沙星单克隆抗体对这几种类似物的交叉反应率。

交叉反应率(％)＝(沙拉沙星的半数抑制量/其他类似物的半数抑制量)×100％。

实验设3次重复，取三次重复的平均值作为实验结果。结果表明，沙拉沙星单克隆抗体表现出广谱特异性，能同时识别沙拉沙星、二氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氨氟沙星、氧氟沙星，交叉反应率分别为100％、97％、64％、67％、48％、43％、42％、14％。由此可知，本发明提供的沙拉沙星单克隆抗体可以同时识别上述8种氟喹诺酮类药物，能够满足氟喹诺酮类药物的广泛高效筛选。

Claims

1.一种氟喹诺酮类药物通用半抗原，其分子结构式如式1所示：

式1。

2.一种如权利要求1所述氟喹诺酮类药物通用半抗原的制备方法，包括如下步骤：

3.一种氟喹诺酮类药物通用人工抗原，其分子结构式如式2所示：

式2。

4.如权利要求3所述的氟喹诺酮类药物通用人工抗原，其特征在于，所述的载体蛋白为卵清蛋白或牛血清白蛋白。

5.如权利要求3或4所述的氟喹诺酮类药物通用人工抗原的制备方法，包括如下步骤：

(b)将所述溶液A滴加至所述溶液B中，充分搅拌得到溶液C；

6.一种氟喹诺酮类药物的广谱单克隆抗体，是能与权利要求3或4所述的氟喹诺酮类药物通用人工抗原发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。

7.如权利要求6所述的氟喹诺酮类药物的广谱单克隆抗体的应用，用于动物源性食品中氟喹诺酮类药物的免疫检测。