CN102827188B - 一种青霉素类药物通用半抗原、人工抗原、广谱单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种青霉素类药物通用半抗原、人工抗原、广谱单克隆抗体及其制备方法与应用。设计合成了一种含有青霉素类药物母核结构的通用半抗原、人工抗原，制备出了针对该母核的能识别多种青霉素类药物的单克隆抗体。本发明的青霉素类药物通用半抗原、人工抗原以及单克隆抗体可以用于青霉素类药物的免疫分析和筛选，提高检测效率，缩短检测时间，降低检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全领域，具体涉及一种青霉素类药物的通用半抗原、人工抗原和广谱单克隆抗体及其制备方法与应用。
背景技术
青霉素类药物是一类能破坏细菌细胞壁并在细菌繁殖期起杀菌作用的抗生素，主要包括苄青霉素、甲氧西林、羧苄西林、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林等。此类药物主要对革兰氏阳性菌有效，对革兰阳性球菌及革兰阳性杆菌、螺旋体、梭状芽孢杆菌、放线菌以及部分拟杆菌也有抗菌作用。因此，青霉素类药物在畜牧养殖业中被大量用于治疗动物的多种细菌性疾病。
但青霉素类药物对畜禽有一定的毒性，动物大剂量或长期连续服用青霉素类药物易引起毒性反应，引起动物抽搐、大小便失禁、甚至瘫痪等。更重要的是，青霉素类药物大量使用会在动物性食品中造成残留而被消费者食入，这对人类身体健康有巨大危害。因此，世界各国都对动物性食品中残留的青霉素类药物进行严格的监控，并且规定了多种青霉素类药物在不同动物性食品中的最高残留限量，如中国农业部规定几种青霉素类药物在牛奶中的最高残留限量为：青霉素，4ng/mL；阿莫西林，10ng/mL；氨苄西林，10ng/mL。
目前，国内外己发表的有关青霉素类药物残留检测的方法有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱一质谱法(LC-MS)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。这些常用方法实际操作中需要有昂贵的仪器，且前处理复杂、繁琐、操作时间长、操作技术要求高。
免疫分析方法有很高的精确度、灵敏性和特异性，且对技术要求不高，具有检测时间短，适用于大批量测定等优点。免疫分析法的核心试剂是抗体。目前已有的针对青霉素类药物的免疫分析报道中，均是以某一种青霉素类药物为基础去制备抗体，所得抗体只对该药物有较高识别能力，而对其他青霉素类药物识别能力低，也就是说不能识别所有青霉素类药物。
因此，提供一种广谱适用的青霉素类药物免疫分析用抗体就成为该技术领域急需解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种青霉素类药物的通用半抗原。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：
一种青霉素类药物的通用半抗原，其分子结构式如式I所示：
式I。
本发明的目的之二是上述青霉素类药物通用半抗原的制备方法。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：
一种青霉素类药物通用半抗原的制备方法，包括如下步骤：
(a)将6-氨基青霉素酸的二氧六环溶液与对羟基苯甲醛的二氧六环溶液混合后，加热回流；
(b)反应完全后，冷却，抽滤，水洗得到式I结构的化合物。
所用6-氨基青霉烷酸和对羟基苯甲醛的摩尔比为1∶1～2，优选1∶1。
本发明的目的之三是提供一种青霉素类药物的通用人工抗原。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：
一种青霉素类药物的通用人工抗原，其分子结构式如式II所示：
式II。
一种优选技术方案，其特征在于：所述的载体蛋白为卵清蛋白或牛血清白蛋白。
本发明的目的之四是提供一种青霉素类药物通用人工抗原的制备方法。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：
一种青霉素类药物通用人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
(a)将N，N-羟基二咪唑和式I结构化合物溶于无水丙酮，将该溶液在37℃振荡培养箱中反应2小时，反应后使丙酮挥发，得到中间产物，将该中间产物溶解于磷酸盐缓冲溶液中，得到溶液A；
(b)将所述载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲溶液中，得到溶液B；
(c)将所述溶液B滴加至所述溶液A中，得到式II结构的人工抗原。
一种优选技术方案，其特征在于还包括如下步骤：
(d)将由步骤(c)得到的人工抗原在4～20℃用磷酸盐缓冲溶液透析48～84小时，优选在4℃透析72小时。
将透析后的青霉素类药物通用人工抗原进行离心，所述离心过程中，转速为6000转/分钟，时间为10分钟。
本发明的目的之五是提供一种上述青霉素类药物通用人工抗原制备的广谱单克隆抗体。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：
一种青霉素类药物通用人工抗原产生的广谱单克隆抗体，是能与所述青霉素类药物通用人工抗原发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。
本发明的最后一个目的是提供青霉素类药物的广谱单克隆抗体的应用。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：
所述单克隆抗体用于动物源性食品中青霉素类药物的免疫检测。
本发明的原理是，在所有青霉素类药物的分子结构中均含有6-氨基青霉烷酸这一共同的母核，并且该母核均位于各个药物分子结构的一端。鉴于此，设计合成一种含有该母核结构的通用半抗原，制备出的针对该母核的抗体应能识别所有青霉素类药物，这使得建立青霉素类药物的多残留免疫检测方法或研制多残留免疫检测产品成为可能。
本发明的有益效果为，上述青霉素类药物的通用半抗原含有青霉素类药物的共有母核，在青霉素类药物通用人工抗原中，是以引入的羟基为连接位点将该半抗原与载体蛋白偶联，也就是将青霉素类药的母核突出于载体蛋白的表面，在免疫动物时充分暴露给动物免疫识别系统。以该青霉素类药物的通用人工抗原作为免疫原免疫动物，可以获得针对青霉素类药物的广谱性抗体，该抗体可以同时识别阿莫西林、氨苄西林、苄青霉素、羧苄西林、磺苄西林、甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、萘夫西林等十种青霉素类药物。本发明的青霉素类药物通用人工抗原可以用于青霉素类药物的免疫分析和筛选，提高检测效率，缩短检测时间，降低检测成本。
下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业渠道获得。
实施例1
实验1：青霉素类药物通用半抗原的合成
(a)将216mg(0.001mol)6-氨基青霉烷酸溶于4mL二氧六环中，磁力搅拌使其完全溶解，将122mg(0.001mol)对羟基苯甲醛溶于4mL二氧六环中，二者混合后，加热回流；
(b)反应1小时后，经薄层色谱法检验反应结束，此时混合液颜色变为黄色。冷却，抽滤，水洗，获得黄色沉淀，将该沉淀干燥，称量获得223mg产物，产率为69.7％，产物的分子结构式如式I所示：
式I。
该产物熔点220℃；红外光谱(IR)表征数据：(KBr)Vmax3648，3110，3000，2983，1772，1623，1580-1410，1338，1114，889，763，669cm-1。与6-氨基青霉烷酸的红外数据比较，多出了苯环、羟基和碳氮双键。
实验2：青霉素类药物通用人工抗原制备
(a)将16.0mg式I结构的化合物和17mg N，N-羰基二咪唑溶解于2mL无水丙酮中，磁力搅拌使其完全溶解，37℃振荡培养箱中反应2小时，反应后在通风橱中使丙酮挥发，得到中间产物，将中间产物溶解于2mL磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)中，得到溶液A；
(b)将68mg牛血清白蛋白溶解于4mL PH 7.4的PBS溶液中，得到溶液B；
(c)将溶液B滴加到溶液A中，搅拌反应24小时，得到式II所示的人工抗原：
式II；
按照文献报道的2，4，6-三硝基苯磺酸法测定半抗原与载体蛋白的偶联比为12∶1，证明半抗原与载体蛋白已经偶联。2，4，6-三硝基苯磺酸能与蛋白中的游离氨基反应，产物浓度与紫外335nm处的吸光度成正比。控制人工抗原与未偶联的载体蛋白浓度相等，分别与2，4，6-三硝基苯磺酸反应，产物的吸光度不同，说明蛋白中的部分氨基与半抗原反应了。以吸光度的差值计算半抗原与载体蛋白质偶联比。
(d)将步骤(c)的反应液装入透析袋中，4℃条件下用PBS溶液透析72小时，期间更换透析液6次；倒掉透析液，将透析袋中的溶液离心10分钟(6000转/分钟)，得到青霉素类药物通用人工抗原，将其分装于安培瓶中，-20℃保存。
实施例2
实验1：青霉素类药物通用半抗原的合成
(a)将216mg(0.001mol)6-氨基青霉烷酸溶于4mL二氧六环中，磁力搅拌使其完全溶解，将244mg(0.002mol)对羟基苯甲醛溶于4mL二氧六环中，二者混合后，加热回流；
(b)反应1小时后，经薄层色谱法检验反应结束，此时混合液颜色变为黄色。冷却，抽滤，水洗，获得黄色沉淀，将该沉淀干燥，称量获得236mg产物，产率为73.8％，产物的分子结构式如式I所示：
式I。
该产物熔点220℃；红外光谱(IR)表征数据：(KBr)Vmax3648，3110，3000，2983，1772，1623，1580-1410，1338，1114，889，763，669cm-1。与6-氨基青霉烷酸的红外数据比较，多出了苯环、羟基和碳氮双键。
实验2：青霉素类药物通用人工抗原制备
(a)将16.0mg式I结构的化合物和17mg N，N-羰基二咪唑溶解于2mL无水丙酮中，磁力搅拌使其完全溶解，37℃振荡培养箱中反应2小时，反应后在通风橱中使丙酮挥发，得到中间产物，将中间产物溶解于2mL磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)中，得到溶液A；
(b)将68mg卵清蛋白溶解于4mL PH 7.4的PBS溶液中，得到溶液B；
(c)将溶液B滴加到溶液A中，搅拌反应24小时，得到含式II所示的人工抗原：
式II；
(d)将步骤(c)的反应液装入透析袋中，20℃条件下用PBS溶液透析48小时，期间更换透析液6次；倒掉透析液，将透析袋中的溶液6000转/分钟离心10分钟，得到青霉素类药物通用人工抗原，将其分装于安培瓶中，-20℃保存。
实施例3
实验1：青霉素类药物通用半抗原的合成
(a)将216mg(0.001mol)6-氨基青霉烷酸溶于4mL二氧六环中，磁力搅拌使其完全溶解，将122mg(0.001mol)对羟基苯甲醛溶于4mL二氧六环中，二者混合后，加热回流；
(b)反应1小时后，经薄层色谱法检验反应结束，此时混合液颜色变为黄色。冷却，抽滤，水洗，获得黄色沉淀，将该沉淀干燥，称量获得223mg产物，产率为69.7％，产物的分子结构式如式I所示：
式I。
该产物熔点220℃；红外光谱(IR)表征数据：(KBr)Vmax3648，3110，3000，2983，1772，1623，1580-1410，1338，1114，889，763，669cm-1。与6-氨基青霉烷酸的红外数据比较，多出了苯环、羟基和碳氮双键。
实验2：青霉素类药物通用人工抗原制备
(a)将16.0mg式I结构的化合物和17mg N，N-羰基二咪唑溶解于2mL无水丙酮中，磁力搅拌使其完全溶解，37℃振荡培养箱中反应2小时，反应后在通风橱中使丙酮挥发，得到中间产物，将中间产物溶解于2mL磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)中，得到溶液A；
(b)将68mg牛血清白蛋白溶解于4mL PH 7.4的PBS溶液中，得到溶液B；
(c)将溶液B滴加到溶液A中，搅拌反应24小时，得到含式II所示的人工抗原：
式II；
(d)将步骤(c)的反应液装入透析袋中，15℃条件下用PBS溶液透析84小时，期间更换透析液6次；倒掉透析液，将透析袋中的溶液6000转/分钟离心10分钟，得到青霉素类药物通用人工抗原，将其分装于安培瓶中，-20℃保存。
实验3：单克隆抗体的制备
(a)以实施例3所得式II结构的青霉素类药物通用人工抗原作为免疫原，免疫5只Balb/C小鼠，免疫剂量为100-300μg/只，免疫方法如下：将免疫原与等量弗氏完全佐剂充分乳化，在颈背部皮下多点注射。间隔2-3周，将免疫原与等量弗氏不完全佐剂乳化后，加强免疫一次，共加强免疫6次。
(b)最后一次免疫7天后，选取上述步骤(a)中血清效价最高的小鼠脱颈椎处死。无菌条件下，取出脾脏，分离脾细胞，按10∶1的比例与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合。用阿莫西林为标准抑制物筛选阳性杂交瘤细胞。然后采用有限稀释法获得分泌抗青霉素类药物单克隆抗体的单株杂交瘤细胞。
(c)将上述步骤(b)中获得的单株杂交瘤细胞扩大培养，注射到空白小鼠的腹腔中，每只小鼠1×106～2×106个杂交瘤细胞。两周后，采集小鼠的腹水。采用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水进行提纯，获得针对青霉素类药物的单克隆抗体。
该单克隆抗体为能与式II结构的青霉素类药物通用人工抗原发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。
实验四：单克隆抗体的性能测定
(a)抗血清最低检测限(LOD)和半数抑制量(IC50)的检测
利用方阵滴定法确定青霉素类药物单克隆抗体和上述实施例3制备的青霉素类药物通用人工抗原的工作浓度。采用不同浓度的阿莫西林标准品做实验溶液，其浓度如下：0.2、0.5、1、2、4、8、16、32(单位：ng/mL)，采用6组平行试验(n＝6)。
间接竞争酶联免疫吸附法(ELISA)：用上述制备的工作浓度的青霉素类药物通用人工抗原包被酶标板，4℃过夜或者37℃2小时。然后，甩净拍干板内溶液，PBST洗涤3～5次，每次3min。加入封闭液37℃孵育30min。把板内液体甩净拍干，将实验溶液和抗体溶液同时加入酶标板孔中，同时设置零标准孔(将添加的实验溶液用高纯水代替，其它一致)和空白对照孔(将添加的抗体溶液换成高纯水，其它一致)，37℃孵育1小时。然后将孔 内液体甩净拍干，PBST洗涤3-5次每次3min。加入酶标二抗，37℃孵育1小时。甩净拍干，PBST洗涤3-5次，每次3min。加入显色液，37℃显色20min。然后加入终止液，用酶标仪在波长450nm处测定吸光度值(OD)。以吸光度为纵坐标，以标准品实验溶液浓度的Log值为纵坐标，绘制半对数标准曲线图，标准曲线的平行测定次数为6次，实验重复性好。
根据标准曲线得出10％抑制量(LOD)和半数抑制量(IC50)，检测灵敏度。抑制率按下式计算：
式中ODmax为不加标准品实验溶液时的吸光值(即零标准孔)，ODx为标准品浓度x时的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值。
结果表明，获得的青霉素类药物单克隆抗体对阿莫西林的半数抑制量(IC50)为5.8ng/mL，最低检测限(LOD)为0.9ng/mL。
(b)抗体的特异性检测
抗体的特异性是指它同特异性抗原的结合能力与同该抗原类似物结合能力的比较，常用交叉反应率作为评价的标准。抗体对抗原类似物的交叉反应率大，说明该抗体适合作为多残留免疫检测试剂。
将另外9种青霉素类药物(苄青霉素、甲氧西林、羧苄西林、氨苄西林、磺苄西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、萘夫西林)进行系列稀释，分别与上述实施例3中制备的青霉素类药物单克隆抗体进行反应，制作标准曲线。在曲线上分别找到这9种类似物产生50％抑制时的半数抑制量(IC50)，计算该单克隆抗体对这几种类似物的交叉反应率。
交叉反应率(％)＝(阿莫西林的半数抑制量/其他类似物的半数抑制量)×100％。
实验设3次重复，取三次重复的平均值作为实验结果。结果表明，该单克隆抗体表现出广谱特异性，能同时识别阿莫西林、氨苄西林、苄青霉素、羧苄西林、磺苄西林、甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、萘夫西林，交叉反应率分别为100％、117％、90％、67％、63％、57％、39％、33％、31％、16％。由此可知，本发明提供的青霉素类药物的广谱单克隆抗体均可以同时识别上述10种青霉素类药物，可以作为免疫分析法的核心试剂用于多残留免疫检测青霉素类药物，能够满足青霉素类药物的广泛高效筛选。
Claims (9)
1.一种青霉素类药物通用半抗原，其分子结构式如式I所示：
2.一种如权利要求1所述青霉素类药物的通用半抗原的制备方法，包括如下步骤：
(a)将6-氨基青霉烷酸的二氧六环溶液与对羟基苯甲醛的二氧六环溶液混合后，加热回流；
(b)反应完全后，冷却，抽滤，水洗得到式I结构的化合物。
3.一种如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所用6-氨基青霉烷酸和对羟基苯甲醛的摩尔比为1∶1～2。
4.一种青霉素类药物的通用人工抗原，其分子结构式如式II所示：
5.如权利要求4所述的青霉素类药物的通用人工抗原，其特征在于，所述的载体蛋白为卵清蛋白或牛血清白蛋白。
6.如权利要求4或5所述青霉素类药物通用人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
(a)将N，N-羰基二咪唑和式I结构化合物溶于无水丙酮，将该溶液在37℃振荡培养箱中反应2小时，反应后使丙酮挥发，得到中间产物，将该中间产物溶解于磷酸盐缓冲溶液中，得到溶液A；
(b)将所述载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲溶液中，得到溶液B；
(c)将所述溶液B滴加至所述溶液A中，得到式II结构的人工抗原。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于还包括如下步骤：
(d)将由步骤(c)得到的人工抗原在4～20℃用磷酸盐缓冲溶液透析48～84小时。
8.一种青霉素类药物的广谱单克隆抗体，是能与权利要求4或5所述的青霉素类药物通用人工抗原发生特异性免疫反应的免疫球蛋白，通过以下步骤制备：
(a)以权利要求4或5所述的式II结构的青霉素类药物通用人工抗原作为免疫原，免疫5只Balb/C小鼠，免疫剂量为100-300μg/只，免疫方法如下：将免疫原与等量弗氏完全佐剂充分乳化，在颈背部皮下多点注射，间隔2-3周，将免疫原与等量弗氏不完全佐剂乳化后，加强免疫一次，共加强免疫6次；
(b)最后一次免疫7天后，选取上述步骤(a)中血清效价最高的小鼠脱颈椎处死，无菌条件下，取出脾脏，分离脾细胞，按10∶1的比例与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，用阿莫西林为标准抑制物筛选阳性杂交瘤细胞，然后采用有限稀释法获得分泌抗青霉素类药物单克隆抗体的单株杂交瘤细胞；
(c)将上述步骤(b)中获得的单株杂交瘤细胞扩大培养，注射到空白小鼠的腹腔中，每只小鼠1×106～2×106个杂交瘤细胞，两周后，采集小鼠的腹水，采用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水进行提纯，获得针对青霉素类药物的单克隆抗体。
9.如权利要求8所述的青霉素类药物的广谱单克隆抗体的应用，用于动物源性食品中阿莫西林、氨苄西林、苄青霉素、羧苄西林、磺苄西林、甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林或萘夫西林药物的免疫检测。
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