CN106290908A

CN106290908A - 一种用于肾脏损伤检测用试剂盒

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Publication number: CN106290908A
Application number: CN201610647652.3A
Authority: CN
Inventors: 查文娟
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-08-07
Filing date: 2016-08-07
Publication date: 2017-01-04

Abstract

本发明涉及一种用于肾脏损伤检测用试剂盒，其包含RBP突变的单域抗体，本发明将视黄醇结合蛋白(RBP)的单域抗体通过三维建模寻找到了最优的对抗体结合起到最大功能的位点，通过特定位点的点突变获得了一系列的突变抗体，所述的抗体相对于原始的抗体，具有更好的结合结合特性以及结合的准确性，具有不可以预料的效果。同时将突变后的抗体去制备用于检测视黄醇结合蛋白的试剂盒，具有更好的应用前景。

Description

一种用于肾脏损伤检测用试剂盒

技术领域

本发明属于生物诊断领域，具有的涉及一种用于肾脏损伤检测用试剂盒。

背景技术

视黄醇结合蛋白(Retinol Binding Protein,RBP)为血液中视黄醇(维生素A)的转运蛋白。1961年Berggard在免疫电泳中发现在α2-球蛋白区域能形成一条长沉淀线的蛋白质，曾称为长α2-球蛋白。在以后几十年中，人们对这种蛋白质的分子结构、生物学特性等进行了全面研究，发现这种蛋白质广泛地分布于正常人体液中，属α1-球蛋白，具有从肝细胞中转运视黄醇至周围组织的功能。目前，认为血液中RBP主要以视黄醇、前白蛋白结合的复合物形式存在，当复合物中视黄醇与靶细胞结合后，RBP便与前白蛋白分离，自肾小球滤出，由近端肾小管上皮细胞吸收、降解。因此正常人尿液中几乎不含有RBP(含量低于300ng/ml)，若肾小管病变，则重吸收功能下降，会导致尿液中的RBP大量上升。因此，在肾小管操作病人尿液中RBP含量大于300ng/ml，一般可达到正常人的5倍以上，严重者其尿液中的RBP含量甚至可以达到100000ng/ml以上。近年来的研究表明，RBP含量改变能够敏感地反映近端肾小管功能、肝功能损害程度，是反映肾脏、肝脏及营养性疾病发展、转归的敏感指标。

血液中游离的RBP可以从肾小球滤过，其中99.9％经近曲小管上皮细胞重吸收、降解。正常情况下，尿液中RBP排泄量甚微(低于300ng/mL)。若肾小管病变，则重吸收功能下降，会导致尿液中的RBP大量上升。在肾小管损伤病人尿液中，RBP含量大于300ng/mL，一般可以达到正常人的5倍以上，严重者其尿液中的RBP含量甚至可以达到10000ng/mL。故尿液中RBP增高具有早期诊断意义，被认为是肾小管损伤的一个良好早期标志物，对RBP的检测已经被广泛应用于临床上对肾脏损伤的诊断中。

RBP的临床检测意义还包括急性肾小球肾炎、慢性肾小球肾炎、糖尿病性肾病和慢性肾功能衰竭疾病等，其血清RBP的浓度水平均升高。同时RBP与肝脏病也有关系，RBP与血清胆红素、谷草转氨酶和碱性磷酸酶活力均显著负相关，坏死性肝硬化、胆汁性肝硬化及急、慢性肝炎患者的血清RBP水平均显著低于正常对照组。

传统的RBP的测定方法主要有酶联免疫法、放射免疫法及乳胶免疫比浊法。免疫比浊法因其试剂稳定，容易实现检测的高通量及操作自动化，且检测结果快速、准确、可靠，因此成为临床实验室最具前景的测定方法。

对于RBP的测定，现广泛采用ELISA法；此法简便快速，而这种检测方法是基于将视黄醇结合蛋白(RBP)免疫绵羊获得的抗体来实现的。但是这种传统意义上的抗体稳定性差、灵敏度低、生产成本高，所有因素均限制了对于视黄醇结合蛋白(RBP)的检测。1993年比利时科学家首次在Nature报道:在骆驼血液中的抗体，有一半没有轻链，而且更让人惊喜的是，这些缺失轻链的"重链抗体"能像正常抗体一样与抗原等靶标紧密结合，另外不像scFv那样互相沾粘，甚至聚集成块。这种抗体只包含一个重链可变区和两个常规的CH2与CH3区，更重要的是单独克隆并表达出来的VHH区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，分子量只是普通抗体的1/10,所以VHH也称Nanobody(单域抗体)；与此同时单域抗体化学性质也更加灵活，稳定性好，可溶性高，表达容易且利用微生物即可大量地获得，容易偶联其他分子，因此应用单域抗体为研发视黄醇结合蛋白(RBP)检测试剂具有广阔的前景。

CN103864927A中公开了视黄醇结合蛋白(RBP)单域抗体编码序列及其应用，但是该抗体仍然存在一定的缺陷，效价仍然存在一定的提高空间。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供针对视黄醇结合蛋白(RBP)具有更高结合特性的的突变的单域抗体，同时提供该单域抗体在制备检测的应用。

本发明提供一种抗体突变的方法，包括结合抗体结构数据分析，针对CDR区结构的残基进行计算机结构模拟，通过改变CDR结构域的残基是否突变以及突变的方向，将以往需要多轮突变筛选或是通过噬菌体库筛选突变的方式大大简化，将所有突变选择集中在一起进行结构分析及其可行性，直接一步获得最终的突变方案。因此相比以往方法，本方法更加简捷明确。

本发明提供一种原始的单域抗体，其VHH链序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明针对所述的单域抗体，发现其VHH链氨基酸中的第26位、第28位、第32位、第51位、55位、57位、100位、106位、110位、115位是抗体中提高抗体性能的决定性位点。

本发明另外提供一种改造后的抗体，所述抗体的VHH链分别是在SEQ ID NO：1所示序列的基础上，分别在Lys26Gly、Pro28Cys、Ser32Met、Met51Gly、Thr55Val、Ser57Gln、Leu100Thr、Arg106Asp、Tyr110Leu、Tyr115Met进行了突变。

本发明另外提供一种具体的突变组合为：Lys26Gly和Leu100Thr、Pro28Cys和Arg106Asp、Ser32Met和Met51Gly、Lys26Gly和Thr55Val、Pro28Cys和Ser57Gln、Ser32Met和Thr55Val、Ser32Met和Leu100Thr、Ser32Met和Arg106Asp、Met51Gly和Leu100Thr、Met51Gly和Arg106Asp、Met51Gly和Tyr110Leu、Met51Gly和Tyr115Met、Thr55Val和Leu100Thr、Thr55Val和Arg106Asp、Thr55Val和Tyr110Leu、Thr55Val和Tyr115Met、Ser57Gln和Leu100Thr、Ser57Gln和Arg106Asp、Ser57Gln和Tyr110Leu、Ser57Gln和Tyr115Met。

本发明另外一方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本发明所述的视黄醇结合蛋白(RBP)的突变的单域抗体的VHH链，或本发明所述的视黄醇结合蛋白(RBP)突变单域抗体。

本发明的另外一方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，它含有表达上述VHH链的编码链。

本发明的另外一方面，提供了本发明所述的视黄醇结合蛋白(RBP)突变单域抗体用于检测视黄醇结合蛋白(RBP)的用途。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明将视黄醇结合蛋白(RBP)的单域抗体通过三维建模寻找到了最优的对抗体结合起到最大功能的位点，通过特定位点的点突变获得了一系列的突变抗体，所述的抗体相对于原始的抗体，具有更好的结合结合特性以及结合的准确性，具有不可以预料的效果。同时将突变后的抗体去制备用于检测视黄醇结合蛋白的试剂盒，具有更好的应用前景。

具体实施方式

实施例1抗体突变位点的选定

首先，针对SEQ ID NO：1的VHH链进行抗体结构数据分析，针对CDR区结构的残基进行计算机结构模拟，发现，VHH链氨基酸中的第26位、第28位、第32位、第51位、55位、57位、100位、106位、110位、115位是抗体中提高抗体性能的决定性位点。

通过建模，发现，在以上位点进行特定氨基酸的突变，可以提高与视黄醇结合蛋白的结合能力，这些具体的突变形式分别为：Lys26Gly(表示在SEQ ID NO：1的第26位的Lys替换为Gly)、Pro28Cys、Ser32Met、Met51Gly、Thr55Val、Ser57Gln、Leu100Thr、Arg106Asp、Tyr110Leu、Tyr115Met、Lys26Gly和Leu100Thr、Pro28Cys和Arg106Asp、Ser32Met和Met51Gly、Lys26Gly和Thr55Val、Pro28Cys和Ser57Gln、Ser32Met和Thr55Val、Ser32Met和Leu100Thr、Ser32Met和Arg106Asp、Met51Gly和Leu100Thr、Met51Gly和Arg106Asp、Met51Gly和Tyr110Leu、Met51Gly和Tyr115Met、Thr55Val和Leu100Thr、Thr55Val和Arg106Asp、Thr55Val和Tyr110Leu、Thr55Val和Tyr115Met、Ser57Gln和Leu100Thr、Ser57Gln和Arg106Asp、Ser57Gln和Tyr110Leu、Ser57Gln和Tyr115Met任一一种形式。

实施例2突变抗体的制备

通过全序列合成的方式，获得了编码SEQ ID NO：1氨基酸序列的编码核苷酸序列，在生物工程公司合成。采用定点突变法分三段扩增带有上述突变位点的序列，然后用搭桥PCR法，扩增得到突变抗体RBP的编码基因序列。将前面所获得30种不同的单域抗体亚克隆至表达性的载体PET32a中，并将测序鉴定正确的重组质粒转化到表达型宿主菌DE3中，其涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基的板上，37℃过夜。(2)挑选单个菌落接种在10mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。(3)接种1mL的过夜菌种至300mLLB培养基中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.9时，加入IPTG，28℃摇床培养过夜，(4)第二天，离心收菌。(5)将菌体破碎以获得抗体粗提液。(6)经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白，为获得高纯度的抗体，采用咪唑梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱液(50mmol)用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液(250mmol，500mmol)最终可制备纯度达95％以上的蛋白。将蛋白浓度调整为100mg/ml。

实施例3抗体性质分析

1、表面胞质团共振法测突变体抗体的结合常数Kd

抗原人血液中提取的视黄醇结合蛋白(RBP)(购自南京汇标生物科技有限公司)。利用Biacore 3000测突变后的抗体与抗原的绝对亲和力。选用CM-5传感片，表面吸附羧甲基葡聚糖。两个流通池(pathway)均以20μ1/min的流速活化6min,将5μg抗原RBP溶于50mMpH7.0的磷酸溶液，以15μl/min的流速注入芯片流通池1，其表面密度约为10KRu，抗原标记后再用1M乙醇胺将芯片表面封闭。结合条件：各检测抗体原液浓度为1Omg/ml,依次稀释成200μg/ml,100μg/ml,50μg/ml,25μg/ml,12μg/ml,0μg/ml,以10μl/min的速度注入芯片的两个流通池,上样3min；解离条件：流速10μl/min,解离3min。芯片再生条件：10mM NaOH,1MNaCl。用Biacore evaluation软件分析抗体亲和常数KD。结果如下：

从以上结果可以看出，经过突变后的抗体其亲和常数得到大大的提高，对于抗原的结合能力也提高了一个数量级。但是针对位点的突变，也不是任一的突变都具有提高抗体亲和力的效果，比如Tyr27Ser、Ser57Met、Arg106Leu均导致抗体的亲和力大幅度的降低，其它的位点突变也不能提高抗体的亲和力，在此不一一列举。

实施例4：视黄醇结合蛋白(RBP)突变的单域抗体检测特异性分析：

(1)将视黄醇结合蛋白(RBP)前白蛋白包被在酶标板上，同时做空白孔对照，各包被两个孔，将相应的突变的单域抗体及对照抗体前白蛋白单域抗体分别转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。(2)用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouse anti-HAtag antibody(抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司)，在室温下放置1小时。(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入二抗anti-mouse alkaline phosphataseconjugate(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司)，在室温下放置1小时。(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。结果显示视黄醇结合蛋白(RBP)突变的单域抗体能特异性的识别RBP，而对照不能结合RBP。说明本发明的制备的到的突变抗体，能够特异性的用于检测RBP。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

〈110〉查文娟

〈120〉一种用于肾脏损伤检测用试剂盒

〈160〉1

<210> 1

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Pro Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Lys Tyr Pro Tyr Ser Gly Ser

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Met Phe Thr Gly Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asn Val Ala Lys Asn Thr Leu Asp

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Asp Leu Leu Pro Arg Ser Thr Arg Cys Leu Asp Tyr Gly Leu

100 105 110

Arg Thr Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Claims

1.一种用于肾脏损伤检测用试剂盒，其含有单域抗体，所述抗体含有VHH链，其序列如SEQ ID No：1所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：在SEQ ID No：1所示序列的基础上，存在如下的任一突变：Lys26Gly、Pro28Cys、Ser32Met、Met51Gly、Thr55Val、Ser57Gln、Leu100Thr、Arg106Asp、Tyr110Leu或Tyr115Met；或者是如下任一的组合：Lys26Gly和Leu100Thr、Pro28Cys和Arg106Asp、Ser32Met和Met51Gly、Lys26Gly和Thr55Val、Pro28Cys和Ser57Gln、Ser32Met和Thr55Val、Ser32Met和Leu100Thr、Ser32Met和Arg106Asp 、Met51Gly 和Leu100Thr、Met51Gly 和Arg106Asp、Met51Gly 和Tyr110Leu、Met51Gly 和Tyr115Met、Thr55Val和Leu100Thr、Thr55Val和Arg106Asp、Thr55Val和Tyr110Leu、Thr55Val和Tyr115Met、Ser57Gln和Leu100Thr、Ser57Gln和Arg106Asp、Ser57Gln和Tyr110Leu 、Ser57Gln和Tyr115Met。

3.根据权利要求1或2中所述的单域抗体在制备用于肾脏损伤检测中的试剂盒应用。