CN110373399B - 一种沼泽红假单胞菌Atps2蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种沼泽红假单胞菌Atps2蛋白及其制备方法和应用，属于生物农药技术领域；所述沼泽红假单胞菌Atps2蛋白，所述的沼泽红假单胞菌Atps2蛋白由沼泽红假单胞菌ATPS2基因在大肠杆菌中原核表达并经过蛋白纯化得到；所述的沼泽红假单胞菌为沼泽红假单胞菌LY‑6菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014525，保藏日期为2014年11月5日。针对现有生物农药中尚无有效进行稻瘟病菌防治的问题，本发明提供一种沼泽红假单胞菌Atps2蛋白及其制备方法和应用，它可以有效抑制稻瘟病菌。

Description

一种沼泽红假单胞菌Atps2蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物农药技术领域，具体地说，涉及一种沼泽红假单胞菌Atps2蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
ATP合酶是生物体内能量代谢的关键酶，参与氧化磷酸化和光合磷酸化反应，广泛存在于叶绿体、线粒体和细菌中，是位于线粒体内膜、叶绿体类囊体膜和光合菌质膜上的参与呼吸链氧化磷酸化的最后环节。ATP合酶（ATP synthase）由F0和F1两部分构成，在动物包括昆虫中主要参与氧化磷酸化过程中ATP的合成。ATP合酶β亚基是ATP合酶中保守性较低的亚基，主要起连接和固定F0和F1复合体的装配作用，ATP合酶β亚基对于ATP合酶功能的正常发挥不可或缺，β亚基是F1F0-ATP合成酶F1亚单位的重要组件，该亚基包含ATP合成和水解所需的催化位点，其功能好坏与疾病发生直接相关。当前，ATP合酶β亚基在农业上的应用还未曾有报道。
稻瘟病是水稻的重要病害之一，该病分布广泛，全世界约有80余个国家和地区发生此病，我国南北稻区也均有发生。病害流行地区，一般减产10%-20%，严重时可达40%-50%，特别重的田块甚至颗粒无收。对于稻瘟病的防治，目前还是以化学防治为主，但由于抗药性增强及发现不及时，农药施用极不科学合理，农药施用剂量与次数严重超标，引起环境污染和农产品质量安全等重大问题。因此，如何减少农药用量以及绿色综合防控稻瘟病仍然是当前我国水稻生产上面临的重要问题。
生物防治以其无毒、无害、无污染、不易产生抗药性和高效等优点，在植物病虫害防治中越来越受到人们的重视。目前在稻瘟病的生物防治研究方面已经取得了一定的进展。在微生物源生物农药中，目前仅发现芽孢杆菌和木霉属真菌能有效的抑制稻瘟病菌的营养生长。
发明内容
要解决的问题
针对现有生物农药中尚无有效进行稻瘟病菌防治的问题，本发明提供一种沼泽红假单胞菌Atps2蛋白及其制备方法和应用，它可以有效抑制稻瘟病菌。
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种沼泽红假单胞菌Atps2蛋白，所述的沼泽红假单胞菌Atps2蛋白由沼泽红假单胞菌Atps2基因表达得到。
优选地，所述的沼泽红假单胞菌为沼泽红假单胞菌LY-6菌株，分类命名为：Rhodopseudomonas palustris LY-6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址在中国武汉大学，为存活状态，保藏编号为CCTCC NO:M2014525，保藏日期为2014年11月5日。
一种沼泽红假单胞菌Atps2蛋白的制备方法，
包括以下步骤：
所述的沼泽红假单胞菌Atps2蛋白由沼泽红假单胞菌ATPS2基因在大肠杆菌中原核表达并经过蛋白纯化得到。
优选地，所述的原核表达的步骤为：
（1）构建载体：将沼泽红假单胞菌Atps2基因的核苷酸序列连接到含药物抗性基因的质粒上；
（2）大肠杆菌转化：将步骤（1）中构建后的质粒导入表达感受态细胞中，涂布在含药物抗性的LB平板上进行培养；
（3）转化菌株扩培与蛋白诱导：将步骤（2）中培养出的单菌落挑出继续培养至稳定期；接着进行扩培，培养至对数生长期，加入IPTG，诱导目的蛋白的表达。
优选地，所述的含药物抗性基因的质粒为PET32a；所述的含药物抗性的LB平板为含氨苄抗性的LB平板。
优选地，所述的含氨苄抗性的LB平板的培养基，配方为：酵母提取物 5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、氨苄 100mg/L、琼脂 15g/L。
优选地，所述的IPTG的终浓度为1M；所述的诱导的温度为25℃。
优选地，所述的蛋白纯化的步骤为：将步骤（3）中蛋白诱导后的菌液进行离心及柱纯化处理。
优选地，所述柱纯化处理为采用His标签过柱纯化蛋白。
一种沼泽红假单胞菌Atps2蛋白在抑制稻瘟病菌中的应用。
、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
（1）所述的沼泽红假单胞菌Atps2蛋白由沼泽红假单胞菌ATPS2基因首次在大肠杆菌中原核表达并经过蛋白纯化得到，生产工艺简单、培养时间短、成本低；
（2）所述沼泽红假单胞菌Atps2蛋白首次发现可有效抑制稻瘟病菌分生孢子附着胞的形成，且还可以有效抑制稻瘟病菌的致病性，并具有对环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便、成本低等特点。
附图说明
图1为实施例1中Atps2蛋白的SDS-PAGE胶条带；
图2为实施例2中Atps2蛋白对稻瘟病菌分生孢子附着胞形成率的影响；
图3为实施例2中Atps2蛋白对稻瘟病菌致病性的影响；
图4为实施例3中FabA蛋白、BamA蛋白和Atps2蛋白分别对稻瘟病菌分生孢子附着胞形成率的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。本申请中所述的沼泽红假单胞菌Atps2蛋白由沼泽红假单胞菌ATPS2基因（源自F0F1型ATP合成酶β亚基，碱基对1443bp，蛋白分子量50.8kD）表达得到，所述的沼泽红假单胞菌为沼泽红假单胞菌LY-6菌株，分类命名为：Rhodopseudomonas palustris LY-6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址在中国武汉大学，为存活状态，保藏编号为CCTCC NO:M2014525，保藏日期为2014年11月5日。
实施例1
沼泽红假单胞菌Atps2蛋白的制备方法，
包括以下步骤：
（1）沼泽红假单胞菌ATPS2基因在大肠杆菌中原核表达
构建载体：将沼泽红假单胞菌ATPS2基因的核苷酸序列连接到含氨苄抗性基因的PET32a质粒上；
大肠杆菌转化：将上一步骤中构建后的质粒导入表达感受态细胞BL21中，涂布在含氨苄抗性的LB平板上进行培养；所述的含氨苄抗性的LB平板的培养基，配方为：酵母提取物 5g/L、蛋白胨 10g/L、NaCl 5g/L、氨苄 100mg/L、琼脂 15g/L，pH=7.0；
转化菌株扩培与蛋白诱导：将上一步骤中培养出的单菌落接入至120mL锥形瓶中，37℃培养至稳定期；接着将处于稳定期的菌液接种到另一锥形瓶中进行扩培，接种量为总体积的5%，培养条件为37℃、pH=7.0，培养至对数生长期，加入终浓度为1M的IPTG，25℃诱导目的蛋白的表达；
（2）沼泽红假单胞菌Atps2蛋白的纯化
将上一步骤中蛋白诱导后的菌液进行离心，使得菌破壁，接着利用His标签过柱纯化蛋白，并通过SDS-PAGE胶验证目的蛋白表达，如图1所示，Atps2蛋白得以有效表达及纯化。
实施例2
沼泽红假单胞菌Atps2蛋白在抑制稻瘟病菌中的应用
（1）沼泽红假单胞菌Atps2蛋白在抑制稻瘟病菌分生孢子附着胞形成上的应用
选择实施例1制备的沼泽红假单胞菌Atps2蛋白（终浓度分别为0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml），将其添加到稻瘟病菌分生孢子液（1×105个/ml）中进行混合，随后取30μl滴加到疏水膜上，每个组（对应为CK组、50μg/ml组、100μg/ml组、200μg/ml组、500μg/ml组）设3个重复，8小时后显微观察并统计其附着胞形成率，评定各自抑制效果；
如图2所示，结果表明终浓度为100 ug/mL的沼泽红假单胞菌Atps2蛋白处理后附着胞的形成率与CK组及其他处理组有显著差异，较高浓度的Atps2蛋白对附着胞的形成具有显著性的抑制效果，具有很好的应用前景。
（2）沼泽红假单胞菌Atps2蛋白在稻瘟病菌致病性上的应用
选择实施例1制备的沼泽红假单胞菌Atps2蛋白（终浓度为500μg/mL），添加到含质量分数为0.2%明胶的稻瘟病菌分生孢子液（1×105个/ml）中并制成孢子悬浮液，使用喉头喷雾器将孢子悬浮液均匀地喷洒到生长2周左右的健康水稻叶片上，随后将水稻移入28℃、黑暗、高湿（RH＞95%）的容器内培养24h后，置于光暗交替（各12h）且高湿的容器内继续培养，设置CK对照（用同等量的水替换ATSP2蛋白）和PBS对照（用同等量的PBS缓冲液替换Atps2蛋白），每个处理设3个重复，7d后观察结果。
如图3所示，CK对照与PBS对照分别处理后，可以从水稻叶片上明显观察到沼泽红假单胞菌的典型病斑，且典型病斑数量较多，而Atps2蛋白处理后，相应的病斑明显较小，且数量极少，这表明Atps2蛋白处理能显著抑制稻瘟病菌在水稻上的致病性。
实施例3
参照实施例2中“沼泽红假单胞菌Atps2蛋白在抑制稻瘟病菌分生孢子附着胞形成上的应用”，将原核表达后，分别选用浓度为500 ug/mL 3-羟基酰基脱水酶FabA、外膜蛋白组装因子BamA以及Atps2蛋白进行试验，统计其附着胞形成率。其中3-羟基酰基脱水酶FabA源自3-羟基酰基-[酰链蛋白]脱水酶，碱基对525bp，蛋白分子量为18.8kD；其中外膜蛋白组装因子BamA源自外膜蛋白组装因子，碱基对2454 bp，蛋白分子量为93.5kD。
如图4所示，Atps2蛋白处理后稻瘟病菌分生孢子附着胞形成率不到10%，显著低于CK对照（**代表极显著差异），而FabA蛋白和BamA蛋白处理后与CK对照比无差异；与FabA蛋白和BamA蛋白相比，试验结果表明沼泽红假单胞菌中的三种蛋白中只有Atps2蛋白对稻瘟病菌有显著抑制作用。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

Claims (1)

1.一种沼泽红假单胞菌Atps2蛋白在抑制稻瘟病菌中的应用，其特征在于：所述的沼泽红假单胞菌Atps2蛋白由沼泽红假单胞菌ATPS2基因表达得到，所述的Atps2蛋白为沼泽红假单胞菌的ATP合成酶β亚基；所述的沼泽红假单胞菌为沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）LY-6 菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2014525，保藏日期为2014年11月5日。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101065397A (zh) * 2004-09-28 2007-10-31 詹森药业有限公司 一种细菌atp合酶的结合结构域
CN104404042A (zh) * 2014-11-14 2015-03-11 重庆大学 一种东亚飞蝗ATP合酶β亚基基因及其dsRNA在害虫防治中的应用
CN105368765A (zh) * 2015-10-15 2016-03-02 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 一种重组生产克氏原螯虾atp合酶f0亚基6蛋白的方法
EP3057419A1 (en) * 2013-10-18 2016-08-24 BASF Agrochemical Products B.V. Agricultural mixtures comprising carboxamide compound

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105200001A (zh) * 2015-10-15 2015-12-30 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 一种高表达克氏原螯虾atp合酶f0亚基8的基因工程菌
CN107988244B (zh) * 2017-11-12 2020-09-15 中国计量大学 褐飞虱生存相关的ATPSb基因、编码蛋白及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101065397A (zh) * 2004-09-28 2007-10-31 詹森药业有限公司 一种细菌atp合酶的结合结构域
EP3057419A1 (en) * 2013-10-18 2016-08-24 BASF Agrochemical Products B.V. Agricultural mixtures comprising carboxamide compound
CN104404042A (zh) * 2014-11-14 2015-03-11 重庆大学 一种东亚飞蝗ATP合酶β亚基基因及其dsRNA在害虫防治中的应用
CN105368765A (zh) * 2015-10-15 2016-03-02 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 一种重组生产克氏原螯虾atp合酶f0亚基6蛋白的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"F0F1 ATP synthase subunit beta [Rhodopseudomonas palustris]";NCBI;《GenBank DataBase》;20190621;Accession No.WP_044415108 *
Torque Transmission Mechanism via DELSEED Loop of F1-ATPase;Rikiya Watanabe;《Biophysical Journal》;20150121;第108卷;全文 *
水稻地方品种月亮谷与LTH叶片蛋白质的双向电泳分析;余萍等;《云南农业大学学报》;20120430;第27卷(第4期);摘要 *

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