CN105368765A - 一种重组生产克氏原螯虾atp合酶f0亚基6蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组生产克氏原螯虾ATP合酶F0亚基6蛋白的方法，属于基因工程技术领域。本发明通过全基因合成获得atp6基因，构建重组表达载体pColdII-atp6并转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)实现高效表达，为后续针对克氏原螯虾卵巢“眼柄切除效应”分子机制的深入研究奠定了重要基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种高表达克氏原螯虾ATP合酶F0亚基6的基因工程菌，属于基因工程技术领域。
背景技术
“眼柄切除诱导虾蟹类甲壳动物卵巢快速发育成熟”(简称虾蟹卵巢“眼柄切除效应”)存在相似的分子机制，阐明分子机制具有重要科学意义和应用前景。如何实现无/弱副作用的人工卵巢发育调控一直是经济虾蟹养殖的重要难题之一。目前人们虽已摸索出不少促虾蟹卵巢快速成熟方法，如控温、控光、强化营养条件、激素处理等，但眼柄切除仍是不少虾蟹人工育苗生产中促进亲虾卵巢快速成熟及产卵的最常用、最有效方法。目前在虾蟹繁殖季节，人工切除雌性虾蟹的单侧眼柄用以促进卵巢同步发育、快速成熟，提高抱卵量，已在不少国家较为普遍应用于多种海洋和淡水经济虾蟹(如斑节对虾、大西洋龙虾、锯缘青蟹等)的规模化养殖中。然而，应用实践中会出现无法避免的副作用：切除眼柄后易致亲体蜕皮周期缩短、死亡率上升、卵子质量下降等不良后果。虾蟹卵巢“眼柄切除效应”存在相似的分子机制，深入阐明该分子机制将非常有助于发掘到新的、更合理的人工生殖调控分子靶点，从而指导发展可替代眼柄切除、无/弱副作用的人工卵巢促熟思路和方法，对于经济虾蟹类人工养殖业的发展具有重要价值。克氏原螯虾(Procambarusclarkii)，俗称龙虾、小龙虾，隶属节肢动物门、甲壳纲、十足目，是具较高经济价值的水产养殖品种之一；同时，克氏原螯虾还具有成本低、易饲养、体型较大易于实验操作等优点，因此是研究虾蟹类卵巢“眼柄切除效应”分子机制的一种非常好的代表动物。
ATP合酶F0是线粒体内膜上电子传递链的组成部分，是一个嵌合在膜上的疏水蛋白复合体，形成一个跨膜质子通道，参与细胞能量代谢。我们前期的研究发现ATP合酶F0在克氏原螯虾眼柄切除后的中期及晚期表达水平均逐渐提高，至卵巢发育至成熟期时(～15day)表达水平达到最高，与卵巢成熟标志物vitellogenin动态表达模式类似，表明其在克氏原螯虾“眼柄切除效应”过程中具有重要功能。为深入探究ATP合酶F0在克氏原螯虾“眼柄切除效应”诱导卵巢快速发育成熟中的作用和调控模式，首先需要制备大量高活性的ATP合酶F0蛋白，并用以制备多/单克隆抗体。本专利使用大肠杆菌重组表达系统，构建高表达克氏原螯虾ATP合酶F0亚基6蛋白的基因工程菌，为后续深入研究克氏原螯虾卵巢“眼柄切除效应”的分子机制奠定基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高表达克氏原螯虾ATP合酶F0亚基6的基因工程菌，是将基因atp6导入E.coliBL21(DE3)得到的基因工程菌。
所述基因atp6的序列是根据GeneBank中来源于克氏原螯虾(Procambarusclarkii)的SequenceID：AFQ31581的序列进行全基因化学合成得到。
本发明的第二个目的在于提供上述基因工程菌的构建方法，成功过表达获得了克氏原螯虾ATP合酶F0亚基6蛋白，其步骤如下：
(1)设计引物atp6-1：(5′-TCAGGAGGTACCATGATAACAAGATTATTTAGA-3′)和atp6-2：(5′-ACTGAGAAGCTTTTAATTTACTTCTCTAGCATATAAAG-3′)，利用PCR将克氏原螯虾ATP合酶F0亚基6基因的cDNA编码框5’和3’两侧分别引入KpnΙ和HindΙII限制性酶切位点(下划线显示)；
(2)通过双酶切、分子连接等基因操作将atp6基因插入到表达质粒pColdII，构建重组质粒pColdII-atp6；
(3)随后将pColdII-atp6转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，通过氨苄抗生素平板筛选阳性转化子并进行测序验证。
本发明选取大肠杆菌冷休克表达载体pColdII，构建了重组表达载体pColdII-atp6，利用大肠杆菌系统成功高可溶性表达获得了克氏原螯虾ATP合酶F0亚基6蛋白，并对表达的ATP合酶F0亚基6蛋白进行了纯化及免疫印迹分析。
本发明相比现有技术的有益效果：本发明首次以大肠杆菌为表达宿主实现了克氏原螯虾ATP合酶F0亚基6的高效重组表达，重组表达的可溶性ATP合酶F0亚基6蛋白的表达量约占表达株BL21(DE3)菌体总蛋白量的42％，大部分为可溶性状态，目前国际上尚未见任何有关重组表达克氏原螯虾ATP合酶F0亚基6蛋白的报道。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1克氏原螯虾atp6基因的获得
根据GenBank数据库中已公开的克氏原螯虾atp6基因(SequenceID：AFQ31581)序列进行全基因化学合成。
实施例2克氏原螯虾ATP合酶F0亚基6的大肠杆菌重组表达、纯化及免疫印迹鉴定
设计引物atp6-1：(5′-TCAGGAGGTACCATGATAACAAGATTATTTAGA-3′)和atp6-2：(5′-ACTGAGAAGCTTTTAATTTACTTCTCTAGCATATAAAG-3′)，利用PCR将克氏原螯虾ATP合酶F0亚基6基因的cDNA编码框5’和3’两侧分别引入KpnΙ和HindΙII限制性酶切位点(下划线显示)，通过双酶切、分子连接等基因操作将atp6基因插入到商业化表达质粒pColdII，构建重组质粒pColdII-atp6。随后将pColdII-atp6转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，通过氨苄抗生素平板筛选阳性转化子并进行测序验证，随后利用IPTG进行重组NADH脱氢酶亚基III蛋白的诱导表达。培养基成分为：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeastextract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，pH7.4。
诱导表达条件为：将重组表达质粒pColdII-atp6转化大肠杆菌BL21(DE3)。含重组质粒的工程菌在37℃条件下剧烈震荡培养至OD600≈0.5，随后转入15℃培养并加入终浓度为0.2mM的IPTG，诱导表达20h，转速180rpm。收集菌体，SDS-PAGE分析全菌总蛋白显示，基因工程菌经诱导后有明显的特异表达条带，条带分子量与预期大小分子量～25kD一致。在此条件下，重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白量的42％，大部分为可溶性状态。诱导表达后，超声破碎菌体，利用Ni+柱亲和层析法纯化得到可溶性ATP合酶F0亚基6，咪唑洗脱浓度为450mM。进一步利用免疫印迹法对重组ATP合酶F0亚基6进行表达鉴定分析。上述相关方法均采用常规操作步骤。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (4)
1.一种高效表达克氏原螯虾ATP合酶F0亚基6蛋白的基因工程菌，是将atp6基因导入E.coliBL21(DE3)得到的基因工程菌。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述atp6基因的核苷酸序列如GeneBank中SequenceID：AFQ31581的序列所示。
3.一种构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其步骤如下：
(1)设计引物atp6-1：(5′-TCAGGAGGTACCATGATAACAAGATTATTTAGA-3′)和atp6-2：(5′-ACTGAGAAGCTTTTAATTTACTTCTCTAGCATATAAAG-3′)，利用PCR将克氏原螯虾ATP合酶F0亚基6基因的cDNA编码框5’和3’两侧分别引入KpnΙ和HindΙII限制性酶切位点；
(2)通过双酶切、分子连接等基因操作将atp6基因插入到表达质粒pColdII，构建重组质粒pColdII-atp6；
(3)随后将pColdII-atp6转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，通过氨苄抗生素平板筛选阳性转化子并进行测序验证；
所述限制性酶切位点以加下划线的字母表示。
4.一种以权利要求1所述基因工程菌生产ATP合酶F0亚基6蛋白的方法，其步骤如下：将重组表达质粒pColdII-atp6转化大肠杆菌BL21(DE3)。含重组质粒的工程菌在37℃条件下剧烈震荡培养至OD600≈0.5，随后转入15℃培养并加入终浓度为0.2mM的IPTG，诱导表达20h，转速180rpm。收集菌体，SDS-PAGE分析全菌总蛋白显示，基因工程菌经诱导后有明显的特异表达条带，条带分子量与预期大小分子量～25kD一致。在此条件下，重组ATP合酶F0亚基6蛋白的表达量约占菌体总蛋白量的42％，大部分为可溶性状态。
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