KR20220011646A - 노균병 저항성 시금치와 노균병 저항성을 부여하는 유전자 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 페로노스포라 파리노사(Peronospora farinosa, Pfs)에 의해 유발된 노균병에 저항성을 갖는 시금치 식물에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 시금치 식물에서 Pfs의 다중 품종에 대한 저항성을 부여하는 저항성 유전자에 관한 것이다. 또한, 본 개시내용은 노균병에 저항성인 시금치 식물을 수득하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 개시내용은 페로노스포라 파리노사(Peronospora farinosa, Pfs)에 의해 유발된 노균병에 저항성을 갖는 시금치 식물에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 시금치 식물에서 Pfs의 다중 품종에 대한 저항성을 부여하는 저항성 유전자에 관한 것이다. 또한, 본 개시내용은 노균병에 저항성인 시금치 식물을 수득하는 방법에 관한 것이다.
시금치(스피니치아 올레라시아(Spinacia oleracea))는 다양한 환경에서 자란 밭작물(open field crop)이다. 시금치는 시원하고 습한 봄철 기간, 시원한 여름, 및 건조한 가을이 있는 지역에서 잘 자라는 이배체 작물(diploid crop)이다. 시금치 재배를 위한 최적의 토양 조건은 배수가 잘 되는 토양과 pH 6 초과이다. 오늘날, 시금치 육종은 주로 질병 저항성(예를 들어, 노균병 저항성), 작물 수확량 및 개선된 영양가에 중점을 둔다.
육종 및 선별(screening) 활동은 현지 시장 적응과 동적 저항성이 성공의 중요한 요소인 주요 생산 지역에서 시금치 변종을 선택하는 데 도움이 된다. 시금치 육종 프로그램은 신선 (아기잎) 시장, 다발(bunching) 시장뿐만 아니라, 냉동 및 통조림 제품 시장과 같은 모든 시장 부문에 변종을 제공하는 것을 목표로 한다. 주요 유형 내에서 몇 가지 특정 변종의 시금치를 사용할 수 있다: 스무드(smooth), 사보이(savoy) 및 오리엔탈(oriental) 형들. 시금치 시장은 전 세계적으로 빠르게 성장하고 있으며 시금치 유전학을 개선하기 위한 많은 연구가 수행되고 있다. 시금치 유전학 개선의 구체적인 목표는 질병 저항성을 개선하고, 생화학 물질이나 살충제의 필요성을 줄이며, 작물 수확량과 작물 품질을 향상시키는 것이다. 육종 프로그램의 추가 목표는 페로노스포라 파리노사에 의해 유발된 노균병에 대한 광범위한 저항성을 가진 시금치 변종으로, 이것은 이상적으로는 이미 미래의 긴장을 고려한 것이다.
노균병은 식물에 기생하는 여러 종류의 난균류를 말한다. 노균병은 다양한 종에서 유래할 수 있지만, 주요 노균병 속은 페로노스포라(Peronospora), 플라스모파라(Plasmopara), 및 브레미아(Bremia)이다. 노균병은 많은 식량작물에서 문제이며, 시금치에서 가장 문제가 되는 질병 중 하나이다. 시금치에서 노균병은 페로노스포라 파리노사(Pfs)에 의해 유발되고, 이 병원체는 전 세계적으로 이 작물의 생산에 영향을 미친다. 질병은 공기 중 포자를 통해 식물에서 식물로 퍼진다. 노균병에 감염된 시금치는 상부 잎 표면 상에 변색된 영역과 불규칙한 황색 반점(yellow patch)과 하부 잎 표면 상에 위치한 흰색, 회색 또는 보라색 곰팡이(mould)와 함께 증상을 보인다. 병변은 결국 마르고 갈색으로 변할 수 있다.
살균제는 페로노스포라 파리노사를 제어하는 데에 사용될 수 있지만, 결국 페로노스포라 파리노사는 이러한 화학 물질들에 면역이 되는데, 왜냐하면 시간이 지나면서병원체(pathogen)도 살균제에 저항성을 갖게 되기 때문이다. 또한 시장은 식품 작물의 생산에 이러한 화학 물질의 사용을 줄이기를 원한다. 따라서, 페로노스포라 파리노사 감염을 제어하기 위한 다른 방법을 찾는 것이 가장 중요하다. 가장 바람직한 제어의 형태는 페로노스포라 파리노사에 대한 광범위한 저항성을 제공하는 저항성 유전자일 것이다. 또한, 하나 이상의 저항성 유전자(예를 들어, 더 좁은 저항성을 가짐)들이 조합되어 페로노스포라 파리노사에 대한 광범위하고 내구성 있는 저항성이 달성될 수 있다. 따라서, 새로운 저항성 유전자의 식별은 화학적 제어에 대한 유망한 대안이다.
현재까지 페로노스포라 파리노사의 공식 품종들은 17종으로 확인되었다(Pfs1 내지 Pfs17). 이러한 품종의 특성화는 다양한 식물 병원체들의 품종을 식별하는 데 널리 사용되는 접근 방식인 상이한 숙주들(차이점들)의 특정 세트에 대한 질적 질병 반응을 기반으로 한다. 시금치의 경우, 현재 차동품(differentials) 세트에는 신규 및 기존 상업용 잡종뿐만 아니라 방임 수분 품종(open-pollinated cultivars) 및 육종 계통(breeding lines)(NIL 계통)이 포함된다. 시금치의 노균병은 특히 복잡하고 질병 저항성을 피하기 위해 빠르게 진화하기 때문에 이러한 범위의 감별이 필요하다. 질병 저항성 유전자의 압력 하에서, 병원체는 질병 저항성을 분해하기 위해 돌연변이를 일으키며, 이는 감염을 통제하기 위해 작물의 새로운 질병 저항성이 필요함을 의미한다. 노균병에는 많은 다양한 품종이 있으며, 새로운 저항성 노균병 품종, 즉 현재의 시금치 저항성을 깨뜨리는 품종들이 항상 등장한다. 새로운 시금치 저항성이 생긴 후 4~6개월 이내에 돌파구를 찾을 수 있다. 주요 문제는, 페로노스포라 파리노사가 새로운 악성의(virulent) 품종들을 빠르게 진화시킴에 따라 상이한 저항성을 결합한 현재 시장에 나와 있는 시금치 변종들이 매우 빨리 구식이 된다는 것이다. 지난 몇 년 동안 시금치에서 페로노스포라 파리노사의 새로운 품종이 등장하면서, 치명적인(devastating) 질병에 한발 앞서가는 것이 점점 더 어려워졌다.
현재 페로노스포라 파리노사의 모든 품종에 대해 전체 스펙트럼 저항성을 제공하는 단일 저항성 유전자는 없다. 따라서, 다중 저항성 유전자(multiple resistance genes)를 시금치 식물에 결합하거나 쌓는 것은 이점이며, 즉, 식물이 다중 저항성 유전자를 포함하고 모든 페로노스포라 파리노사 품종에 저항성이 있거나, 적어도 가능한 한 많은 페로노스포라 파리노사 품종에 저항성이 있는 식물이 수득된다.
상기의 점을 고려할 때, 당업계에서는 시금치에 더 다양하고 지속성 있는 저항성을 개발하고, 페로노스포라 파리노사에 의해 유발된 노균병에 저항성인 시금치 식물을 제공할 필요가 있다. 특히, 페로노스포라 파리노사에 대해 광범위 스펙트럼 저항성을 갖는 시금치 식물을 제공할 필요가 있다. 또한, 이러한 노균병 저항성 식물을 얻는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 상업적 잡종(hybrids)에서 더 많은 유전적 변이(genetic variation)를 달성할 수 있도록 유전자의 다양성이 더 필요하여 페로노스포라 파리노사와 같은 병원체가 적응하기가 더 어렵다. 이들 유전자의 저항성이 넓을수록, 저항성 식물의 발달에 더 효과적으로 사용될 수 있다.
본 개시내용의 목적은, 다른 목적들 중에서, 당업계의 상기 요구를 해결하는 것이다. 본 개시내용의 목적은, 다른 목적들 중에서, 첨부된 청구범위에 개략된 바와 같이 본 개시내용에 의해 충족된다.
구체적으로, 다른 목적들 중에서, 상기 목적은, 제1 측면에 따라 페로노스포라 파리노사(Pfs)에 의해 유발된 노균병에 저항성인 시금치 식물에 의해 본 개시내용에 의해 충족되며, 여기서 상기 시금치 식물은 하나 이상의 저항성 유전자를 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 저항성 유전자는 SEQ ID No. 4와 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 암호화하고, 여기서 상기 단백질은 보존된 아미노산 서열 KDHKIEKE 및 보존된 아미노산 서열 LSNNRNLKIL을 포함한다. 본 개시내용의 새로운 후보 우성 Pfs 저항성 유전자의 확인은 또한 CC-NBS-LLR 유전자로 공지되어 있다. 새로운 저항성 유전자가 발견되었으며, 보다 구체적으로 T10, T70, T71, T72, T75, T76, T83, T89, T96, T253, T18, T133, T139, T170 및 T175는 시금치에서 유전자좌 1(locus 1)의 시퀀싱 및 페로노스포라 파리노사 저항성 유전자의 유전자 매핑에 의해 획득되었다. 바람직하게는, 본 개시내용의 시금치 식물은 T10, T70, T71, T72, T75, T76, T83, T89, T96, T253, T18, T133, T139, T170, T175 군으로부터 선택된 새로운 저항성 유전자 중 적어도 2개를 포함한다.
시금치에서 이러한 새로운 저항성 유전자는 시금치 게놈의 염색체 2에 있는 유전자좌 1에 매핑되었다. 새로운 Pfs 저항성 유전자의 유사성(similarity)은 다중 정렬 소프트웨어(multiple alignment software)를 사용하여 결정되었으며 고도로 보존된 것으로 나타났다(표 1 참조). 새로운 Pfs 저항성 유전자의 코딩 서열은 적어도 ~94%의 서열 유사성(similarity)을 나타냈다. T10의 코딩 서열은 SEQ ID No.1로, T70의 코딩 서열은 SEQ ID No.3으로, T71의 코딩 서열은 SEQ ID No.5로, T72의 코딩 서열은 SEQ ID No.7로, T75의 코딩 서열은 SEQ ID No.9로, T76의 코딩 서열은 SEQ ID No.11, T83의 코딩 서열은 SEQ ID No.13으로, T89의 코딩 서열은 SEQ ID No.15로, T96의 코딩 서열은 SEQ ID No. 23으로, T253의 코딩 서열은 SEQ ID No.25으로, T18의 코딩 서열은 SEQ ID No.27으로, T133의 코딩 서열은 SEQ ID No.29로, T139의 코딩 서열은 SEQ ID No.31로, T170의 코딩 서열은 SEQ ID No.33으로, 그리고 T175의 코딩 서열은 SEQ ID No.35로 표시된다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 개시내용은 상기 하나 이상의 저항성 유전자가 단백질을 암호화하는 시금치 식물에 관한 것으로, 여기서 상기 단백질은 SEQ ID No.2, SEQ ID No.4, SEQ ID No.6, SEQ ID No.8, SEQ ID 10, SEQ ID No.12, SEQ ID No.14, SEQ ID No.16, SEQ ID No.24, SEQ ID No.26, SEQ ID No.28, SEQ ID No.30, SEQ ID No.32, SEQ ID No.34 및 SEQ ID No.36으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다. T10의 아미노산 서열은 SEQ ID No.2로, T70의 아미노산 서열은 SEQ ID No.4로, T71의 아미노산 서열은 SEQ ID No.6으로, T72의 아미노산 서열은 SEQ ID No.8로, T75의 아미노산 서열은 SEQ ID No.10으로, T76의 아미노산 서열은 SEQ ID No.12으로, T83의 아미노산 서열은 SEQ ID No.14로, T89의 아미노산 서열은 SEQ ID No.16으로, T96의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 24로, T253의 아미노산 서열은 SEQ ID No.26으로, T18의 아미노산 서열은 SEQ ID No.28으로, T133의 아미노산 서열은 SEQ ID No.30으로, T139의 아미노산 서열은 SEQ ID No.32으로, T170의 아미노산 서열은 SEQ ID No.34로, 그리고 T175의 아미노산 서열은 SEQ ID No.36으로 표시된다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 개시내용은 시금치 식물에 관한 것으로서, 여기서 하나 이상의 유전자는 SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7, SEQ ID No.9, SEQ ID No.11, SEQ ID No.13, SEQ ID No.15, SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.33 및 SEQ ID No.35로 이루어진 군으로부터 선택된 코딩 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 개시내용은 하나 이상의 저항성 유전자가 단백질을 암호화하는 것인 시금치 식물에 관한 것으로, 여기서 상기 단백질은 아미노산 서열 KDHxIzKE를 포함하고, 여기서 x는 아미노산 K 또는 E, 바람직하게는 K이고, 여기서 z는 아미노산 K 또는 E, 바람직하게는 E이다. 아미노산 서열 KDHxIzKE는 바람직하게는 단백질에서 429와 449 사이의 아미노산 위치에 상응한다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 개시내용은 하나 이상의 저항성 유전자가 단백질을 암호화하는 시금치 식물에 관한 것으로, 여기서 상기 단백질은 아미노산 서열 LSNNRNLKIL을 포함한다. 아미노산 서열 LSNNRNLKIL은 바람직하게는 단백질에서 592 내지 612 사이의 아미노산 위치에 상응한다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 개시내용은 상기 저항성 유전자가 단백질을 암호화하는 시금치 식물에 관한 것으로, 여기서 상기 단백질은 아미노산 서열 KDHKIEKE 및/또는 아미노산 서열 LSNNRNLKIL로 구성된다. 본 개시내용의 새로운 Pfs 저항성 유전자의 단백질은 단백질, KDHKIEKE 및/또는 LSNNRNLKIL 내의 특정 위치에서 적어도 하나의 보존된 아미노산 서열을 공유한다.
본 개시내용은 일반적으로 하나 이상의 저항성 유전자를 갖는 식물, 예를 들어 아미노-말단 도메인에 CC 모티프를 갖는 NBS-LRR 단백질 (또한 NLR로 공지됨)을 암호화하는 R 유전자를 갖는 식물에 관한 것이다. NLR은 뉴클레오티드-결합(NB-ARC) 도메인과 일련의 C-말단 류신-풍부 반복(leucine-rich repeats; LRRs)으로 구성된 고유한 도메인 구조를 가지고 있으며, 대부분은 톨/인터루킨-1 수용체(Toll/interleukin-1 receptor; TIR) 도메인, 코일형-코일 도메인(coiled-coil domain; CC), 또는 발산형 또꼬인나선 도메인(divergent coiled-coil domain; CCR)으로 이루어진 고유한 도메인 구조체를 갖고 있다. NLR은 이펙터에 결합하고 인식할 수 있거나 그것의 이펙터 기능을 통해 다른 식물 구성 요소의 변형을 인식할 수 있다. 본 발명의 저항성 식물의 단백질에서 KDHKIEKE 모티프는 이들 단백질의 NB-ARC 도메인, 다른 R 단백질, 및 APAF-1과 CED-4와 같은 단백질, 즉 아포토시스 조절 네트워크에 관여하는 세포질 단백질에 의해 공유되는 뉴클레오티드-결합 어댑터에 위치한다. NB-ARC 도메인은 ATP에 결합하고 가수 분해할 수 있다고 가정된다. ADP 결합은 실험적으로 확인되었다. 이 도메인에 의한 ATP의 결합 및 가수분해는 전체 단백질의 형태적 변화를 유도하여 아폽토솜(apoptosome)을 형성하는 것으로 제안된다. NLR(고 서열 상동성) 사이의 공유 도메인 및 공통 진화적 기원은, ADP를 ATP로 교환한 후 NB-ARC 도메인을 통한 다량체가 NLR 활성화의 핵심 단계이며 식물의 면역 신호 전달에서 분자 스위치와 같은 역할을 한다는 것을 시사한다. ADP-바인딩 상태는 LRR이 NB-ARC 도메인과 연결되어 비활성 상태에서 NLR을 안정화하는 "오프 상태"로 간주된다. NLR의 활성화는 일반적으로 ATP-결합 상태와 관련이 있으며 "온 상태"라고 칭한다. 바람직하게는, KDHKIEKE 모티프는 본 발명에 포함된 저항성 유전자에 의해 암호화되는 단백질에서 아미노산 433과 442 사이에서 발견된다.
LSNNRNLKIL 모티프는 단백질의 LRR(류신 풍부 반복) 도메인 중 하나에 위치한다. 이러한 모티프의 주요 기능은 단백질-단백질 상호작용의 형성을 위한 다양한 구조적 프레임워크를 제공하는 것으로 보인다. 재조합 및 유전자 전환을 통한 NLR의 다양화는 고도로 가변적이고 이펙터를 인식할 수 있고 병원체에 대한 저항성을 제공할 수 있는 다양한 LRR 영역을 생성한다. 이러한 도메인은 이펙터 인식을 결정하고 따라서 직접적인 이펙터 상호작용 및 질병 감수성/저항성에 관여하는 것으로 여겨진다. 바람직하게는, LSNNRNLKIL 모티프는 본 발명에 포함된 저항성 유전자에 의해 암호화되는 단백질에서 아미노산 596과 607 사이에서 발견된다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 개시내용은 시금치 식물에 관한 것으로서, 상기 시금치 식물은 SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7, 및 SEQ ID No.15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 저항성 유전자(들)를 포함한다. T70은 SEQ ID No.3으로, T71은 SEQ ID No.5로, T72는 SEQ ID No.7로, T89는 SEQ ID No.15로 나타낸다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 페로노스포라 파리노사(Pfs)에 의해 유발된 노균병에 저항성인 시금치 식물에 관한 것으로, 여기서 시금치 식물은 SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7, SEQ ID No.9, SEQ ID No.11, SEQ ID No.13, 및 SEQ ID No.15, SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.33 및 SEQ ID No.35로 이루어진 군으로부터 선택된 코딩 서열을 포함하는 하나이상의 저항성 유전자를 포함한다. 이들 하나 이상의 저항성 유전자는 SEQ ID No.2, SEQ ID No.4, SEQ ID No.6, SEQ ID No.8, SEQ ID 10, SEQ ID No.12, SEQ ID No.14, 및 SEQ ID No.16, SEQ ID No.24, SEQ ID No.26, SEQ ID No.28, SEQ ID No.30, SEQ ID No.32, SEQ ID No.34 및 SEQ ID No.36으로 이루어진 군으로부터 선택된 담백질을 암호화한다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 개시내용은 시금치 식물에 관한 것으로, 상기 식물은 페로노스포라 파리노사 품종인 Pfs1 내지 Pfs4, 및 Pfs7 내지 Pfs17에 대해 최소한 저항성이 있다. 시금치 식물은 Pfs 6에도 저항성이 있을 것으로 예상된다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 개시내용은 상기 하나 이상의 저항성 유전자가 기탁 번호 NCIMB 43360으로부터 유래된 시금치 식물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 스피니치아 올레라시아 식물의 종자는 2019년 2월 21일 NCIMB Ltd, 퍼거슨 빌딩, 크레이브스톤 에스테이트 벅스번, AB21 9YA 애버딘, 영국에 기탁되었다.
두 번째 측면에 따르면, 본 개시내용은, 본 개시내용에 따른 시금치 식물에 의해 생산되거나 이로부터 수득된 종자에 관한 것으로, 상기 종자는 하나 이상의 저항성 유전자를 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 저항성 유전자는 SEQ ID No. 4와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질을 암호화하며, 여기서 단백질은 보존된 아미노산 서열 KDHKIEKE 및 보존된 아미노산 서열 LSNNRNLKIL을 포함한다.
세 번째 측면에 따르면, 본 개시내용은, 시금치 식물에서 노균병에 대한 저항성을 부여하는 저항성 유전자에 관한 것으로, 여기서 상기 유전자는 SEQ ID No. 4와 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는 단백질을 암호화한다. 새로운 저항성 유전자는 시금치에 광범위한 Pfs 저항성을 부여하는 단백질을 암호화한다. 저항성 유전자의 코딩 서열은 SEQ ID No. 3과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 94%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 더욱더 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 저항성 유전자에 관한 것으로서, 여기서 상기 유전자는 SEQ ID No.1., SEQ ID No.3., SEQ ID No.5., SEQ ID No.7., SEQ ID No.9., SEQ ID No.11., SEQ ID No.13., SEQ ID No.15, SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.33 및 SEQ ID No.35으로 이루어진 군으로부터 선택된 코딩 서열을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 개시내용은 저항성 유전자에 관한 것으로서, 상기 저항성 유전자는 단백질을 암호화하고, 여기서 상기 단백질은 아미노산 서열 KDHxIzKE를 포함하고, 여기서 상기 x는 아미노산 K 또는 E, 바람직하게는 K이고, 여기서 z는 아미노산 K 또는 E, 바람직하게는 E이다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 개시내용은 저항성 단백질에 관한 것이고, 여기서 상기 저항성 유전자는 단백질을 암호화하고, 여기서 상기 단백질은 보존된 아미노산 서열 보존된 아미노산 서열 LSNNRNLKIL을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 개시내용은 저항성 유전자에 관한 것으로서, 여기서 상기 저항성 유전자는 단백질을 암호화하고, 여기서 상기 단백질은 아미노산 서열 KDHKIEKE 및/또는 아미노산 서열 LSNNRNLKIL로 구성된다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 저항성 유전자에 관한 것으로, 상기 저항성 유전자의 코딩 서열은 SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7 및 SEQ ID No.15로 이루어진 군으로부터 선택되고, 시금치의 페로노스포라 파리노사 품종인 Pfs1 내지 Pfs4, 및 Pfs7 내지 Pfs 17에 대해 최소한의 저항성을 제공한다. 바람직하게는 저항성 유전자는 SEQ ID No.7, 보다 바람직하게는 SEQ ID No.5, 더욱 더 바람직하게는 SEQ ID No.3, 가장 바람직하게는 SEQ ID No.15이다.
추가 측면에 따르면, 본 개시내용은 노균병에 저항성인 시금치 식물을 제공하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 방법은 하나 이상의 저항성 유전자를 시금치 식물의 게놈 내로 도입 또는 변형하는 단계를 포함하고, 여기서 하나 이상의 저항성 유전자는 SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7, SEQ ID No.9, SEQ ID No.11, SEQ ID No.13, SEQ ID No.15, SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.33 및 SEQ ID No.35로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 개시내용은 게놈 편집 기술, CRISPR Cas, 또는 돌연변이 유발 기술에 의해 하나 이상의 Pfs 저항성 유전자의 도입 또는 변형이 달성되는 방법에 관한 것이다.
추가 측면에 따르면, 본 개시내용은 노균병에 저항성인 시금치 식물을 제공하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 방법은,
a) 본 개시내용의 하나 이상의 저항성 유전자(들)를 포함하는 시금치 식물을 제공하는 단계,
b) a) 단계의 시금치 식물을 감수성(susceptible) 시금치 식물과 교배시키는 단계,
c) 선택적으로, 적어도 1회 동안 b) 단계에서 수득된 식물을 자가화하는 단계, 및
d) 노균병에 저항성인 식물을 선택하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 개시내용은 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 하나 이상의 저항성 유전자의 코딩 서열은 SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7 및 SEQ ID No.15로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 개시내용은, 시금치 식물이 페로노스포라 파리노사 품종인 Pfs1 내지 Pfs4, 및 Pfs7 내지 Pfs17에 의해 유발된 노균병에 저항성인 방법에 관한 것이다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 개시내용은 방법에 관한 것으로서, 여기서 하나 이상의 저항성 유전자(들)가 기탁 번호 NCIMB 43360으로부터 수득된다.
본 발명은 다음의 실시예 및 도면에서 더욱 상세히 설명될 것이다:
도 1은 qPCR 정량화가 VIGS 유전자 침묵 후 Pfs 품종 14(Pfs 14)에 감염된 시금치 식물에서 Pfs 액틴의 정량화를 나타낸다는 것을 보여준다. 정량화에 사용된 시금치 식물은 VIGS 구조물로 형질전환되지 않은 시금치 식물("비처리"), RFP VIGS 침묵 구조물로 일시적으로 형질전환된 T70 유전자를 포함하는 저항성 시금치 식물("VIGS RFP"; 음성 대조군), 및 T70 VIGS 침묵 구조물로 일시적으로 형질전환된 T70 유전자를 포함하는 저항성 시금치 식물("VIGS T70"). 세 가지 기술 복제가 수행되었다. T70 유전자 발현 수준이 Pfs 14에 감염된 시금치에서 VIGS를 침묵시킨 경우, Pfs 액틴의 발현 수준이 극적으로 증가하였다. Pfs에 취약한 식물의 잎은 Pfs 액틴 하우스키핑 유전자의 높은 전사 수준을 나타내었고, 이는 취약성이 VIGS 침묵으로 인한 낮은 T70 유전자 발현과 일치함을 나타낸다.
도 2는 저항 유전자 T10, T70, T71, T72, T75, T76, T83 및 T89에 의해 암호화된 단백질에서 2개의 보존된 아미노산 서열 모티프의 정렬을 나타낸다. 이 모든 단백질은 첫 번째 보존된 아미노산 서열 모티프 KDHxIzKE(도 2 상단에 표시됨)를 포함하고, 이는 429와 449 사이의 위치에 위치한다(x = 아미노산 K 또는 E, 바람직하게는 K; z = K 또는 E, 바람직하게는 E). 이들 단백질의 대부분은 또한, 대략 위치 592 내지 612에 두 번째 보존된 아미노산 서열 모티프 LSNNRNLKIL(도 2의 하단에 표시됨)을 포함한다.
도 3 도 2는 저항성 유전자 T10, T70, T71, T72, T83, T89, T96, T253, T18, T133, T139, T170 및 T175에 의해 암호화된 단백질에서 2개의 보존된 아미노산 서열 모티프의 정렬을 나타낸다. 이러한 모든 단백질은 첫 번째 보존된 아미노산 서열 모티프 KDHKIEKE 및 두 번째 보존된 아미노산 서열 모티프 LSNNRNLKIL을 포함한다.
도 1은 qPCR 정량화가 VIGS 유전자 침묵 후 Pfs 품종 14(Pfs 14)에 감염된 시금치 식물에서 Pfs 액틴의 정량화를 나타낸다는 것을 보여준다. 정량화에 사용된 시금치 식물은 VIGS 구조물로 형질전환되지 않은 시금치 식물("비처리"), RFP VIGS 침묵 구조물로 일시적으로 형질전환된 T70 유전자를 포함하는 저항성 시금치 식물("VIGS RFP"; 음성 대조군), 및 T70 VIGS 침묵 구조물로 일시적으로 형질전환된 T70 유전자를 포함하는 저항성 시금치 식물("VIGS T70"). 세 가지 기술 복제가 수행되었다. T70 유전자 발현 수준이 Pfs 14에 감염된 시금치에서 VIGS를 침묵시킨 경우, Pfs 액틴의 발현 수준이 극적으로 증가하였다. Pfs에 취약한 식물의 잎은 Pfs 액틴 하우스키핑 유전자의 높은 전사 수준을 나타내었고, 이는 취약성이 VIGS 침묵으로 인한 낮은 T70 유전자 발현과 일치함을 나타낸다.
도 2는 저항 유전자 T10, T70, T71, T72, T75, T76, T83 및 T89에 의해 암호화된 단백질에서 2개의 보존된 아미노산 서열 모티프의 정렬을 나타낸다. 이 모든 단백질은 첫 번째 보존된 아미노산 서열 모티프 KDHxIzKE(도 2 상단에 표시됨)를 포함하고, 이는 429와 449 사이의 위치에 위치한다(x = 아미노산 K 또는 E, 바람직하게는 K; z = K 또는 E, 바람직하게는 E). 이들 단백질의 대부분은 또한, 대략 위치 592 내지 612에 두 번째 보존된 아미노산 서열 모티프 LSNNRNLKIL(도 2의 하단에 표시됨)을 포함한다.
도 3 도 2는 저항성 유전자 T10, T70, T71, T72, T83, T89, T96, T253, T18, T133, T139, T170 및 T175에 의해 암호화된 단백질에서 2개의 보존된 아미노산 서열 모티프의 정렬을 나타낸다. 이러한 모든 단백질은 첫 번째 보존된 아미노산 서열 모티프 KDHKIEKE 및 두 번째 보존된 아미노산 서열 모티프 LSNNRNLKIL을 포함한다.
질병 저항성 유전자 및 단백질
NBS-LRR 단백질로도 알려진 뉴클레오티드-결합 부위 류신-풍부 반복 단백질은 R 유전자로 알려진 식물의 질병 저항성 유전자에 의해 암호화된다. NBS-LRR 단백질은 뉴클레오티드-결합 부위(nucleotide-binding site; NBS) 및 류신-풍부 반복(leucine-rich repeat; LRR) 도메인뿐만 아니라 가변 아미노- 및 카르복시- 말단 도메인을 특징으로 한다. 이 단백질은 박테리아, 바이러스, 균류, 선충류(nematodes), 곤충 및 난균류를 포함한 다양한 병원체의 검출에 관여한다. 식물 NBS-LRR 단백질에는 두 가지 주요 서브패밀리(subfamilies)가 있는데, 이는 아미노-말단 도메인에서 톨/인터루킨-1 수용체(TIR) 또는 코일형-코일(CC) 모티프에 의해 정의되며 두 가지 서브패밀리의 단백질은 병원체 인식에 관여된다.
시금치에서 가장 잘 알려진 저항성은 유전자좌 1이라고 하는 유전자좌에서 확인되었으며 염색체 2(LG2)에 위치하며 매우 가변적이다. 많은 상이한 야생 시금치 수탁에서 많은 유전자가 확인되었지만, 대부분의 유전자에 대해, 기능적인지(예를 들어, 노균병 저항성 제공) 아닌지 여부는 아직 알려져 있지 않다.
본 개시내용은 일반적으로 하나 이상의 저항성 유전자를 갖는 식물, 예를 들어 아미노-말단 도메인에 TIR 모티프를 갖는 NBS-LRR 단백질을 암호화하는 R 유전자를 갖는 식물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 저항성 유전자를 갖는 것은 노균병(예를 들어, 페로노스포라 파리노사)에 대한 광범위 스펙트럼 저항성을 제공한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 저항성 유전자를 갖는 것은 페로노스포라 파리노사의 적어도 15개 품종에 대한 저항성을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 식물은 시금치로도 알려진 스피니치아 올레라시아이다. 시금치는 R 유전자로 알려진 많은 저항성 유전자를 포함한다. 특히, 시금치는 유전자좌 1에서 유래한 R 유전자를 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 식물은 수탁 번호 NCIMB 43360 하에 기탁된 종자에 존재하는 저항성 유전자를 갖는다.
본 개시내용의 특정 측면은 뉴클레오티드 코딩 서열 SEQ ID NO:1을 갖는 저항성 유전자에 관한 것이다. 또한, SEQ ID NO:1의 상동체(homologs) 및 병렬상동체(orthologs)가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:1의 상동체 또는 병렬상동체는 SEQ ID NO:1과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 코딩 서열을 갖는다.
본 개시내용의 특정 측면은 뉴클레오티드 코딩 서열 SEQ ID NO:3을 갖는 저항성 유전자에 관한 것이다. 또한 SEQ ID NO:3의 상동체 및 병렬상동체가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:3의 상동체 또는 병렬상동체는 SEQ ID NO:3과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 코딩 서열을 갖는다.
본 개시내용의 특정 측면은 뉴클레오티드 코딩 서열 SEQ ID NO:5를 갖는 저항성 유전자에 관한 것이다. 또한 SEQ ID NO:5의 상동체 및 병렬상동체가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:5의 상동체 또는 병렬상동체는 SEQ ID NO:5와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 코딩 서열을 갖는다.
본 개시내용의 특정 측면은 뉴클레오티드 코딩 서열 SEQ ID NO:7을 갖는 저항성 유전자에 관한 것이다. 또한 SEQ ID NO:7의 상동체 및 병렬상동체가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:7의 상동체 또는 병렬상동체는 SEQ ID NO:7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 코딩 서열을 갖는다.
본 개시내용의 특정 측면은 뉴클레오티드 코딩 서열 SEQ ID NO:9를 갖는 저항성 유전자에 관한 것이다. 또한 SEQ ID NO:9의 상동체 및 병렬상동체가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:9의 상동체 또는 병렬상동체는 SEQ ID NO:9와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 코딩 서열을 갖는다.
본 개시내용의 특정 측면은 뉴클레오티드 코딩 서열 SEQ ID NO:11을 갖는 저항성 유전자에 관한 것이다. 또한 SEQ ID NO:11의 상동체 및 병렬상동체가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:11의 상동체 또는 병렬상동체는 SEQ ID NO:11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 코딩 서열을 갖는다.
본 개시내용의 특정 측면은 뉴클레오티드 코딩 서열 SEQ ID NO:13을 갖는 저항성 유전자에 관한 것이다. 또한 SEQ ID NO:13의 상동체 및 병렬상동체가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:13의 상동체 또는 병렬상동체는 SEQ ID NO:13과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 코딩 서열을 갖는다.
본 개시내용의 특정 측면은 뉴클레오티드 코딩 서열 SEQ ID NO:15를 갖는 저항성 유전자에 관한 것이다. 또한 SEQ ID NO:15의 상동체 및 병렬상동체가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:15의 상동체 또는 병렬상동체는 SEQ ID NO:15와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 코딩 서열을 갖는다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 식물은 뉴클레오티드 코딩 서열 SEQ ID NO:1을 갖는 저항성 유전자에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 이들 식물은 또한 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:15의 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 코딩 서열을 갖는 하나 이상의 저항성 유전자를 가질 수 있다.
본 개시내용의 특정 측면은 아미노산 서열 SEQ ID NO:2를 갖는 저항성 단백질에 관한 것이다. 또한 SEQ ID NO:2의 상동체 및 병렬상동체가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:2의 상동체 또는 병렬상동체는 SEQ ID NO:2와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 코딩 서열을 갖는다.
본 개시내용의 특정 측면은 아미노산 서열 SEQ ID NO:4를 갖는 저항성 단백질에 관한 것이다. 또한 SEQ ID NO:4의 상동체 및 병렬상동체가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:4의 상동체 또는 병렬상동체는 SEQ ID NO:4와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 코딩 서열을 갖는다.
본 개시내용의 특정 측면은 아미노산 서열 SEQ ID NO:6을 갖는 저항성 단백질에 관한 것이다. 또한, SEQ ID NO:6의 상동체(homologs) 및 병렬상동체(orthologs)가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:6의 상동체 또는 병렬상동체는 SEQ ID NO:6과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 코딩 서열을 갖는다.
본 개시내용의 특정 측면은 아미노산 서열 SEQ ID NO:8을 갖는 저항성 단백질에 관한 것이다. 또한, SEQ ID NO:8의 상동체(homologs) 및 병렬상동체(orthologs)가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:8의 상동체 또는 병렬상동체는 SEQ ID NO:8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 코딩 서열을 갖는다.
본 개시내용의 특정 측면은 아미노산 서열 SEQ ID NO:10을 갖는 저항성 단백질에 관한 것이다. 또한, SEQ ID NO:10의 상동체(homologs) 및 병렬상동체(orthologs)가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:10의 상동체 또는 병렬상동체는 SEQ ID NO:10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 코딩 서열을 갖는다.
본 개시내용의 특정 측면은 아미노산 서열 SEQ ID NO:12를 갖는 저항성 단백질에 관한 것이다. 또한, SEQ ID NO:12의 상동체(homologs) 및 병렬상동체(orthologs)가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:12의 상동체 또는 병렬상동체는 SEQ ID NO:12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 코딩 서열을 갖는다.
본 개시내용의 특정 측면은 아미노산 서열 SEQ ID NO:14를 갖는 저항성 단백질에 관한 것이다. 또한, SEQ ID NO:14의 상동체(homologs) 및 병렬상동체(orthologs)가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:14의 상동체 또는 병렬상동체는 SEQ ID NO:14와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 코딩 서열을 갖는다.
본 개시내용의 특정 측면은 아미노산 서열 SEQ ID NO:16을 갖는 저항성 단백질에 관한 것이다. 또한, SEQ ID NO:16의 상동체(homologs) 및 병렬상동체(orthologs)가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:16의 상동체 또는 병렬상동체는 SEQ ID NO:16과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 코딩 서열을 갖는다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 식물은 아미노산 서열 SEQ ID NO:2를 갖는 저항성 단백질을 갖는다. 일부 구현예에서, 이들 식물은 또한 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID No.24, SEQ ID No.26, SEQ ID No.28, SEQ ID No.30, SEQ ID No.32, SEQ ID No.34 및 SEQ ID No.36의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 저항성 단백질을 가질 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 식물은 1개 이상 또는 2개의 아미노산 컨센서스 모티프를 포함하는 저항성 단백질을 갖는다. 일부 구현예에서, 저항성 단백질은 KDHxIzKE의 제1 아미노산 컨센서스 모티프를 가지며, 여기서 x는 아미노산 K 또는 E, 바람직하게는 K이고, 여기서 z는 아미노산 K 또는 E, 바람직하게는 E이다. 일부 구현예에서, 제1 아미노산 컨센서스 모티프는 KDHKIEKE이다. 일부 구현예에서, 저항성 단백질은 LSNNRNLKIL의 제2 아미노산 컨센서스 모티프를 갖는다. 일부 구현예에서, 저항성 단백질은 제1 아미노산 컨센서스 모티프 및 제2 아미노산 컨센서스 모티프 둘 다를 갖는다.
첫 번째 아미노산 컨센서스 모티프(amino acid consensus motif) KDHxIzKE(예를 들어, KDHKIEKE)는 다른 R 단백질과 APAF-1과 CED-4(즉, 아포토시스 조절 네트워크에 관여하는 세포질 단백질)와 같은 단백질이 공유하는 뉴클레오티드-결합 어댑터인 단백질의 NB-ARC 도메인에 위치한다. NB-ARC 도메인은 ATP에 결합하고 가수분해할 수 있다고 가정한다. ADP 결합은 실험적으로 확인되었다. NB-ARC 도메인에 의한 ATP의 결합 및 가수분해는 전체 단백질의 형태적 변화를 유도하여 아폽토솜을 형성하는 것으로 제안된다.
두 번째 아미노산 컨센서스 모티프 LSNNRNLKIL은 단백질의 LRR(류신이 풍부한 반복) 도메인 중 하나에 위치한다. 이러한 모티프의 주요 기능은 단백질-단백질 상호작용의 형성을 위한 다양한 구조적 프레임워크를 제공하는 것으로 보인다. 이러한 도메인은 이펙터 인식 및 이에 따른 질병 감수성/저항성을 결정하는 것으로 생각된다.
페로노스포라 파리노사에 대한 저항성
본 개시내용은 일반적으로 노균병(예를 들어, 페로노스포라 파리노사) 저항성에 대한 저항성을 갖는 식물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 식물은 페로노스포라 파리노사에 대한 광범위 스펙트럼 저항성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 식물은 페로노스포라 파리노사의 15개 이상, 16개 이상, 또는 17개 이상의 품종에 저항성이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 식물은 Pfs1, Pfs2, Pfs3, Pfs4, Pfs5, Pfs6, Pfs7, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs13, Pfs14, Pfs15, Pfs16 또는 Pfs17의 군으로부터 선택된 15개 이상, 16개 이상, 또는 17개 품종의 페로노스포라 파리노사에 저항성이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 식물은 Pfs1, Pfs2, Pfs3, Pfs4, Pfs7, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs13, Pfs14, Pfs15, Pfs16 및 Pfs17에 대한 저항성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 식물은 추가적으로 페로노스포라 파리노사의 다른 품종에 대한 저항성을 갖는다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 저항성 유전자의 하나 이상의 코딩 서열의 존재는 페로노스포라 파리노사 저항성을 초래한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 코딩 서열은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.33 및 SEQ ID No.35의 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 코딩 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 15의 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 저항성 단백질의 존재는 페로노스포라 파리노사 저항성을 초래한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 저항성 단백질은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID No.24, SEQ ID No.26, SEQ ID No.28, SEQ ID No.30, SEQ ID No.32, SEQ ID No.34 및 SEQ ID No.36의 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 저항성 단백질은 SEQ ID NO:4이다.
본 개시내용의 식물
일부 측면에서, 본 개시내용의 식물은 아마란타세애(Amaranthaceae) 과의 식물이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 식물은 스피니치아 올레라시아(시금치) 종의 식물이다.
본 설명에 따르면 식물 부분은 잎, 줄기, 분열 조직(meristems), 떡잎(cotyledons), 배축(hypocotyl), 뿌리, 뿌리 끝(root tips), 뿌리 분열 조직(root meristems), 밑씨(ovules), 꽃가루(pollen), 꽃밥(anthers), 암술(pistils), 꽃, 배(embryos), 종자(seeds), 과일, 과일의 부분, 세포 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 식물 조직은 조직 또는 모든 식물 부분일 수 있다. 식물 세포는 모든 식물 부분의 세포일 수 있다.
본 개시내용의 식물은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.33 및 SEQ ID No.35의 군으로부터 선택된 코딩 서열을 갖는 저항성 유전자를 갖는 식물을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 식물은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 15의 군으로부터 선택된 코딩 서열을 갖는 저항성 유전자를 갖는 식물을 포함한다.
본 개시내용의 식물은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID No.24 SEQ ID No.26, SEQ ID No.28, SEQ ID No.30, SEQ ID No.32, SEQ ID No.34 및 SEQ ID No.36의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 저항성 단백질을 갖는 식물을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 식물은 아미노산 서열 SEQ ID NO:4를 갖는 저항성 단백질을 갖는 식물을 포함한다.
본 개시내용의 식물은 첫 번째 보존된 아미노산 모티프 KDHxIzKE, 여기서 x는 아미노산 K 또는 E, 바람직하게는 K이고, z는 아미노산 K 또는 E, 바람직하게는 E(예를 들어, KDHKIEKE); 두 번째 보존된 아미노산 모티프 LSNNRNLKIL; 또는 첫 번째 보존된 아미노산 모티프 KDHxIzKE 및 두 번째 보존된 아미노산 모티프 LSNNRNLKIL 둘 다를 포함하는 저항성 단백질을 갖는 식물을 포함한다.
본 개시내용의 식물은 수탁 번호 NCIMB 43360 하에 기탁된 종자로부터 재배된 시금치 식물을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 NCIMB 수탁 번호 43360을 갖는 시금치 종자를 재배함으로써 생산된 시금치 식물의 모든 생리학적 및 형태학적 특징을 갖는 시금치 식물 및 이로부터 분리된 부분에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 F1 잡종 시금치 종자, 그 종자로부터 성장한 식물, 및 시금치 식물을 부모로 갖는 이로부터 분리된 잎에 관한 것으로, 여기서 상기 시금치 식물은 NCIMB 수탁 번호 43360을 갖는 시금치 종자로부터 재배된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.33 및 SEQ ID No.35의 군으로부터 선택된 코딩 서열을 갖는 하나 이상의 저항성 유전자는 수탁 번호 NCIMB 43360하에서 기탁된 종자로부터 재배된 식물에 존재한다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.33 및 SEQ ID No.35의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 저항성 단백질은 수탁 번호 NCIMB 43360 하에서 기탁된 종자로부터 재배된 식물에 존재한다.
식물이 본 개시내용의 식물인지 여부, 따라서 상기 식물이 본 개시내용의 식물과 동일한 유전자를 갖는지 여부를 결정하기 위해, 식물의 표현형을 본 개시내용의 공지된 식물의 표현형과 비교할 수 있다(예를 들어, 수탁 번호 NCIMB 43360 하에 기탁된 종자로부터 재배된 식물). 일부 구현예에서, 본 개시내용의 식물은 광범위 스펙트럼의 노균병(페로노스포라 파리노사) 저항성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 식물은 Pfs1, Pfs2, Pfs3, Pfs4, Pfs5, Pfs6, Pfs7, Pfs8, Pfs9, Pfs10, Pfs11, Pfs12, Pfs13, Pfs14, Pfs15, Pfs16 또는 Pfs17의 군으로부터 선택된 15개 이상의 Pfs 품종에 대한 저항성을 갖는다. 일부 구현예에서, 표현형은 예를 들어, 실시예 4에 기재된 바와 같이 노균병 잎 디스크 검정에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 표현형은 통상의 기술자에게 공지된 질병 저항성 검정에 의해 평가될 수 있다.
표현형 관찰 외에도, 식물의 유전자형도 검사될 수 있다. 식물 유전자형의 분석, 비교 및 특성화에 사용할 수 있는 당업계에 알려진 많은 실험실-기반 기술이 있다. 이러한 기술은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 동질효소 전기영동법(Isozyme Electrophoresis), 제한효소 절편길이 다형성(Restriction Fragment Length Polymorphisms; RFLP), 무작위로 증폭된 다형성 DNA(Randomly Amplified Polymorphic DNAs; RAPD), 임의 프라이밍된 중합효소 연쇄 반응(Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction; AP-PCR), DNA-증폭 지문(DNA Amplification Fingerprinting; DAF), 서열 특성화된 증폭 영역(Sequence Characterized Amplified Regions; SCAR), 증폭된 단편 길이 다형성(Amplified Fragment Length polymorphisms; AFLP), 단순 서열 반복(Simple Sequence Repeats; SSR, 미세부수체(Microsatellites)라고도 함), 및 단일 뉴클레오티드 다형성(Single Nucleotide Polymorphisms; SNPs). 이들 기술을 사용함으로써, 본 개시내용의 식물의 노균병 저항성 표현형에 관여하는 대립유전자, 유전자 및/또는 유전자좌의 존재를 평가하는 것이 가능하다.
또한, 식물이나 병원체의 유전자 발현이 조사될 수 있다. 식물 또는 병원체 유전자 발현의 분석, 비교 및 특성화에 사용할 수 있는 당업계에 공지된 많은 실험실-기반 기술이 있다. 이러한 기술에는 정량적 중합효소 연쇄 반응(Quantitative Polymerase Chain Reaction; qPCR, 실시간 PCR이라고도 함), 역전사 중합효소 연쇄 반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction; RT-PCR) 및 RNA 시퀀싱(RNA-Seq)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 병원체 유전자의 발현은 qPCR을 사용하여 평가될 수 있고, 실시예 3에 기재된 바와 같이 식물이 본 개시내용의 식물의 노균병 저항성 표현형을 갖는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 식물을 얻는 방법
일부 구현예에서, 본 개시내용은 시금치 식물을 선택하는 방법에 관한 것으로, a) 본 개시내용의 하나 이상의 저항성 유전자 또는 하나 이상의 저항성 단백질을 포함하는 시금치 식물을 재배하는 단계 및 b) a) 단계로부터 식물을 선택함하는 단계로써, 시금치 식물을 선택하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 시금치 식물을 본 개시내용의 하나 이상의 저항성 유전자 또는 하나 이상의 저항성 단백질을 포함하는 식물과 교배함으로써 시금치 식물을 육종시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 노균병에 저항성인 시금치 식물을 육종시키는 방법에 관한 것으로서, (a) 본 개시내용의 하나 이상의 저항성 유전자 또는 하나 이상의 저항성 단백질을 포함하는 시금치 식물을 제공하는 단계, (b) (a) 단계의 시금치 식물을 감수성 시금치 식물과 교배시키는 단계, (c) 선택적으로, (b) 단계에서 수득된 식물을 적어도 1회 자가화하는 단계(selfing), 및 (d) 노균병에 저항성인 식물을 선택하는 단계로써, 노균병에 저항성인 시금치 식물을 육종시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 하나 이상의 저항성 유전자 또는 하나 이상의 저항성 단백질을 포함하는 시금치 식물에 원하는 형질을 도입하는 방법에 관한 것으로서, (a) 자손 식물을 생산하기 위해 본 개시내용의 하나 이상의 저항성 유전자 또는 하나 이상의 저항성 단백질을 포함하는 시금치 식물을 원하는 형질을 포함하는 또 다른 시금치 변종의 식물과 교배시키는 단계로서, 여기서 상기 원하는 형질은 제초제 저항성; 곤충 또는 해충 저항성; 및 세균성 질병, 진균성 질병, 난균성(oomycete) 질병, 또는 바이러스성 질병에 대한 저항성으로부터 선택된 것인, 자손 식물을 생산하기 위해 본 개시내용의 하나 이상의 저항성 유전자 또는 하나 이상의 저항성 단백질을 포함하는 시금치 식물을 원하는 형질을 포함하는 또 다른 시금치 변종의 식물과 교배시키는 단계; (b) 원하는 형질을 갖는 하나 이상의 자손 식물을 선택하는 단계; (c) 역교배 자손 식물을 생산하기 위해 선택된 자손 식물을 본 개시내용의 하나 이상의 저항성 유전자 또는 하나 이상의 저항성 단백질을 포함하는 시금치 식물과 역교배하는 단계; (d) 본 개시내용의 하나 이상의 저항성 유전자 또는 하나 이상의 저항성 단백질을 포함하는 시금치 식물의 원하는 형질 및 모든 생리학적 및 형태학적 특징을 갖는 역교배 자손 식물을 선택하는 단계; 및 (e) (c) 단계 및 (d) 단계를 연속으로 2회 이상 반복하여 원하는 형질을 포함하는 선택된 제3 이상의 역교배 자손 식물을 생산하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 하나 이상의 저항성 유전자 또는 하나 이상의 저항성 단백질을 포함하는 시금치 종자를 재배함으로써 시금치 식물을 수득하는 방법에 관한 것이다. 임의의 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 일부 구현예들에서, 시금치 자손 식물은 노균병(페로노스포라 파리노사)에 대한 광범위 스펙트럼 저항성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 시금치 식물을 선택하는 방법에 관한 것으로서, a) NCIMB 수탁 번호 43360을 갖는 시금치 종자로부터 시금치 식물을 재배하고 b) a) 단계로부터 식물을 선택하는 단계로써, 시금치 식물을 선택하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 NCIMB 수탁 번호 43360을 갖는 시금치 종자로부터 재배된 식물과 시금치 식물을 교배함으로써 시금치 식물을 육종시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 노균병에 저항성인 시금치 식물을 육종시키는 방법에 관한 것으로서, (a) 시금치 종자의 샘플이 NCIMB 수탁 번호 43360 하에서 기탁된 시금치 식물을 제공하는 단계, (b) (a) 단계의 시금치 식물을 감수성 시금치 식물과 교배시키는 단계, (c) 선택적으로, 단계 (b)에서 수득된 식물을 적어도 1회 자가화하는 단계, 및 (d) 노균병에 저항성인 식물을 선택하는 단계로써, 노균병에 저항성인 시금치 식물을 육종시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 NCIMB 수탁 번호 43360을 갖는 시금치 종자로부터 성장된 시금치 식물에 원하는 형질을 도입하는 방법에 관한 것이고, (a) 자손 식물을 생산하기 위해 NCIMB 수탁 번호 43360 하에서 기탁된 시금치 식물과 원하는 형질을 포함하는 다른 시금치 변종의 식물을 교배하는 단계로서, 상기 원하는 형질은 제초제 저항성; 곤충 또는 해충 저항성; 및 세균성 질병, 진균성 질병, 난균성 질병, 또는 바이러스성 질병에 대한 저항성으로부터 선택된 것인, 자손 식물을 생산하기 위해 NCIMB 수탁 번호 43360 하에서 기탁된 시금치 식물과 원하는 형질을 포함하는 다른 시금치 변종의 식물을 교배하는 단계; (b) 원하는 형질을 갖는 하나 이상의 자손 식물을 선택하는 단계; (c) 역교배 자손 식물을 생산하기 위해 선택된 자손 식물을 NCIMB 기탁 번호 43360을 갖는 시금치 종자로부터 성장한 시금치 식물과 역교배하는 단계; (d) NCIMB 수탁 번호 43360을 갖는 시금치 종자로부터 성장된 시금치 식물의 원하는 형질 및 모든 생리학적 및 형태학적 특징을 갖는 역교배 자손 식물을 선택하는 단계; 및 (e) (c) 단계 및 (d) 단계를 연속으로 2회 이상 반복하여 원하는 형질을 포함하는 선택된 제3 이상의 역교배 자손 식물을 생산하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 NCIMB 수탁 번호 43360을 갖는 시금치 종자를 재배함으로써 시금치 식물을 수득하는 방법에 관한 것이다. 임의의 선행하는 구현예들과 조합될 수 있는 일부 구현예들에서, 시금치 자손 식물은 노균병(페로노스포라 파리노사)에 대한 광범위 스펙트럼 저항성을 갖는다.
본 개시내용의 저항성 유전자 또는 단백질은 육종에 의해 식물에 도입될 수 있다. 역교배(backcrossing)라고 하는 육종 기술은 계통으로 전달된 단일 유전자(예를 들어, 아미노산 서열 SEQ ID NO:4를 갖는 단백질을 암호화하는 저항성 유전자)에 추가하여 본질적으로 품종의 모든 원하는 형태학적 및 생리학적 특성들을 회복할 수 있도록 한다. 원하는 특성들에 대한 유전자(예를 들어, 아미노산 서열 SEQ ID NO:4를 갖는 단백질을 암호화하는 저항성 유전자)에 기여하는 친계 시금치 식물은 비반복친(nonrecurrent parent) 또는 수여친(donor parent)으로 지칭된다. 이 용어는 비반복 부모가 역교배 프로토콜에서 한 번 사용되므로 반복되지 않는다는 사실을 나타낸다. 비반복친(nonrecurrent parent)으로부터의 유전자 또는 유전자들이 전달된 친계 시금치 식물은 역교배 프로토콜에서 여러 라운드에 사용되기 때문에 반복친(recurrent parent)으로 알려져 있다. 전형적인 역교배 프로토콜에서 관심 있는 오리지널 품종(반복친(recurrent parent))은 전달될 단일 관심 유전자를 운반하는 두 번째 계통(비반복친(nonrecurrent parent))으로 교배된다. 그런 다음 이 교배에서 생성된 자손은 다시 반복친으로 교배되고 시금치 식물이 얻어질 때까지 이 과정이 반복되며, 여기서 반복칙으로부터의 단일 전달된 유전자에 더하여, 반복친의 본질적으로 모든 원하는 형태학적 및 생리학적 특성들이 전환된 식물에서 회복된다. 본 개시내용은 추가로 반복 선택, 역교배, 계통육종(pedigree breeding), 제한 단편 길이 다형성 강화 선택(restriction fragment length polymorphism enhanced selection), 및 유전자 마커 강화 선택(genetic marker enhanced selection)을 포함하는 식물 육종 기술을 사용하여 시금치 식물 육종 프로그램에서 시금치 식물을 개발하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 저항성 유전자 또는 단백질은 또한 트랜스제닉(transgenic) 기술에 의해 식물 내로 도입될 수 있다. 식물 형질전환은 식물 세포에서 기능할 발현 벡터의 구성을 포함한다. 이러한 벡터는 조절 요소(예를 들어, 프로모터)의 제어 하에 있거나 이에 작동적으로 연결된 유전자를 포함하는 DNA를 포함한다. 발현 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자/조절 요소 조합을 하나 이상 포함할 수 있다. 벡터(들)는 플라스미드 형태일 수 있고, 단독으로 또는 다른 플라스미드와 조합하여 사용하여 형질전환된 멜론 식물을 제공할 수 있다. 프로모터는 유도성(inducible), 구성적(constitutive), 조직 특이적(tissue-specific) 또는 조직 선호(tissue-preferred)일 수 있다. 식물 형질전환 방법은 생물학적 방법 및 물리적 방법을 포함한다(예를 들어, Miki, et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)를 참조). 또한, 식물 세포 또는 조직 형질전환 및 식물 재생을 위한 발현 벡터 및 시험관내 배양 방법이 이용가능하다(예를 들어, Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)를 참조). 생성된 트랜스제닉 계통은 새로운 트랜스제닉 계통을 생산하기 위해 다른 (형질전환되지 않은 또는 형질전환된) 계통과 교배될 수 있다. 대안적으로, 전술한 형질전환 기술을 사용하여 특정 시금치 품종으로 조작된 유전적 형질을 식물 육종 기술분야에서 잘 알려진 전통적인 역교배 기술을 사용하여 다른 계통으로 이동시킬 수 있다. 예를 들어, 역교배 접근법은 조작된 형질(engineered trait)을 일반적, 비-엘리트 근친 교배 계통(non-elite inbred line)에서 엘리트 근친 계통(elite inbred line)으로, 또는 게놈에 외래 유전자를 포함하는 근친 계통으로부터 근친 계통 또는 해당 유전자를 포함하지 않는 근친 계통으로 이동하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 내인성 저항성 유전자는 돌연변이 유발(mutagenesis), 유전자 편집 기술(gene editing techniques), 또는 본 개시내용의 식물을 수득하기 위해 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 변형 또는 돌연변이될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 기술은 전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease; TALEN) 유전자 편집 기술, 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat; CRISPR/Cas9) 유전자 편집 기술, 또는 아연-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease; ZFN) 유전자 편집 기술의 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 CRISPR/Cas9 시스템, TALEN, 징크 핑거, 및 저항성 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 표적화하도록 설계된 메가뉴클레아제(meganuclease)의 군으로부터 선택된 유전자 편집 성분(gene editing components)을 포함하는 하나 이상의 벡터를 사용하여 도입된다.
본 개시내용의 식물은, 상기 기재된 바와 같이, 다수의 방법에 의해 확인될 수 있다. 유전자 발현 수준은, 예를 들어 SEQ ID NO:3과 같은, 본 개시내용의 코딩 서열로부터 생산된 전사체(transcript) 수준의 분석(예를 들어, RT-PCR에 의해)에 의해 테스트될 수 있다. 또 다른 옵션은, 예를 들어 항체를 사용한, 저항성 단백질 수준(예를 들어, 아미노산 서열 SEQ ID NO:4를 갖는 저항성 단백질)의 정량화이다. 숙련자는 또한 노균병 저항성이 광범위 스펙트럼 노균병 저항성인지 알아보기 위해 일반적인 병원체 테스트를 사용할 수 있다. 이들 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있고 본 개시내용의 식물을 확인하는데 사용될 수 있다. 원하는 저항성 유전자 또는 단백질을 가진 식물은, 원하는 새로운 유전자(들)만을 원하는 작물의 배경으로 전달하기 위해 번식, 역교배, 또는 다른 육종 계통으로 교배된다.
실시예
다음의 실시예는 본 개시내용의 측면들을 추가로 예시하기 위해 제공된다. 이들 실시예들은 비제한적이며 본 개시내용의 임의의 측면을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1: 새로운 후보 우성 저항성 유전자를 식별하기 위한 유전자 매핑
새로운 후보 우성(dominant) 저항성 유전자는 시금치(S. 올레라시아(S. oleracea))의 페로노스포라 파리노사 저항성 유전자를 유전자 매핑하여 수득되었다. 저항성 유전자는 대량 분리 분석(Bulked segregant analysis; BSA) 접근 방식을 사용하여 매핑되었다. (F3 세대에서 유래된) 다중 저항성 패밀리의 RNA는 모아졌고(were pooled) 감수성 패밀리의 RNA 풀과 비교되었다. 모든 F3 패밀리는 동일한 F2 식물에서 파생되었다. 마커는 SNP의 수의 증가가 관찰된 영역에서 개발되었다. 마커는 F2 모집단을 사용하여 검증되었다. 관심의 영역(ROI)이 식별되고 마커가 측면에 배치되면 정밀 매핑 접근 방식이 시작되었다.
실시예 2: 시금치(S. oleracea)에서 T70 유전자의 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS)
T70 유전자가 페로노스포라 파리노사 저항성과 관련이 있음을 입증하기 위해, 추정(putative) 저항성 유전자(T70)는 담배 얼룩 바이러스(tobacco rattle virus; TRV) 기반 바이러스- 유도 유전자 침묵(virus-induced gene silencing; VIGS)을 사용하여 침묵되었다. 이것은 T70 저항성 유전자를 포함하는 저항성 시금치 계통의 VIGS 침묵이 페로노스포라 파리노사 감염에 대한 감수성을 유도하는지 여부를 확인하기 위해 수행되었다.
VIGS 구조물의 구축 및 VIGS 구조물의 시금치(S. oleracea)로의 형질전환
유전자 기능 연구를 위한 TRV 유래 VIGS 벡터의 사용은 잘 알려져 있으며, VIGS 벡터는 Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, 및 Lycopersicon esculentum을 포함한 여러 식물 종에서 유전자 기능을 연구하는 데 사용되었다(예를 들어, Huang C, Qian Y, Li Z, Zhou X.: Virus-induced gene silencing and its application in plant functional genomics. Sci China Life Sci. 2012;55 (2):99-108 참조). T70 유전자가 관찰된 저항성 표현형에 책임이 있는지 확인하기 위해, 저항성 공급원 S. 올레라시아(S. oleracea)에서 T70을 침묵시키기 위해 VIGS 침묵이 사용되었다. 이를 위해, T70을 표적으로 하는 VIGS 구조물이 만들어졌고, 이 구조물은 K20 벡터에 클로닝되었다. 음성 대조군으로 사용된 다른 유전자(RFP)를 표적으로 하는 또 다른 VIGS 구조물이 만들어졌다. 표 1은 각 유전자에 대한 VIGS 구조물에 사용된 서열을 제공한다. 구조물은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101과의 공동 배양을 사용하여 시금치로 형질전환되었고, T70의 기능을 연구하는 데 사용되었다.
| VIGS 구조체 표적(VIGS Construct Target) | VIGS 구조체에서 사용된 표적 서열(Target Sequence used in VIGS Construct) |
| T70 | GGTGAATGTGTTGGCCCTGAAGCTGTATTGGAAACCTTAGAGCCACCTTCAAATATCAAGAGCTTATATATATATAATTACAGTGGTACAACAATTCCAGTATGGGGAAGAGCAGAGATTAATTGGGCAATCTCCCTCTCACATCTCGTCGACATCCAGCTTAGTTGTTGTAGTAATTTGCAGGAGATGCCAGTGCTGAGTAAACTGCCTCATTTGAAATCGCTGAAACTTGGATGGTTGGATAACTTAG (SEQ ID NO: 17) |
| RFP | GAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCTCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTG (SEQ ID NO: 18) |
VIGS 침묵 분석 및 결과
요약하면, T70 유전자를 포함하는 S. 올레라시아(S. oleracea) 계통을 VIGS를 사용하여 T70에 대해 침묵시켰다. 저항성 시금치 식물은 T70 침묵 구조물로 일시적으로 형질전환되었다(위에서 설명한 대로 생성됨). 그런 다음, 식물을 시금치에 노균병을 유발하는 것으로 알려진 페로노스포라 파리노사(P. farinosa) 품종 Pfs 14으로 감염시켰다. T70-침묵 식물은 P. farinosa 품종 Pfs14에 민감한 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 T70을 침묵시키는 것이 이전에 저항성 식물을 감수성으로 만들기에 충분했다는 것을 보여주었고, T70이 노균병 저항성과 관련이 있음을 입증했다.
실시예 3:
페로노스포라 파리노사
에 감염된 시금치에서
페로노스포라 파리노사
액틴의 발현의 qPCR 검출
페로노스포라 파리노사 감염에 대한 T70 유전자를 포함하는 저항성 시금치 식물의 반응에 대한 더 많은 통찰력을 얻기 위해 qPCR 실험이 수행되었다. VIGS 실험에서 페로노스포라 파리노사에 감염된 저항성 시금치 식물, T70-침묵 식물, RFP-침묵 식물로부터 잎이 수확되었다(실시예 3에 기술됨). 이러한 감염된 잎에서 RNA가 분리되었고 RNA로부터 cDNA가 합성되었다. 페로노스포라 파리노사 액틴의 발현은 표 2에 제시된 프라이머(SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 및 SEQ ID NO:22)를 사용하여 qPCR에 의해 분석되었다.
| 프라이머명 | 서열 |
| P.farinosa 액틴 Fwd | 5'- CTCCCCTCAACCCTAAAGCAA - 3' (SEQ ID NO: 19) |
| P.farinosa 액틴 Rv | 5'- GACAGGACAGCTTGGATGTTTAC - 3' (SEQ ID NO: 20) |
| S. oleracea 신장인자 Fwd | 5'- GCAGGGTCGTTCTTTGAGTC- 3' (SEQ ID NO: 21) |
| S. oleracea 신장인자 Rv | 5'- AGAGGCTCTTCCTGGTGACA - 3' (SEQ ID NO: 22) |
도 1은 페로노스포라 파리노사 액틴 유전자(Pfs 액틴; 하우스키핑 유전자)를 검출하도록 설계된 프라이머를 이용한 qPCR 결과를 나타낸다. 3개의 기술적 복제가 수행되었고, 상대 Pfs 액틴 발현은 상대적인 양(RQ = 1/(2^ Cttarget)) 및 정규화된 발현(NE = RQtarget/RQref)을 계산하여 분석되었다. 표적 유전자의 상대적인 양은 시금치의 하우스키핑 유전자인 스피니치아 올레라시아 신장 인자(elongation factor) 유전자의 발현으로 정규화되었다. y축의 값은 상대 Pfs 액틴 발현이다. x-축 상에서 왼쪽에서 오른쪽으로: VIGS 침묵 구조물이 사용되지 않은 식물의 잎에서 수득된 샘플, RFP VIGS 구조물이 사용된 식물의 잎에서 수득된 샘플(음성 대조군), 및 T70 VIGS 구조물이 사용된 식물의 잎에서 수득된 샘플. VIGS 침묵 구조물이 사용되지 않은 식물로부터의 샘플과 RFP VIGS 구조물이 사용된 식물로부터의 샘플 모두 저항성 표현형을 가졌다. 이 두 샘플들 모두 T70 유전자를 발현했다. 도 1에 제시된 qPCR 결과에 의해 나타난 바와 같이, qPCR을 사용하여 이들 샘플에서 Pfs 액틴이 검출될 수 없었으므로, 페로노스포라 파리노사는 존재하지 않았다. 대조적으로, Pfs 액틴의 높은 전사 수준은 T70-침묵 식물에서 수득된 샘플에서 측정되었다. 따라서, 페로노스포라 파리노사가 존재했으며, 이는 T70-침묵 식물에서 관찰된 감수성(susceptible) 표현형과 상관관계가 있다.
실시예 4: 노균병 잎 디스크 감염 분석
T70 유전자를 포함하는 시금치 식물은 대조군 시금치 계통인 비로플레(Viroflay), 레시스토플레(Resistoflay), 캘리플레(Califlay), 클레르몽(Clermont), 캄파니아(Campania), 보잉(Boeing) 및 라치오(Lazio)를 포함하는 테스트에서 노균병 병원균 페로노스포라 파리노사의 상이한 품종에 대한 저항성이 테스트되었다. 이러한 대조군 계통 각각은 상이한 Pfs 품종에 대해 알려진 저항성과 민감성을 가지고 있었다. 테스트에 사용된 식물은 적어도 두 번째 잎 단계에 있었고 아직 꽃이 피지 않았다.
저항성은 잎 디스크 테스트를 사용하여 테스트되었다. 다른 시금치 식물의 잎을 젖은 판지(moistened paperboard)가 있는 트레이에 넣었다. 시험잎 감염을 위한 페로노스포라 파리노사(P. farinosa)를 얻기 위해, 이미 페로노스포라 파리노사(P. farinosa)에 감염된 묘목(seedlings)을 물 20mL에 현탁시켰고, 무명천(cheesecloth)으로 여과시켰고, 통과액을 스프레이 플라스크에 수집하였다. 이 페로노스포라 파리노사 현탁액을 트레이에 분무-접종시켰다. 분무 접종은, 잎에 접종물(inoculum)로 완전히 덮이도록 분무되었고, 모든 디스크가 젖었는지 확인하여 이 완전한 피복은 모든 디스크가 젖었는지 확인하여 확인하였다. 트레이를 유리판으로 덮었고 15 ℃의 기후 챔버에 보관되었다(12시간 빛: 12시간 어둠 사이클). 접종 후 7일 내지14일에, 잎에 페로노스포라 파리노사(Pfs)의 존재에 대해 표현형으로 육안으로 점수를 매겼다.
잎은 잎 디스크의 위쪽(축방향 측) 또는 아래쪽(축방향 측)의 포자 형성 증상에 따라 점수가 매겨졌다. 포자형성의 정도는 디스크의 변색이 아니라 포자형성의 양에 의해 정량화 되었다. 표 3은 감염 분석에 사용된 질병 점수 척도에 대한 자세한 설명을 제공한다.
| 점수 | 잎 디스크 표현형(Leaf disc phenotype) |
| 9 | 포자 형성 없음(No sporulation) |
| 7-8 | 소량의 포자 형성(최대 10개의 분생포자(conidiophores)) |
| 5-6 | 디스크의 가장자리에 약간의 포자 형성 |
| 3-4 | 디스크의 작은 면적에 적당한 포자 형성(전체 잎 디스크 면적의 25-50%) 또는 잎 디스크의 가장자리에 강한 포자 형성의 패치 |
| 2 | 잎 디스크 면적의 50-75%에 걸쳐 적당한 포자 형성 |
| 1 | 잎 디스크 면적의 90-100%에강한 포자 형성 |
감염 분석은, 상이한 Pfs 품종(비로플레 = V, 레시스토플레 = R, 캘리플레, 클레르몽, 캄파니아, 보잉, 라치오)에 대한 감수성과 저항성이 알려진 대조군 시금치 계통뿐만 아니라 T70 유전자(T70)를 포함하는 시금치를 포함하여 검증되었다.
표 4는 잎 디스크 감염 분석 결과의 개요를 보여준다. 분석은 위에서 언급된 시금치 변종에 대해 페로노스포라 파리노사 품종 Pfs1 내지 Pfs17의 분리주로 수행되었다. 결과는 T70 저항성 유전자를 포함한 시금치가 적어도 페로노스포라 파리노사 품종인 Pfs1 내지 Pfs4, 및 Pfs7 내지 Pfs17에 대해 저항성이 있음을 보여주었다. Pfs6에 대한 저항성은 결정되지 않았지만(ND), 시금치 식물도 Pfs 6에 저항성이 있을 것으로 예상된다. T70 저항성 유전자를 함유하는 시금치는 Pfs5에 감수성이었다. 대조군 계통은 각각 다수의 Pfs 품종에 감수성이 있는 것으로 나타났다. T70 시금치만이 최근에 확인된 Pfs17에 저항성이 있었다.
| Pfs 품종(race) | V | R | 캘리플레이 (Califlay) |
클레몬트
(Clermont) |
캄파니아
(Campania) |
보잉
(Boeing) |
라치오
(Lazio) |
T70 |
| Pfs1 | 1 | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 |
| Pfs2 | 1 | 9 | 1 | 9 | 1 | 9 | 9 | 9 |
| Pfs3 | 1 | 1 | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 |
| Pfs4 | 1 | 1 | 1 | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 |
| Pfs5 | 1 | 1 | 9 | 1 | 9 | 9 | 9 | 1 |
| Pfs6 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 9 | 9 | ND |
| Pfs7 | 1 | 1 | 1 | 1 | 9 | 9 | 9 | 9 |
| Pfs8 | 1 | 1 | 9 | 1 | 1 | 1 | 9 | 9 |
| Pfs9 | 1 | 1 | 9 | 1 | 1 | 9 | 9 | 9 |
| Pfs10 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 9 | 9 |
| Pfs11 | 1 | 1 | 9 | 1 | 9 | 9 | 1 | 9 |
| Pfs12 | 1 | 1 | 9 | 1 | 1 | 1 | 1 | 9 |
| Pfs13 | 1 | 1 | 1 | 1 | 9 | 9 | 1 | 9 |
| Pfs14 | 1 | 1 | 9 | 1 | 1 | 1 | 1 | 9 |
| Pfs15 | 1 | 1 | 1 | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 |
| Pfs16 | 1 | 1 | 9 | 1 | 9 | 9 | 1 | 9 |
| Pfs17 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 9 |
실시예 5: Pfs 저항성 유전자 코딩 서열 및 단백질 서열의 정렬
새로운 저항성 유전자 코딩 서열(표 5) 및 새로운 저항성 단백질(표 6)의 유사성은 다중 정렬 소프트웨어를 사용하여 결정되었다. T10 (SEQ ID NO: 1), T70 (SEQ ID NO: 3), T71 (SEQ ID NO: 5), T72 (SEQ ID NO: 7), T75 (SEQ ID NO: 9), T76 (SEQ ID NO: 11), T83 (SEQ ID NO: 13), T89 (SEQ ID NO: 15), T96 (SEQ ID NO: 23) 및 T253 (SEQ ID NO: 25)의 코딩 서열을 사용하여 표 5에 나타낸 결과를 생성하였다. T10 (SEQ ID NO: 2), T70 (SEQ ID NO: 4), T71 (SEQ ID NO: 6), T72 (SEQ ID NO: 8), T75 (SEQ ID NO: 10), T76 (SEQ ID NO: 12), T83 (SEQ ID NO: 14), T89 (SEQ ID NO: 16), 및 T96 (SEQ ID NO: 24) 및 T253 (SEQ ID NO: 26)의 단백질 서열을 사용하여 표 6에 나타낸 결과를 생성하였다. 또한, T18(각각 SEQ ID No.27, SEQ ID No.28), T133(각각 SEQ ID No.29, SEQ ID No.30), T139(각각 SEQ ID No.31, SEQ ID No.32), T170(각각 SEQ ID No.33, SEQ ID No.34) 및 T175(각각 SEQ ID No.35, SEQ ID No.36)의 뉴클레오타이드 및 단백질 서열 모두는 또한 서열 중 약 90% 이상의 높은 서열 상동성을 갖는다. 모든 저항성 유전자는 뉴클레오티드 및 아미노산 수준 모두에서 매우 유사했다. 아미노산 수준에서, T70은 T10, T75, T76 및 T83과 유사성이 더 낮았으나(<94% 동일성), T71, T72 및 T89와 매우 유사했다(>97% 동일성).
| T10 | T70 | T71 | T72 | T75 | T76 | T83 | T89 | T96 | T253 | |
| T10 | 100.00 | 95.47 | 95.44 | 95.63 | 95.49 | 94.27 | 95.13 | 95.44 | 94.91 | 94.93 |
| T70 | 95.47 | 100.00 | 99.57 | 98.51 | 95.72 | 94.74 | 96.53 | 99.91 | 95.64 | 95.59 |
| T71 | 95.44 | 99.57 | 100.00 | 98.94 | 95.92 | 94.48 | 96.10 | 99.66 | 95.21 | 95.22 |
| T72 | 95.63 | 98.51 | 98.94 | 100.00 | 96.59 | 94.33 | 96.88 | 98.59 | 96.11 | 96.24 |
| T75 | 95.49 | 95.72 | 95.92 | 96.59 | 100.00 | 95.09 | 96.39 | 95.75 | 94,77 | 94,79 |
| T76 | 94.27 | 94.74 | 94.48 | 94.33 | 95.09 | 100.00 | 96.82 | 94.65 | 96,67 | 96,62 |
| T83 | 95.13 | 96.53 | 96.10 | 96.88 | 96.39 | 96.82 | 100.00 | 96.44 | 99.94 | 99.97 |
| T89 | 95.44 | 99.91 | 99.66 | 98.59 | 95.75 | 94.65 | 96.44 | 100.00 | 95.55 | 95.50 |
| T96 | 94.91 | 95.64 | 95.21 | 96.11 | 94.77 | 96,67 | 99.94 | 95.55 | 100.00 | 99.91 |
| T253 | 94.93 | 95.59 | 95.22 | 96.24 | 94.79 | 96,62 | 99.97 | 95.50 | 99.91 | 100.00 |
| T10 | T70 | T71 | T72 | T75 | T76 | T83 | T89 | T96 | T253 | |
| T10 | 100.00 | 92.11 | 91.85 | 92.26 | 92.62 | 90.09 | 91.30 | 91.93 | 90.57 | 90.92 |
| T70 | 92.11 | 100.00 | 99.48 | 97.50 | 93.23 | 91.41 | 93.84 | 99.83 | 92.44 | 92.79 |
| T71 | 91.85 | 99.48 | 100.00 | 98.02 | 93.32 | 91.23 | 93.32 | 99.66 | 91.92 | 92.27 |
| T72 | 92.26 | 97.50 | 98.02 | 100.00 | 94.36 | 90.97 | 94.75 | 97.67 | 93.45 | 94.03 |
| T75 | 92.62 | 93.23 | 93.32 | 94.36 | 100.00 | 92.36 | 94.01 | 93.23 | 91,67 | 92,01 |
| T76 | 90.09 | 91.41 | 91.23 | 90.97 | 92.36 | 100.00 | 94.79 | 91.23 | 94,19 | 94,55 |
| T83 | 91.30 | 93.84 | 93.32 | 94.75 | 94.01 | 94.79 | 100.00 | 93.66 | 99.48 | 100.00 |
| T89 | 91.93 | 99.83 | 99.66 | 97.67 | 93.23 | 91.23 | 93.66 | 100.00 | 92.27 | 92.62 |
| T96 | 90.57 | 92.44 | 91.92 | 93.45 | 91,67 | 94,19 | 99.48 | 92.27 | 100.00 | 99.48 |
| T253 | 90.92 | 92.79 | 92.27 | 94.03 | 92,01 | 94,55 | 100.00 | 92.62 | 99.48 | 100.00 |
기탁 정보
시금치의 기탁(스피니치아 올레라시아 2017.02544-B/SNNLENBL 19011503)은 주소가 7 Harris Place, Salinas, California 93901, United States인 Enza Zaden USA, Inc.에 의해 관리된다. 이 기탁에 대한 액세스는 37 CFR § 1.14 및 35 USC § 122에 의거하여 특허 및 상표의 청장이 이에 대한 자격이 있다고 결정한 사람이 본 출원이 계류 중인 동안 사용할 수 있다. 이 출원서의 모든 주장이 허용되면, 국립 산업, 식품 및 해양 박테리아 수장고, 퍼거슨 빌딩, 크레이브스톤 에스테이트, 벅스번, 애버딘, AB21 9YA, 영국(National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB Ltd), Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, United Kingdom)에 동일한 변종의 종자들을 적어도 2,500개 기탁할 수 있게 함으로써 해당 변종의 일반 대중에 대한 이용 가능성에 대한 모든 제한이 취소 불가능하게 제거될 것이다.
적어도 2500개의 시금치 종자(스피니치아 올레라시아 2017.02544-B/SNNLENBL 19011503)는 부다페스트 조약에 따라 2019년 2월 21일에 국립 산업, 식품 및 해양 박테리아 수장고(National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria Ltd; NCIMB Ltd), 퍼거슨 빌딩, 크레이브스톤 에스테이트, 벅스번, 애버딘, AB21 9YA, 영국에 기탁되었다. 기탁은 NCIMB 번호 43360으로 지정되었다. 이 기탁에 대한 액세스는 37 CFR § 1.14 및 35 USC § 122에 의거하여 특허 및 상표의 청장이 이에 대한 자격이 있다고 결정한 사람이 본 출원이 계류 중인 동안 사용할 수 있다. 이 출원의 청구항이 허가되면 해당 변종의 일반 대중에 대한 모든 제한이 취소할 수 없이 제거된다.
기탁은 공공 기탁기관인 NCIMB 기탁기관에 적어도 30년, 또는 가장 최근 기탁 샘플 요청 후 적어도 5년 동안 또는 특허 유효 기간 동안 유지되고, 이들 중 더 긴 쪽이 적용되며, 해당 기간 동안 기탁이 실행 불가능하게 되면 대체된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Enza Zaden Beheer B.V.
<120> DOWNY MILDEW RESISTANT SPINACH AND GENES CONFERRING RESISTANCE TO DOWNY MILDEW
<130> P126754PC01
<150> PCT/EP2019/063449
<151> 2019-05-24
<160> 36
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 3471
<212> DNA
<213> Spinacia oleracea
<220>
<223> T10
<400> 1
atggctgaaa tcggatactc ggtttgtgcg aaactcatcg aagtgattgg cagtgagctg 60
atcaaagaga tttgcgacac atggggttac aaatctcttc ttgaggacct caacaaaact 120
gtattgacgg tcaggaacgt tctcattcag gccggggtga tgcgggagct tactagtgaa 180
caacaaggtt tcattgcaga ccttaaagat gttgtttatg atgctgatga cttgttcgac 240
aagttactca ctcgtgctga gcgaaaacag attgatggaa acgaaatctc tgaaaaggta 300
cgtcgtttct tttcctctag taacaagatc ggtcaagctt actacatgtc tcgtaaggtt 360
aaggaaatta agaagcagtt ggatgaaatt gttgataggc atacaaaatt tgggtttagt 420
gctgagttta tacctgtttg taggggaagg gggaacgaga gggaaacacg ttcatatata 480
gatgtcaaga atattcttgg gagggataaa gataagaatg atatcataga taggttgctt 540
aatcgtaatg ataatgaagc ttgtagtttc ctgaccatag tgggagcggg aggattggga 600
aaaactgctc ttgcccaact tgtgttcaat gatgaaaggg tcaaaattga gtttcatgat 660
ttgaggtatt gggtttgtgt ctctgatcaa gatgggggcc aattttatgt gaaagagatc 720
ctttgtaaga ttttagagat ggttactaag gagaaagttg ataatagttc cgcattggaa 780
ttggtacaaa gccaatttca agagaagtta agaggaaaga agtacttcct tgttcttgat 840
gatgtatgga acgaggatcg tgagaagtgg tttcaattgg aagagttgtt aatgttgggt 900
caagggggaa gcaaggttgt agtgaccgca cgttctgaga aaacagcaaa tgtcataggg 960
aaaagacatt tatatacact ggaatgtttg tcaccagatt attcatggag cttatttgaa 1020
atgtcggctt ttcagaaagg gcaggagcag gaaaaccatc acgaactagt tcgtattggg 1080
aaaaagattg ttgaaaaatg ttataacaat ccacttgtga taaccgtggt tggaagtctt 1140
ctttatggag aggagataag taagtggcgg tcatttgaaa tgagtgagtt ggccaaaatt 1200
ggcaatgggg ataataagat tttgtcgata ttgaagctca gttactacaa tcttgcaaac 1260
tctttgaaga gttgttttag ttattgtgca gtatttccca aggatcataa aatagagaag 1320
gagatgttga ttgacctttg gatagcacaa ggatatgttg tgccgttgga tggtggtcaa 1380
agtatagaag atgctgccga ggaacatttt gtaattttat tacggagatg tttctttcaa 1440
gatgtagtga aggatgtata cggtgatgtt aattctgtta aaatccacga cttgatgcac 1500
gatgtcgccc aagaagtggg gagggaggaa atatgtgtag tgaatgataa tacaaagaac 1560
ttgggtgata aaatccgtca tgtacatggt gatgtcaata gatatgcaca aagagtctct 1620
ctgtgtagcc ataagattcg ttcgtatatt ggtggtgaat gtgaaaaagg ttgggtggat 1680
acactaatag acaactggat gtgtcttagg gtgttggact tgtcaaattc agatgttaaa 1740
agtttgccta attcaatagg taagttgttg cacttacggt atcttaacct gtcaaataat 1800
agaaatctaa agatacttcc tgatgcaatt acaagactgc ataatttgca gacactactt 1860
ttatcttcgt gcagaagttt aaaggagttg ccaaaagatt tttgcaaatt ggtcaaactg 1920
agacacttgg atttatgggg ttgttctgat ttgattggta tgccattggg aatggatagg 1980
ctaactagtc ttagagtact gccattcttt gtggtgggta ggaaggaaca aagtgttgat 2040
gatgagctga aagccctaaa aggcctcacc gagataaaag gctccatttc tatcagaatc 2100
tattcaaagt atagaatagt tgaaggcatg aatgacacag gaggagctgc ttatttgaag 2160
agcatgaaac atctcactgg ggttaatatt atatttatat ttgattataa aggtgtattt 2220
gttaaccctg aagctgtgtt ggaaacccta gagccacctt caaatatcaa gagcttatct 2280
atagataatt acgatggtac aacaattcca gtatggggaa gagcaaagat taattgggca 2340
atctccctct cacatcttgt tgacatcaag cttgtaggtt gtttatattt gcaggagatg 2400
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ttaccaacat tcttcccttc ccttgaaaaa cttaaacttt ggtatctgga aaagttgaag 2580
ggtttgggga acaggagacc gagtagtttt ccccgcctct ctaaattggt aatctgggaa 2640
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gaagaagaca agaatgctgg tgttggaaat tcacaagatg atgacaatgt caaattatgg 2820
aaggtgaaac tagacaatgt gagttgtctc aaatcactgc ccacaaattg tctgactcac 2880
ctcgacctta caataagtga ttccaaggag ggggagggtg aatgggaagt tggggaggca 2940
tttcagaagt gtgtatcttc tttgagaagc ctcaccataa tcggaaatca cggaataaat 3000
aaagtgaaga gactgtctgg aagaacaggg ttggagcatt tcactgcctt acacttactc 3060
aaattttcag atatagaaga ccaggaagat gagggcaaag acaacatcat attctggaaa 3120
tcctttcctc aaaacctccg cagtttgata attcaatact cttataaaat gacaagtttg 3180
cccatgggga tgcagtactt aacctccctc caaaccctca aactagaaaa ttgtgatgaa 3240
ttgaattccc ttccagaatg gataagcagc ttatcatctc ttcaatccct gtacatatac 3300
aaatgtccag ccctaaaatc actaccagaa gcaatgcgga acctcacctc ccttcagaga 3360
cttgagatac agcattgtcc agacctagct gaaagatgca gaaaacccaa cggggaggac 3420
tatcccaaaa ttcaacacat ccccaaaatt gtaagtcatt gcagaaagta a 3471
<210> 2
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<212> PRT
<213> Spinacia oleracea
<220>
<223> T10
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Met Ala Glu Ile Gly Tyr Ser Val Cys Ala Lys Leu Ile Glu Val Ile
1 5 10 15
Gly Ser Glu Leu Ile Lys Glu Ile Cys Asp Thr Trp Gly Tyr Lys Ser
20 25 30
Leu Leu Glu Asp Leu Asn Lys Thr Val Leu Thr Val Arg Asn Val Leu
35 40 45
Ile Gln Ala Gly Val Met Arg Glu Leu Thr Ser Glu Gln Gln Gly Phe
50 55 60
Ile Ala Asp Leu Lys Asp Val Val Tyr Asp Ala Asp Asp Leu Phe Asp
65 70 75 80
Lys Leu Leu Thr Arg Ala Glu Arg Lys Gln Ile Asp Gly Asn Glu Ile
85 90 95
Ser Glu Lys Val Arg Arg Phe Phe Ser Ser Ser Asn Lys Ile Gly Gln
100 105 110
Ala Tyr Tyr Met Ser Arg Lys Val Lys Glu Ile Lys Lys Gln Leu Asp
115 120 125
Glu Ile Val Asp Arg His Thr Lys Phe Gly Phe Ser Ala Glu Phe Ile
130 135 140
Pro Val Cys Arg Gly Arg Gly Asn Glu Arg Glu Thr Arg Ser Tyr Ile
145 150 155 160
Asp Val Lys Asn Ile Leu Gly Arg Asp Lys Asp Lys Asn Asp Ile Ile
165 170 175
Asp Arg Leu Leu Asn Arg Asn Asp Asn Glu Ala Cys Ser Phe Leu Thr
180 185 190
Ile Val Gly Ala Gly Gly Leu Gly Lys Thr Ala Leu Ala Gln Leu Val
195 200 205
Phe Asn Asp Glu Arg Val Lys Ile Glu Phe His Asp Leu Arg Tyr Trp
210 215 220
Val Cys Val Ser Asp Gln Asp Gly Gly Gln Phe Tyr Val Lys Glu Ile
225 230 235 240
Leu Cys Lys Ile Leu Glu Met Val Thr Lys Glu Lys Val Asp Asn Ser
245 250 255
Ser Ala Leu Glu Leu Val Gln Ser Gln Phe Gln Glu Lys Leu Arg Gly
260 265 270
Lys Lys Tyr Phe Leu Val Leu Asp Asp Val Trp Asn Glu Asp Arg Glu
275 280 285
Lys Trp Phe Gln Leu Glu Glu Leu Leu Met Leu Gly Gln Gly Gly Ser
290 295 300
Lys Val Val Val Thr Ala Arg Ser Glu Lys Thr Ala Asn Val Ile Gly
305 310 315 320
Lys Arg His Leu Tyr Thr Leu Glu Cys Leu Ser Pro Asp Tyr Ser Trp
325 330 335
Ser Leu Phe Glu Met Ser Ala Phe Gln Lys Gly Gln Glu Gln Glu Asn
340 345 350
His His Glu Leu Val Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Glu Lys Cys Tyr
355 360 365
Asn Asn Pro Leu Val Ile Thr Val Val Gly Ser Leu Leu Tyr Gly Glu
370 375 380
Glu Ile Ser Lys Trp Arg Ser Phe Glu Met Ser Glu Leu Ala Lys Ile
385 390 395 400
Gly Asn Gly Asp Asn Lys Ile Leu Ser Ile Leu Lys Leu Ser Tyr Tyr
405 410 415
Asn Leu Ala Asn Ser Leu Lys Ser Cys Phe Ser Tyr Cys Ala Val Phe
420 425 430
Pro Lys Asp His Lys Ile Glu Lys Glu Met Leu Ile Asp Leu Trp Ile
435 440 445
Ala Gln Gly Tyr Val Val Pro Leu Asp Gly Gly Gln Ser Ile Glu Asp
450 455 460
Ala Ala Glu Glu His Phe Val Ile Leu Leu Arg Arg Cys Phe Phe Gln
465 470 475 480
Asp Val Val Lys Asp Val Tyr Gly Asp Val Asn Ser Val Lys Ile His
485 490 495
Asp Leu Met His Asp Val Ala Gln Glu Val Gly Arg Glu Glu Ile Cys
500 505 510
Val Val Asn Asp Asn Thr Lys Asn Leu Gly Asp Lys Ile Arg His Val
515 520 525
His Gly Asp Val Asn Arg Tyr Ala Gln Arg Val Ser Leu Cys Ser His
530 535 540
Lys Ile Arg Ser Tyr Ile Gly Gly Glu Cys Glu Lys Gly Trp Val Asp
545 550 555 560
Thr Leu Ile Asp Asn Trp Met Cys Leu Arg Val Leu Asp Leu Ser Asn
565 570 575
Ser Asp Val Lys Ser Leu Pro Asn Ser Ile Gly Lys Leu Leu His Leu
580 585 590
Arg Tyr Leu Asn Leu Ser Asn Asn Arg Asn Leu Lys Ile Leu Pro Asp
595 600 605
Ala Ile Thr Arg Leu His Asn Leu Gln Thr Leu Leu Leu Ser Ser Cys
610 615 620
Arg Ser Leu Lys Glu Leu Pro Lys Asp Phe Cys Lys Leu Val Lys Leu
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Arg His Leu Asp Leu Trp Gly Cys Ser Asp Leu Ile Gly Met Pro Leu
645 650 655
Gly Met Asp Arg Leu Thr Ser Leu Arg Val Leu Pro Phe Phe Val Val
660 665 670
Gly Arg Lys Glu Gln Ser Val Asp Asp Glu Leu Lys Ala Leu Lys Gly
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Leu Thr Glu Ile Lys Gly Ser Ile Ser Ile Arg Ile Tyr Ser Lys Tyr
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Arg Ile Val Glu Gly Met Asn Asp Thr Gly Gly Ala Ala Tyr Leu Lys
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Ser Met Lys His Leu Thr Gly Val Asn Ile Ile Phe Ile Phe Asp Tyr
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Lys Gly Val Phe Val Asn Pro Glu Ala Val Leu Glu Thr Leu Glu Pro
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Pro Ser Asn Ile Lys Ser Leu Ser Ile Asp Asn Tyr Asp Gly Thr Thr
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Ile Pro Val Trp Gly Arg Ala Lys Ile Asn Trp Ala Ile Ser Leu Ser
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His Leu Val Asp Ile Lys Leu Val Gly Cys Leu Tyr Leu Gln Glu Met
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Pro Val Leu Ser Lys Leu Pro His Leu Lys Ser Leu Tyr Leu Ala Trp
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Leu Asn Asn Leu Glu Tyr Met Glu Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser
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Cys Pro Asp Leu Thr Trp Phe Pro Pro Cys Pro Ser Leu Glu Thr Leu
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Thr Thr Arg Gly Lys Glu Glu Lys Glu Glu Asp Lys Asn Ala Gly Val
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Asp Asn Val Ser Cys Leu Lys Ser Leu Pro Thr Asn Cys Leu Thr His
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Leu Asp Leu Thr Ile Ser Asp Ser Lys Glu Gly Glu Gly Glu Trp Glu
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Val Gly Glu Ala Phe Gln Lys Cys Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Thr
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Ile Ile Gly Asn His Gly Ile Asn Lys Val Lys Arg Leu Ser Gly Arg
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Leu Lys Leu Glu Asn Cys Asp Glu Leu Asn Ser Leu Pro Glu Trp Ile
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Asn Gly Glu Asp Tyr Pro Lys Ile Gln His Ile Pro Lys Ile Val Ser
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<212> DNA
<213> Spinacia oleracea
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aggcacttgg atttaaggtt ttgttctgat ttgattggta tgccattggg aatggatagg 1980
ctaactagtc ttagagtact gccattcttt gtggtgggta ggaaggaaca aagtgttgat 2040
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<213> Spinacia oleracea
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165 170 175
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aatcgtaatg gtaatgaagc ttgtagtttc ctgaccatag tgggagcggg aggattggga 600
aaaactgctc ttgcacaact tgtgttcaat gatgaaaggg tcaaaattga gttccatgat 660
ttgaggtatt gggtttgtgt ctctgatcaa gatgggggcc aatttgatgt gaaagaaatc 720
ctttgtaaga ttttagaggt ggttactaag gagaaagttg ataatagttc cacattggaa 780
ttggtacaaa gccaatttca agagaagtta agaggaaaga agtacttcct tgttcttgat 840
gatgtatgga acgaggatcg tgagaagtgg cttcctttgg aagagttgtt aatgttgggt 900
caagggggaa gcaaggttgt agtgaccaca cgttcagaga agacagcaaa tgtcataggg 960
aaaagacatt tttatacact ggaatgtttg tcaccagatt attcatggag cttatttgaa 1020
atgtcggctt ttcagaaagg gcatgagcag gaaaaccatg acgaactagt tgatattggg 1080
aaaaagattg ttgaaaaatg ttataacaat ccacttgcta taacggtggt aggaagtctt 1140
ctttatggag aggagataaa taagtggcgg tcatttgaaa tgagtgagtt ggccaaaatt 1200
ggcaatgggg ataataagat tttgtcgata ttgaagctca gttactacaa tcttgcaaac 1260
tctttgaaga gttgttttag ttattgtgca gtatttccca aggatcataa aatagagaag 1320
gagatgttga ttgacctttg gatagcacaa ggatatgttg tgccgttgga tggaggtcaa 1380
agtatagaag atgctgccga ggaacatttt gtaattttgt tacgaaggtg tttctttcaa 1440
gatgtagtga aggatgaata cggtgatgtt gattctgtta aaatccacga cttgatgcac 1500
gatgtcgccc aagaagtggg cagagaggaa atctgtatag tgaatgataa tacaaagaac 1560
ttgggtgata aaatccgtca tgtacatcgt gatgtcatta gatatgcaca aagagtctct 1620
ctgtgtagcc ataagattcg ttcgtatatt ggtggtaaat gtgaaaaacg ttgggtggat 1680
acactaatag acaagtggat gtgtcttagg atgttggact tgtcaaattc agatgttaaa 1740
agtttgccta attcaatagg taagttgttg cacttacggt atcttaacct gtcaaataat 1800
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ttagaagatt gcagaagttt aaaggagttg ccaaaagatt tttgcaaatt ggtcaaactg 1920
aggcacttgg atttaaggtt ttgttctgat ttgattggta tgccattggg aatggatagg 1980
ctaactagtc ttagagtact gccattcttt gtggtgggta ggaaggaaca aagtgttgat 2040
gatgagctga aagccctaaa aggcctcacc gagataaaag gctccattcg tattagaatc 2100
cattcaaagt atagaatagt tgaaggcatg aatgacacag gaggagctgg gtatttgaag 2160
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gataattacg atggtacaac aattccagta tggggaagag cagagattaa ttgggcaatc 2340
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tacatggaga gtagaagcag cagcagtagc agtgacacag aagcagcaac accagaatta 2520
ccaacattct tcccttccct tgaaaaactt acactttggt atctggaaaa gttgaagggt 2580
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ccagatctaa cgtggtttcc tccttgtcca agccttaaaa cgttgaaatt ggaaaaaaac 2700
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aaaataactg gaatagatta cagggagggg gagattgaat cagattccgt ggaggaggag 2940
attgaattgg aagttgggga ggcatttcag aagtgtgcat cttctttgag aagcctcatc 3000
ataatcggaa atcacggaat aaataaagtg atgagactgt ctggaagaac agggttggag 3060
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gaagacaaca tcatattctg gaaatccttt cctcaaaacc tccgcagttt ggaaattgaa 3180
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cggaacctca cctcccttca gacacttggg atatcggatt gtccagacct agttaaaaga 3420
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<212> PRT
<213> Spinacia oleracea
<220>
<223> T89
<400> 16
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Gly Ser Glu Leu Ile Lys Glu Ile Cys Asp Thr Trp Gly Tyr Lys Ser
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Leu Leu Glu Asp Leu Asn Lys Thr Val Leu Thr Val Arg Asn Val Leu
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Ile Ala Asp Leu Lys Asp Val Val Tyr Asp Ala Asp Asp Leu Phe Asp
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Lys Leu Leu Thr Arg Ala Glu Arg Lys Gln Ile Asp Gly Asn Glu Ile
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Ser Glu Lys Val Arg Arg Phe Phe Ser Ser Ser Asn Lys Ile Gly Gln
100 105 110
Ala Tyr Tyr Met Ser Arg Lys Val Lys Glu Ile Lys Lys Gln Leu Asp
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Glu Ile Val Asp Arg His Thr Lys Phe Gly Phe Ser Ala Glu Phe Ile
130 135 140
Pro Val Cys Arg Gly Arg Gly Asn Glu Arg Glu Thr Arg Ser Tyr Ile
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Asp Val Lys Asn Ile Leu Gly Arg Asp Lys Asp Lys Asn Asp Ile Ile
165 170 175
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Ile Val Gly Ala Gly Gly Leu Gly Lys Thr Ala Leu Ala Gln Leu Val
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Val Cys Val Ser Asp Gln Asp Gly Gly Gln Phe Asp Val Lys Glu Ile
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Leu Cys Lys Ile Leu Glu Val Val Thr Lys Glu Lys Val Asp Asn Ser
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Ser Thr Leu Glu Leu Val Gln Ser Gln Phe Gln Glu Lys Leu Arg Gly
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Lys Lys Tyr Phe Leu Val Leu Asp Asp Val Trp Asn Glu Asp Arg Glu
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Lys Arg His Phe Tyr Thr Leu Glu Cys Leu Ser Pro Asp Tyr Ser Trp
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Gly Asn Gly Asp Asn Lys Ile Leu Ser Ile Leu Lys Leu Ser Tyr Tyr
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Pro Lys Asp His Lys Ile Glu Lys Glu Met Leu Ile Asp Leu Trp Ile
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Thr Leu Ile Asp Lys Trp Met Cys Leu Arg Met Leu Asp Leu Ser Asn
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Ser Asp Val Lys Ser Leu Pro Asn Ser Ile Gly Lys Leu Leu His Leu
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Lys Ile Thr Gly Ile Asp Tyr Arg Glu Gly Glu Ile Glu Ser Asp Ser
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VIGS-construct
<400> 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
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<210> 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<220>
<223> T96
<400> 23
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cgtcgtttct tttcctctag taacaagatc ggtcaagctt actacatgtc tcgtaaggtt 360
aaggaaatta agaagcagtt ggatgaaatt gttgataggc atacaaaatt tgggtttagt 420
gctgagttta tacctgtttg taggggaagg ggaaacgaga gggaaacacg ttcatatata 480
gatgtcaaga atattcttgg gagggataaa gataagaatg atatcataga taggttgctt 540
aatcgtaatg gtaatgaagc ttgtagtttc ctgaccatag tgggagcggg aggattggga 600
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ctttgtaaga ttttagaggt ggttactaag gagaaagttg ataatagttc cacattggaa 780
ttggtacaaa gccaatttca agagaagtta agaggaaaga agtacttcct tgttcttgat 840
gatgtatgga acgaagatcg tgagaagtgg cttcctttgg aagagttgtt aatgttgggt 900
caagggggaa gcaaggttgt agtgaccaca cgttcagaga agacagcaaa tgtcataggg 960
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atgtcggctt ttcagaaagg gcatgagcag gaaaaccatc acgaactagt tgatattggg 1080
aaaaagattg ttgaaaaatg ttataacaat ccacttgcta taacggtggt aggaagtctt 1140
ctttatggag aggagataag taagtggcgg tcatttgaaa tgagtgagtt ggccaaaatt 1200
ggcaatgggg ataataagat tttgtcgata ttgaagctca gttactacaa tcttgcaaac 1260
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ctaactagtc ttagagtact gccatacttt gtggtgggta ggaagaaaca aagtgttgat 2040
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agtggtacaa caattccagt atggggaaga gcagagatta attgggcaat ctccctctca 2340
catcttgtcg acatcacgct tgaagattgt tacaatttgc aggagatgcc agtgctgagt 2400
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gtatcttctt tgagaagcct catcataatc ggaaatcacg gaataaataa agtgatgaga 3000
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caacacatcc ccggcaattg taagtga 3447
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<211> 1148
<212> PRT
<213> Spinacia oleracea
<220>
<223> T96
<400> 24
Met Ala Glu Ile Gly Tyr Ser Val Cys Ala Lys Leu Ile Glu Val Ile
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Gly Ser Glu Leu Ile Lys Glu Ile Cys Asp Thr Trp Gly Tyr Lys Ser
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Leu Leu Glu Asp Leu Asn Lys Thr Val Leu Thr Val Arg Asn Val Leu
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Ile Ala Asp Leu Lys Asp Val Val Tyr Asp Ala Asp Asp Leu Phe Asp
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Lys Leu Leu Thr Arg Ala Glu Arg Lys Gln Ile Asp Gly Asn Glu Ile
85 90 95
Ser Glu Lys Val Arg Arg Phe Phe Ser Ser Ser Asn Lys Ile Gly Gln
100 105 110
Ala Tyr Tyr Met Ser Arg Lys Val Lys Glu Ile Lys Lys Gln Leu Asp
115 120 125
Glu Ile Val Asp Arg His Thr Lys Phe Gly Phe Ser Ala Glu Phe Ile
130 135 140
Pro Val Cys Arg Gly Arg Gly Asn Glu Arg Glu Thr Arg Ser Tyr Ile
145 150 155 160
Asp Val Lys Asn Ile Leu Gly Arg Asp Lys Asp Lys Asn Asp Ile Ile
165 170 175
Asp Arg Leu Leu Asn Arg Asn Gly Asn Glu Ala Cys Ser Phe Leu Thr
180 185 190
Ile Val Gly Ala Gly Gly Leu Gly Lys Thr Ala Leu Ala Gln Leu Val
195 200 205
Phe Asn Asp Glu Arg Val Lys Ile Glu Phe His Asp Leu Arg Tyr Trp
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Val Cys Val Ser Asp Gln Asp Gly Gly Gln Phe Asp Val Lys Glu Ile
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Leu Cys Lys Ile Leu Glu Val Val Thr Lys Glu Lys Val Asp Asn Ser
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Ser Thr Leu Glu Leu Val Gln Ser Gln Phe Gln Glu Lys Leu Arg Gly
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Lys Lys Tyr Phe Leu Val Leu Asp Asp Val Trp Asn Glu Asp Arg Glu
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Lys Trp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Leu Met Leu Gly Gln Gly Gly Ser
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Lys Val Val Val Thr Thr Arg Ser Glu Lys Thr Ala Asn Val Ile Gly
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Lys Arg His Phe Tyr Thr Leu Glu Cys Leu Ser Pro Asp Tyr Ser Trp
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Ser Leu Phe Glu Met Ser Ala Phe Gln Lys Gly His Glu Gln Glu Asn
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His His Glu Leu Val Asp Ile Gly Lys Lys Ile Val Glu Lys Cys Tyr
355 360 365
Asn Asn Pro Leu Ala Ile Thr Val Val Gly Ser Leu Leu Tyr Gly Glu
370 375 380
Glu Ile Ser Lys Trp Arg Ser Phe Glu Met Ser Glu Leu Ala Lys Ile
385 390 395 400
Gly Asn Gly Asp Asn Lys Ile Leu Ser Ile Leu Lys Leu Ser Tyr Tyr
405 410 415
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aaagagatgt tgattgacct ttggatagca caaggatatg ttgtgccgtt ggatggtggt 1380
caaagtatag aagatgctgc cgaggaacat tttgtaattt tattacggag atgtttcttt 1440
caagatgtag tgaaggatgt atacggtgat gttaattctg ttaaaatcca cgacttgatg 1500
cacgacgtcg ctcaagaagt agggagagag gaaatctgta tagtgaatgc taatacaaag 1560
aacttgggtg ataaaatccg tcatgtacat tgtgatgtca atagatatgc acaaagagtc 1620
tctctgtgta gccataagat tcgttcgtat attggtggta aatgtgaaaa acgttgggtg 1680
gatacactaa tagacaagtg gatgtgtctt agggtgttgg acttgtcaag gtcggatgtt 1740
aaaaatttgc ctaattcaat aggtaaattg ttgcacttga ggtatcttaa cctgtcaaat 1800
aatagaaatc taaagatact tcctgatgca attacaagac tgcataactt gcagacacta 1860
cttttagaag attgcagaag tttaatggag ttgccaaaag atttttgcaa attggtcaaa 1920
ctgagacact tggatttatg gggttgtgat gatttgattg gtatgccatt gggaatggat 1980
atgctaacta gtcttagagt actgccatac tttgtggtgg gtaggaagaa acaaagtgtt 2040
gatgatgagc tgaaagccct aaaaggcctc accgagataa aaggcgacat tcgtattaga 2100
atctgttcca attatagaat agttgaaggc atgaatgaca caggaggagc tgggtattta 2160
aagagcatga aacatctcac gggggttgat attacatttg atggtggatg tgttaaccct 2220
gaagctgtgt tggcaaccct agagccacct tcaaatatca agaggttaga gatgtggcat 2280
tacagtggta caacaattcc agtatgggga agagcagaga ttaattgggc aatctccctc 2340
tcacatcttg tcgacatcac gcttgaagat tgttacaatt tgcaggagat gccagtgctg 2400
agtaaactgc ctcatttgaa atcactggaa cttacagagt tggataactt agagtacatg 2460
gagagtagaa gcagcagcag tagcagtgac acagaagcag caacaccaga attaccaaca 2520
ttcttccctt cccttgaaaa acttacactt tggcgtctgg acaagttgaa gggttttggg 2580
aacaggagat cgagtagttt tccccgcctc tctaaattgg aaatctggaa atgcccagat 2640
ctaacgtcat ttccttcttg tccaagcctt gaagagttgg aattgaaaga aaacaatgaa 2700
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acaataagtg attccaagga gggggagggt gaatgggaag ttggggatgc atttcagaag 2940
tgtgtatctt ctttgagaag cctcatcata atcggaaatc acggaataaa taaagtgatg 3000
agactgtctg gaagaacagg gttggagcat ttcactctgt tggactcact caaactttca 3060
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caaaaccttc gcagtttgag aattaaagac tctgacaaaa tgacaagttt gcccatgggg 3180
atgcagtact taacctccct ccaaaccctc gaactatcat attgtgatga attgaattcc 3240
cttccagaat ggataagcag cttatcatct cttcaatacc tgcgcatata caactgtcca 3300
gccctgaaat cactaccaga agcaatgcgg aacctcacct cccttcagac acttggggga 3360
taa 3363
<210> 36
<211> 1120
<212> PRT
<213> Spinacia oleracea
<220>
<223> T175
<400> 36
Met Ala Glu Ile Gly Tyr Ser Val Cys Ser Lys Leu Ile Glu Val Met
1 5 10 15
Gly Ser Lys Ile Ile Lys Glu Ile Cys Asp Met Trp Gly Tyr Lys Thr
20 25 30
His Leu Glu Asp Leu Asn Lys Ser Val Leu Thr Ile Lys Asn Val Leu
35 40 45
Met Asp Ala Glu Val Lys Arg Asp Leu Ser Arg Val Gln Gln Gly Tyr
50 55 60
Ile Ala Glu Leu Lys Asp Val Val Tyr Asp Ala Asp Asp Leu Phe Asp
65 70 75 80
Glu Phe Leu Thr Leu Ala Glu Leu Lys Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Lys
85 90 95
Gly Gly Gly Lys Phe Ser Glu Lys Val Arg Arg Phe Phe Ser Ser Asn
100 105 110
Lys Glu Lys Met Asp Gln Ala Tyr Asp Met Ser Arg Lys Val Lys Lys
115 120 125
Ile Lys Lys Gln Leu Asp Glu Ile Val Asp Arg His Thr Lys Phe Gly
130 135 140
Phe Ile Val Asp Tyr Lys Pro Ile Ile Arg Arg Arg Glu Glu Thr Cys
145 150 155 160
Ser Tyr Val Asp Ala Lys Glu Ile Ile Gly Arg Asp Lys Asp Lys Asp
165 170 175
Ala Ile Ile Asp Met Leu Leu Asp Arg Asn Asp Lys Glu Gly Cys Ser
180 185 190
Phe Leu Thr Ile Val Gly Val Gly Gly Leu Gly Lys Thr Ala Leu Ala
195 200 205
Gln Leu Val Tyr Asn Asp Glu Lys Val Ile Lys Glu Phe Glu Gly Leu
210 215 220
Arg Tyr Trp Ala Cys Val Ser Asp Gln Asp Gly Glu Glu Phe Asp Val
225 230 235 240
Lys Ala Ile Leu Cys Lys Ile Leu Glu Ser Val Thr Lys Val Lys Pro
245 250 255
Asp Gly Ser Ser Gly Leu Glu Leu Val Gln Asn Gln Phe Gln Glu Arg
260 265 270
Leu Arg Gly Lys Lys Tyr Leu Leu Val Leu Asp Asp Val Trp Asn Glu
275 280 285
Asp Arg Glu Lys Trp Leu Ser Leu Lys Lys Phe Leu Met Leu Gly Gln
290 295 300
Arg Gly Ser Arg Ile Met Val Thr Thr Arg Ser Lys Thr Thr Thr Thr
305 310 315 320
Ile Ile Gly Asp Lys His Ala Tyr Glu Leu Gln Gly Leu Ser Gln Glu
325 330 335
Asp Ser Trp His Leu Phe Glu Ile Ser Ala Phe Asp Asn Glu Cys Ile
340 345 350
Arg His Asn Glu Phe Val Glu Ile Gly Glu Lys Ile Val Ser Lys Cys
355 360 365
Tyr Ser Ile Pro Leu Ala Ile Lys Val Val Gly Ser Leu Leu Phe Gly
370 375 380
Gln Glu Ile Val Lys Trp Gln Ser Phe Glu Ala Ser Gly Leu Ser Gln
385 390 395 400
Ile Gly Asn Gly Gly Asn Gln Ile Met Ser Ile Leu Lys Leu Ser Tyr
405 410 415
His Asn Leu Ala His Ser Leu Lys Ser Cys Phe Ser Tyr Cys Ala Val
420 425 430
Phe Pro Lys Asp His Lys Ile Glu Lys Glu Met Leu Ile Asp Leu Trp
435 440 445
Ile Ala Gln Gly Tyr Val Val Pro Leu Asp Gly Gly Gln Ser Ile Glu
450 455 460
Asp Ala Ala Glu Glu His Phe Val Ile Leu Leu Arg Arg Cys Phe Phe
465 470 475 480
Gln Asp Val Val Lys Asp Val Tyr Gly Asp Val Asn Ser Val Lys Ile
485 490 495
His Asp Leu Met His Asp Val Ala Gln Glu Val Gly Arg Glu Glu Ile
500 505 510
Cys Ile Val Asn Ala Asn Thr Lys Asn Leu Gly Asp Lys Ile Arg His
515 520 525
Val His Cys Asp Val Asn Arg Tyr Ala Gln Arg Val Ser Leu Cys Ser
530 535 540
His Lys Ile Arg Ser Tyr Ile Gly Gly Lys Cys Glu Lys Arg Trp Val
545 550 555 560
Asp Thr Leu Ile Asp Lys Trp Met Cys Leu Arg Val Leu Asp Leu Ser
565 570 575
Arg Ser Asp Val Lys Asn Leu Pro Asn Ser Ile Gly Lys Leu Leu His
580 585 590
Leu Arg Tyr Leu Asn Leu Ser Asn Asn Arg Asn Leu Lys Ile Leu Pro
595 600 605
Asp Ala Ile Thr Arg Leu His Asn Leu Gln Thr Leu Leu Leu Glu Asp
610 615 620
Cys Arg Ser Leu Met Glu Leu Pro Lys Asp Phe Cys Lys Leu Val Lys
625 630 635 640
Leu Arg His Leu Asp Leu Trp Gly Cys Asp Asp Leu Ile Gly Met Pro
645 650 655
Leu Gly Met Asp Met Leu Thr Ser Leu Arg Val Leu Pro Tyr Phe Val
660 665 670
Val Gly Arg Lys Lys Gln Ser Val Asp Asp Glu Leu Lys Ala Leu Lys
675 680 685
Gly Leu Thr Glu Ile Lys Gly Asp Ile Arg Ile Arg Ile Cys Ser Asn
690 695 700
Tyr Arg Ile Val Glu Gly Met Asn Asp Thr Gly Gly Ala Gly Tyr Leu
705 710 715 720
Lys Ser Met Lys His Leu Thr Gly Val Asp Ile Thr Phe Asp Gly Gly
725 730 735
Cys Val Asn Pro Glu Ala Val Leu Ala Thr Leu Glu Pro Pro Ser Asn
740 745 750
Ile Lys Arg Leu Glu Met Trp His Tyr Ser Gly Thr Thr Ile Pro Val
755 760 765
Trp Gly Arg Ala Glu Ile Asn Trp Ala Ile Ser Leu Ser His Leu Val
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Asp Ile Thr Leu Glu Asp Cys Tyr Asn Leu Gln Glu Met Pro Val Leu
785 790 795 800
Ser Lys Leu Pro His Leu Lys Ser Leu Glu Leu Thr Glu Leu Asp Asn
805 810 815
Leu Glu Tyr Met Glu Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Thr Glu
820 825 830
Ala Ala Thr Pro Glu Leu Pro Thr Phe Phe Pro Ser Leu Glu Lys Leu
835 840 845
Thr Leu Trp Arg Leu Asp Lys Leu Lys Gly Phe Gly Asn Arg Arg Ser
850 855 860
Ser Ser Phe Pro Arg Leu Ser Lys Leu Glu Ile Trp Lys Cys Pro Asp
865 870 875 880
Leu Thr Ser Phe Pro Ser Cys Pro Ser Leu Glu Glu Leu Glu Leu Lys
885 890 895
Glu Asn Asn Glu Ala Leu Gln Ile Ile Val Lys Ile Thr Thr Thr Arg
900 905 910
Gly Lys Glu Glu Lys Glu Glu Asp Lys Asn Ala Gly Val Gly Asn Ser
915 920 925
Gln Asp Asp Asp Asn Val Lys Leu Trp Lys Val Glu Ile Asp Asn Leu
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Gly Tyr Leu Lys Ser Leu Pro Thr Asn Cys Leu Thr His Leu Asp Leu
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965 970 975
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980 985 990
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995 1000 1005
Glu His Phe Thr Leu Leu Asp Ser Leu Lys Leu Ser Asn Ile Glu Asp
1010 1015 1020
Gln Glu Asp Glu Gly Glu Asp Asn Ile Ile Phe Trp Lys Ser Phe Pro
1025 1030 1035 1040
Gln Asn Leu Arg Ser Leu Arg Ile Lys Asp Ser Asp Lys Met Thr Ser
1045 1050 1055
Leu Pro Met Gly Met Gln Tyr Leu Thr Ser Leu Gln Thr Leu Glu Leu
1060 1065 1070
Ser Tyr Cys Asp Glu Leu Asn Ser Leu Pro Glu Trp Ile Ser Ser Leu
1075 1080 1085
Ser Ser Leu Gln Tyr Leu Arg Ile Tyr Asn Cys Pro Ala Leu Lys Ser
1090 1095 1100
Leu Pro Glu Ala Met Arg Asn Leu Thr Ser Leu Gln Thr Leu Gly Gly
1105 1110 1115 1120
Claims (20)
- 페로노스포라 파리노사(Peronospora farinosa; Pfs)에 의해 유발된 노균병(downy mildew)에 저항성인 시금치 식물로서, 상기 시금치 식물은 하나 이상의 저항성 유전자를 포함하고, 상기 하나 이상의 저항성 유전자는 SEQ ID No. 4와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 단백질을 암호화하고, 상기 단백질은 보존된 아미노산 서열 KDHKIEKE 및 보존된 아미노산 서열 LSNNRNLKIL을 포함하는 것인, 시금치 식물.
- 제1항에 있어서,
상기 하나 이상의 저항성 유전자는 단백질을 암호화하고, 상기 단백질은 SEQ ID No.2, SEQ ID No.4, SEQ ID No.6, SEQ ID No.8, SEQ ID No.14, SEQ ID No.16, SEQ ID No.24, SEQ ID No.26, SEQ ID No.28, SEQ ID No.30, SEQ ID No.32, SEQ ID No.34 및 SEQ ID No.36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 시금치 식물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 하나 이상의 저항성 유전자는 SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7, SEQ ID No.13, SEQ ID No.15, SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.33 및 SEQ ID No.35로 이루어진 군으로부터 선택된 코딩 서열을 포함하는 것인, 시금치 식물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시금치 식물은 SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7 및 SEQ ID No.15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 저항성 유전자를 포함하는 것인, 시금치 식물.
- 페로노스포라 파리노사(Pfs)에 의해 유발된 노균병에 저항성인 시금치 식물로서, 하나 이상의 저항성 유전자를 포함하는 시금치 식물은 SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7, SEQ ID No.9, SEQ ID No.11, SEQ ID No.13, and SEQ ID No.15, SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.33 및 SEQ ID No.35로 이루어진 군으로부터 선택된 코딩 서열을 포함하는 것인, 시금치 식물.
- 제5항에 있어서,
상기 하나 이상의 저항성 유전자는 SEQ ID No.2, SEQ ID No.4, SEQ ID No.6, SEQ ID No.8, SEQ ID 10, SEQ ID No.12, SEQ ID No.14, and SEQ ID No.16, SEQ ID No.24, SEQ ID No.26, SEQ ID No.28, SEQ ID No.30, SEQ ID No.32, SEQ ID No.34 및 SEQ ID No.36으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 것인, 시금치 식물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 식물은 페로노스포라 파리노사 품종인 Pfs1 내지 Pfs4, 및 Pfs7 내지 Pfs17에 대해 적어도 저항성인 것인, 시금치 식물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 저항성 유전자는 기탁 번호 NCIMB 43360으로부터 유래된 것인, 시금치 식물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 시금치 식물로부터 수득된 종자로서, 상기 종자는 하나 이상의 저항성 유전자를 포함하고, 상기 하나 이상의 저항성 유전자는 SEQ ID No. 4와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 암호화하고, 상기 단백질은 보존된 아미노산 서열 KDHKIEKE 및 보존된 아미노산 서열 LSNNRNLKIL을 포함하는 것인, 종자.
- 시금치 식물에서 노균병에 대한 저항성을 부여하는 저항성 유전자로서, 상기 유전자는 SEQ ID No. 4와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 단백질을 암호화하는 것인, 저항성 유전자.
- 제10항에 있어서,
상기 유전자는 SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7, SEQ ID No.13, SEQ ID No.15, SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.33 및 SEQ ID No.35로 이루어진 군으로부터 선택된 코딩 서열을 포함하는 것인, 저항성 유전자.
- 제10항 또는 제11항에 있어서,
상기 저항성 유전자는 단백질을 암호화하고, 상기 단백질은 보존된 아미노산 서열 KDHKIEKE 및 보존된 아미노산 서열 LSNNRNLKIL로 구성된 것인, 저항성 유전자.
- 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 저항성 유전자의 코딩 서열은 SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7 및 SEQ ID No.15로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 저항성 유전자.
- 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유전자는 시금치의 페로노스포라 파리노사 품종인 Pfs1 내지 Pfs4, 및 Pfs7 내지 Pfs17에 대한 저항성을 제공하는 것인, 저항성 유전자.
- 노균병에 저항성인 시금치 식물을 제공하는 방법으로서, 상기 방법은 하나 이상의 저항성 유전자를 시금치 식물의 게놈에 도입하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 저항성 유전자는 SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7, SEQ ID No.13, SEQ ID No.15, SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.33 및 SEQ ID No.35로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제15항에 있어서,
상기 하나 이상의 내성 유전자의 도입은 게놈 편집 기술(genome editing techniques), CRISPR Cas 또는 돌연변이 유발 기술(mutagenisis techniques)에 의해 달성되는 것인, 방법.
- 노균병에 저항성인 시금치 식물을 제공하는 방법으로서, 상기 방법은,
a) 하나 이상의 저항성 유전자(들)를 포함하는 시금치 식물을 제공하는 단계로서, 상기 저항성 유전자(들)는 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 것인, 하나 이상의 저항성 유전자(들)를 포함하는 시금치 식물을 제공하는 단계,
b) a) 단계의 시금치 식물을 감수성(susceptible) 시금치 식물과 교배시키는 단계,
c) 선택적으로, 적어도 1회 동안 b) 단계에서 수득된 식물을 자가화하는 단계(selfing), 및
d) 노균병에 저항성인 식물을 선택하는 단계
를 포함하는, 노균병에 저항성인 시금치 식물을 제공하는 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 하나 이상의 내성 유전자의 코딩 서열은 SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7, 및 SEQ ID No.15로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시금치 식물은 페로노스포라 파리노사 품종인 Pfs1 내지 Pfs4, 및 Pfs7 내지 Pfs17에 의해 유발된 노균병에 저항성인 것인, 방법.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 내성 유전자(들)은 기탁 번호 NCIMB 43360으로부터 수득되는 것인, 방법.
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