CN102165063A - 使植物的生物量增产的基因及其利用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供在能够使植物生物量大幅增产的同时赋予植物盐胁迫耐性的技术。本发明的技术是，在植物体中，导入编码具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质的基因，或改变其内在的该基因的表达控制区域，所述蛋白质从N末端一侧起依次具有包含序列号3所示氨基酸序列的共有序列和包含序列号2所示氨基酸序列的共有序列。
Description
技术领域
本发明涉及导入了规定基因或其内在的该基因的表达控制区域发生了改变植物体；以及通过导入规定基因或改变其内在的该基因的表达控制区域来使生物量增产、并赋予生物体以盐胁迫耐性的方法；还涉及生物量增产了、且被赋予了盐胁迫耐性的植物体的制造方法。
背景技术
所谓生物量(biomass)，一般是指在每一定面积生息或存在的生物的总量，特别在以植物为对象的情况下，意味着每单位面积的干重。生物量的单位以质量或能量来数值化。所称的生物量这一表达与“生物体量”、“生物质量”是同义语，在植物生物量的情况下还有时使用“现存量(Standingcrop)”的用语。植物生物量是使用太阳能固定大气中的二氧化碳而生成的，因而可以作为所谓碳中和的能量而被捕获。因此，增加植物的生物量具有保全地球环境、防止地球温暖化、降低温室效应气体排放的效果。因此，使植物生物量增产的技术在产业上的重要性较高。
另一方面，植物是以获得其一部分组织本身(种子、根、叶茎等)为目的栽培的，或者是以生产油脂等各种物质为目的栽培的。例如，作为由植物生产的油脂，大豆油、胡麻油、橄榄油、椰子油、米糠油、棉籽油、向日葵油、玉米油、红花油、棕榈油和菜籽油等自古以来已经为人们所知，在家庭用途和/或工业用途中被广泛利用。另外，由植物生产的油脂也可以作为生物柴油燃料和/或生物塑料的原料使用，作为石油替代能源应用性正在扩大。
特别是甘蔗等能量作物是生物燃料的原料，因此期待使植物自身的总量(植物生物量)增产。在这样的现状下，为了使植物生物量增产，需要提高每单位耕地面积的生产性。这里假定每单位耕地面积的栽培个体数一定，则可判定需要提高每个个体的生物量。
然而，植物生物量被认为与多个基因相关(所谓量的性状的一种)，不能通过个别的基因导入、基因操作而有效地增产。另一方面，将多个基因以所需的状态导入植物是非常困难的，另外，即使能够导入，也存在并不能确实地获得所需的性状这样的问题。
作为使植物生物量增产的技术，已知例如专利文献1～7所公开那样的各种基因导入技术。然而，虽然任一种技术都是着眼于生物量增产效果的，但尚未开发出赋予植物体以盐胁迫耐性这样的技术。
专利文献1：日本特表2001-505410号
专利文献2：日本特表2001-519659号
专利文献3：日本特表2007-530063号
专利文献4：日本特开2005-130770号
专利文献5：日本特表2000-515020号
专利文献6：日本特表平9-503389号
专利文献7：日本特开2005-52114号
发明内容
发明所要解决的课题
因此，鉴于如上所述的事实，本发明的目的是探索具有大幅提高植物生物量的新的功能的基因，从而提供在能够使植物生物量大幅增产的同时，赋予植物体以盐胁迫耐性的技术。
用于解决课题的方法
为了实现上述目的，本发明者们进行了深入研究，结果发现，通过导入编码下述蛋白质的基因或改变其内在的该基因的表达控制区域，能够在大幅提高植物生物量的同时，赋予植物体以盐胁迫耐性这样的新见解，从而完成了本发明，所述蛋白质在分子内具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构，并具有特征的共有序列。
即，本发明所涉及的植物体，是导入了编码具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质的基因，或其内在的该基因的表达控制区域发生了改变的植物体，所述蛋白质从N末端一侧起依次具有包含序列号3所示氨基酸序列的共有序列和包含序列号2所示氨基酸序列的共有序列。
另外，本发明所涉及的使生物量增产并赋予植物体以盐胁迫耐性的方法，是导入编码具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质的基因，或改变其内在的该基因的表达控制区域的方法，所述蛋白质从N末端一侧起依次具有包含序列号3所示氨基酸序列的共有序列和包含序列号2所示氨基酸序列的共有序列。。
另外，本发明所涉及的植物体的制造方法，是包括以下工序的方法：准备转化植物的工序，在所述转化植物中，导入了编码具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质的基因，或其内在的该基因的表达控制区域发生了改变，所述蛋白质从N末端一侧起依次具有包含序列号3所示氨基酸序列的共有序列和包含序列号2所示氨基酸序列的共有序列；以及测定所述转化植物的后代植物的生物量和盐胁迫耐性，从而筛选出该生物量显著提高并显示盐胁迫耐性的系统的工序。
在本发明中，上述蛋白质优选在上述包含序列号3所示氨基酸序列的共有序列的N末端一侧还具有包含序列号1所示氨基酸序列的共有序列。
在本发明中，上述基因可以是选自AT1G59124、AT1G58807、AT1G59218、AT1G58848、AT1G58602、AT1G58410、AT1G58400、AT1G58390、AT1G59620、AT1G59780、AT1G50180、AT1G53350、AT5G43470、AT5G48620、AT5G35450和AT1G10920中的至少1种基因或与该基因在功能上等同的基因。
在本发明中，上述基因优选是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的基因，
(a)包含序列号5所示氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含在序列号5所示氨基酸序列中缺失、置换、添加或插入1个或多个氨基酸而得的氨基酸序列，并具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质，
(c)由与包含序列号4所示碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码，并具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质。
另外，在本发明中，上述在功能上等同的基因可列举编码来源于除拟南芥以外的生物的具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质的基因。作为除拟南芥以外的生物，可列举葡萄。
在本发明中，作为对象的植物可列举双子叶植物，例如十字花科植物，在十字花科植物的中可列举拟南芥、油菜籽。另一方面，在本发明中，作为对象的植物可列举单子叶植物，例如禾本科植物，在禾本科植物的中可列举稻、甘蔗。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2008-246233号的说明书和/或附图所记载的内容。
发明的效果
本发明所涉及的植物体与野生型相比，生物量显著提高，并被赋予了对盐胁迫的耐性。另外，本发明所涉及的使生物量增产并赋予植物体以盐胁迫耐性的方法，可以使作为对象的植物与野生型相比，生物量大幅增产，并且能够赋予该植物以盐胁迫耐性。并且，本发明所涉及的植物体的制造方法能够制造与野生型相比生物量大幅增加、且具有盐胁迫耐性的植物体。因此，通过应用本发明，例如可以通过提高以植物自身为生产物时的生产性来实现低成本化，并且在高盐浓度的环境下也能够育成植物。
附图说明
图1-1是显示对于由AT1G59124、AT1G58807、AT1G59218、AT1G58848、AT1G58602、AT1G58410、AT1G58400、AT1G58390、AT1G59620、AT1G59780、AT1G50180、AT1G53350、AT5G43470、AT5G48620、AT5G35450和AT1G10920所编码的氨基酸序列，使用CLUSTAL W(1.83)多重序列比对程序进行比对分析得到的结果的特性图。
图1-2是显示对于由AT1G59124、AT1G58807、AT1G59218、AT1G58848、AT1G58602、AT1G58410、AT1G58400、AT1G58390、AT1G59620、AT1G59780、AT1G50180、AT1G53350、AT5G43470、AT5G48620、AT5G35450和AT1G10920所编码的氨基酸序列，使用CLUSTAL W(1.83)多重序列比对程序进行比对分析得到的结果的特性图。
图1-3是显示对于由AT1G59124、AT1G58807、AT1G59218、AT1G58848、AT1G58602、AT1G58410、AT1G58400、AT1G58390、AT1G59620、AT1G59780、AT1G50180、AT1G53350、AT5G43470、AT5G48620、AT5G35450和AT1G10920所编码的氨基酸序列，使用CLUSTAL W(1.83)多重序列比对程序进行比对分析得到的结果的特性图。
图1-4是显示对于由AT1G59124、AT1G58807、AT1G59218、AT1G58848、AT1G58602、AT1G58410、AT1G58400、AT1G58390、AT1G59620、AT1G59780、AT1G50180、AT1G53350、AT5G43470、AT5G48620、AT5G35450和AT1G10920所编码的氨基酸序列，使用CLUSTAL W(1.83)多重序列比对程序进行比对分析得到的结果的特性图。
图1-5是显示对于由AT1G59124、AT1G58807、AT1G59218、AT1G58848、AT1G58602、AT1G58410、AT1G58400、AT1G58390、AT1G59620、AT1G59780、AT1G50180、AT1G53350、AT5G43470、AT5G48620、AT5G35450和AT1G10920所编码的氨基酸序列，使用CLUSTAL W(1.83)多重序列比对程序进行比对分析得到的结果的特性图。
图1-6是显示对于由AT1G59124、AT1G58807、AT1G59218、AT1G58848、AT1G58602、AT1G58410、AT1G58400、AT1G58390、AT1G59620、AT1G59780、AT1G50180、AT1G53350、AT5G43470、AT5G48620、AT5G35450和AT1G10920所编码的氨基酸序列，使用CLUSTAL W(1.83)多重序列比对程序进行比对分析得到的结果的特性图。
图1-7是显示对于由AT1G59124、AT1G58807、AT1G59218、AT1G58848、AT1G58602、AT1G58410、AT1G58400、AT1G58390、AT1G59620、AT1G59780、AT1G50180、AT1G53350、AT5G43470、AT5G48620、AT5G35450和AT1G10920所编码的氨基酸序列，使用CLUSTAL W(1.83)多重序列比对程序进行比对分析得到的结果的特性图。
图2是将野生型和导入了包含AT1G58602的ORF的片段的转化植物体的种子接种在平板上之后的照片。
图3是野生型和导入了包含AT1G58602的ORF的片段的转化植物体的地上部分的拍摄照片。
图4是显示对于野生型的植物体、导入了LRR-RLK蛋白质基因(AT1G69990)的转化植物体、导入了LRR-RLK蛋白质基因(AT5G39390)的转化植物体、导入了LRR蛋白质基因(AT3G05650)的转化植物体、导入了LRR蛋白质基因(AT2G33080)的转化植物体和导入了CC-NBS-LRR蛋白质基因(AT1G58602)的转化植物体分别测定地上部分的总生物量而得的结果的特性图。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明所涉及的植物体是在植物体内导入了编码下述蛋白质的基因的植物体，或其内在的该基因的表达控制区域发生了改变的植物体，所述蛋白质具有特征共有序列，并具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构(以下，简称为CC-NBS-LRR)，该植物体与野生型相比在生物量显著提高的同时，被赋予了盐胁迫耐性。通过将作为对象的外来基因导入植物体内，或改变其内在的基因的表达控制区域，从而可以使作为对象的基因的表达量比野生型中的表达量显著提高。作为本发明所涉及的植物体，可以是在植物的全部组织中表达上述CC-NBS-LRR基因的植物体，也可以是植物的至少一部分组织中表达上述CC-NBS-LRR基因的植物体。这里所称植物组织是包含叶、茎、种子、根和花等植物器官的含义。
另外，所谓表达控制区域是包含结合RNA聚合酶的启动子区域和结合其他转录因子的区域的含义。作为转录控制区域的改变，优选将内在的转录控制区域中的例如启动子区域置换成能够更高表达的启动子区域。
CC-NBS-LRR基因
在本发明中，CC-NBS-LRR基因编码CC-NBS-LRR蛋白质，该蛋白质从N末端一侧起依次具有包含序列号3所示氨基酸序列的共有序列和包含序列号2所示氨基酸序列的共有序列。此外，CC-NBS-LRR如参考文献(1)(The Plant Cell，Vol.15，809-834，April 2003)所记载的那样，具有核酸结合部位，并且被分类为植物中的抵抗性蛋白质(也称为R蛋白质)的一种。特别是具有上述共有序列的CC-NBS-LRR在上述参考文献中被分类为“CNL-D”，从N末端一侧起依次具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构这方面与其他CC-NBS-LRR相同，其特征在于卷曲螺旋结构与富亮氨酸重复结构之间的核酸结合性基序(motif)的一部分，被认为具有与其他CC-NBS-LRR不同的生物学功能。
作为该被分类为CNL-D的CC-NBS-LRR，如上述参考文献(1)的Figure 4A所公开的那样，可以列举AT1G59124、AT1G58807、AT1G59218、AT1G58848、AT1G58602、AT1G58410、AT1G58400、AT1G58390、AT1G59620、AT1G59780、AT1G50180、AT1G53350、AT5G43470、AT5G48620、AT5G35450和AT1G10920。对于这些被分类为CNL-D的CC-NBS-LRR，将使用CLUSTAL W(1.83)多重序列比对程序(可在国立遗传学研究所的DDBJ使用(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html))进行比对分析所得的结果示于图1(作为所用的氨基酸序列替换矩阵，使用默认值的BLOSUM矩阵)。
如图1所示，可判断这些被分类为CNL-D的CC-NBS-LRR从N末端一侧起依次具有高度保守的区域(3)和(2)。即，可以将该高度保守的区域(3)和(2)定义为包含序列号3所示氨基酸序列的共有序列和包含序列号2所示氨基酸序列的共有序列。换言之，包含序列号3所示氨基酸序列的共有序列和包含序列号2所示氨基酸序列的共有序列是上述CC-NBS-LRR的分类中的CNL-D的特征序列，是形成与其他组的明确的区别基准的序列。
另外，可判断被分类为CNL-D的CC-NBS-LRR如图1所示，除了具有区域(3)和(2)之外，还在区域(3)的N末端一侧具有高度保守的区域(1)。即，可以将该高度保守的区域(1)定义为包含序列号1所示氨基酸序列的共有序列。即，分类为CNL-D的CC-NBS-LRR可以定义为除了包含序列号3所示氨基酸序列的共有序列和包含序列号2所示氨基酸序列的共有序列之外，在上述包含序列号3所示氨基酸序列的共有序列的N末端一侧还具有包含序列号1所示氨基酸序列的共有序列。
其中，在序列号1所示氨基酸序列中，表记为Xaa的氨基酸残基是任意氨基酸，不限于任何氨基酸。但是，序列号1所示氨基酸序列中从N末端一侧起第3位的氨基酸残基优选是异亮氨酸(三字母符号：Ile，单字母符号：I，下同)、亮氨酸(Leu、L)或缬氨酸(Val、V)。序列号1所示氨基酸序列中从N末端一侧起第4位的氨基酸残基优选是苏氨酸(Thr、T)、丝氨酸(Ser、S)或丙氨酸(Ala、A)。序列号1所示氨基酸序列中从N末端一侧起第6位的氨基酸残基优选是甲硫氨酸(Met、M)或亮氨酸(Leu、L)。序列号1所示氨基酸序列中从N末端一侧起第9位的氨基酸残基优选是亮氨酸(Leu、L)或异亮氨酸(Ile、I)。序列号1所示氨基酸序列中从N末端一侧起第16位的氨基酸残基优选是赖氨酸(Lys、K)或精氨酸(Arg、R)。序列号1所示氨基酸序列中从N末端一侧起第18位的氨基酸残基优选是缬氨酸(Val、V)或异亮氨酸(Ile、I)。序列号1所示氨基酸序列中从N末端一侧起第20位的氨基酸残基优选是天冬酰胺(Asn、N)、天冬氨酸(Asp、D)或组氨酸(His、H)。序列号1所示氨基酸序列中从N末端一侧起第22位的氨基酸残基优选是谷氨酸(Glu、E)或天冬氨酸(Asp、D)。即，作为包含序列号1所示氨基酸序列的共有序列，更具体地说，优选是VS(I/L/V)(T/S/A)G(M/L)GG(L/I)GKTTLA(K/R)Q(V/I)F(N/D/H)H(E/D)。在该氨基酸序列中，括号内的多个氨基酸表示在该位置可取的氨基酸残基的变异。
其中，在序列号2所示氨基酸序列中，表记为Xaa的氨基酸残基是任意氨基酸，不限于任何氨基酸。但是，序列号2所示氨基酸序列中从N末端一侧起第2位的氨基酸残基优选是组氨酸(His、H)、精氨酸(Arg、R)或谷氨酰胺(Gln、Q)。序列号2所示氨基酸序列中从N末端一侧起第3位的氨基酸残基优选是亮氨酸(Leu、L)或甲硫氨酸(Met、M)。序列号2所示氨基酸序列中从N末端一侧起第6位的氨基酸残基优选是甲硫氨酸(Met、M)、异亮氨酸(Ile、I)或亮氨酸(Leu、L)。序列号2所示氨基酸序列中从N末端一侧起第7位的氨基酸残基优选是甲硫氨酸(Met、M)或缬氨酸(Val、V)。序列号2所示氨基酸序列中从N末端一侧起第10位的氨基酸残基优选是缬氨酸(Val、V)或异亮氨酸(Ile、I)。序列号2所示氨基酸序列中从N末端一侧起第12位的氨基酸残基优选是亮氨酸(Leu、L)或异亮氨酸(Ile、I)。即，作为包含序列号2所示氨基酸序列的共有序列，更具体地说，优选是C(H/R/Q)(L/M)HD(M/I/L)(M/V)RE(V/I)C(L/I)。在该氨基酸序列中，括号内的多个氨基酸表示在该位置可取的氨基酸残基的变异。
其中，在序列号3所示氨基酸序列中，表记为Xaa的氨基酸残基是任意氨基酸，不限于任何氨基酸。但是，序列号3所示氨基酸序列中从N末端一侧起第2位的氨基酸残基优选是异亮氨酸(Ile、I)或亮氨酸(Leu、L)。序列号3所示氨基酸序列中从N末端一侧起第6位的氨基酸残基优选是缬氨酸(Val、V)或丙氨酸(Ala、A)。序列号3所示氨基酸序列中从N末端一侧起第7位的氨基酸残基优选是精氨酸(Arg、R)或赖氨酸(Lys、K)。序列号3所示氨基酸序列中从N末端一侧起第10位的氨基酸残基优选是甲硫氨酸(Met、M)或亮氨酸(Leu、L)。序列号3所示氨基酸序列中从N末端一侧起第11位的氨基酸残基优选是缬氨酸(Val、V)或异亮氨酸(Ile、I)。即，作为包含序列号3所示氨基酸序列的共有序列，更具体地说，优选是Y(I/L)EEL(V/A)(R/K)RN(M/L)(V/I)。在该氨基酸序列中，括号内的多个氨基酸表示在该位置可取的氨基酸残基的变异。
在规定位置可取的氨基酸残基的变异是基于以下原因。正如在参考文献(2)(《マツキ一生化学》第3版第5章アミノ酸·ペプチド·タンパク質5.1アミノ酸，主编：市川厚，主译：福冈伸一，出版人：曾根良介，出版社：(株)化学同人、ISBN4-7598-0944-9)中也已记载的那样，人们已公知氨基酸可以按照具有同样性质(化学性质和/或物理大小)的侧链来分类。另外，还公知在保持蛋白质活性的状态下，被分类于规定组的氨基酸残基之间高频率地发生在分子进化上的替换。基于这种想法，参考文献(3)：Henikoff S.，Henikoff J.G.，Amino-acid substitution matrices from proteinblocks，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10915-10919(1992)中的Fig.2中提出了氨基酸残基的替换突变的得分矩阵(BLOSUM)，并被广泛使用。在参考文献(2)中，侧链的化学性质相似的氨基酸彼此的替换是基于给蛋白质整体带来的结构和/或功能变化较少这样的见解进行的。根据上述参考文献(2)和(3)，在多重比对中考虑的氨基酸的侧链的组可以以化学性质和/或物理大小等指标为基础来考虑。这可表示为在参考文献(3)所公开的得分矩阵(BLOSUM)中，具有得分为0以上的值的氨基酸的组，优选为具有1以上的值的氨基酸的组。作为代表性的组，可列举下述8个。至于其他细致的分组，只要是如图1中彼此值为0以上的氨基酸组即可，优选彼此值为1以上的氨基酸组，更优选彼此值为2以上的氨基酸组。
1)脂肪族疏水性氨基酸组(ILMV组)
该组是上述参考文献(1)所示的中性非极性氨基酸中具有脂肪属性的疏水性侧链的氨基酸的组，包括V(Val、缬氨酸)、L(Leu、亮氨酸)、I(Ile、异亮氨酸)和M(Met、甲硫氨酸)。参考文献(1)中被分类为中性非极性氨基酸的氨基酸中，FGACWP由于以下原因而不包含在该“脂肪族疏水性氨基酸组”中。G(Gly、甘氨酸)、A(Ala、丙氨酸)是因为由于大小为甲基以下而非极性效应弱的原因。C(Cys、半胱氨酸)是因为有时S-S键发挥重要作用、且有时具有与氧原子、氮原子形成氢键的特性的原因。F(Phe、苯丙氨酸)、W(Trp、色氨酸)是因为侧链具有特别大的分子量，且芳香族效应强的原因。P(Pro、脯氨酸)是因为亚氨基酸效应强、会固定多肽主链的角度的原因。
2)具有羟甲基的氨基酸组(ST组)
该组是中性极性氨基酸中的侧链具有羟甲基的氨基酸的组，包括S(Ser、丝氨酸)和T(Thr、苏氨酸)。存在于S和T侧链的羟基是糖的结合部位，因此很多情况下是使某些多肽(蛋白质)具有特定活性的重要部位。
3)酸性氨基酸(DE组)
该组是侧链具有酸性羧基的氨基酸的组，包括D(Asp、天冬氨酸)和E(Glu、谷氨酸)。
4)碱性氨基酸(KR组)
该组是碱性氨基酸的组，包括K(Lys、赖氨酸)和R(Arg、精氨酸)。该K和R具有在较宽的pH范围内带正电且显碱性的性质。另一方面，被分类为碱性氨基酸的H(His、组氨酸)在pH7时几乎不离子化，因此不将其分类至该类组。
5)亚甲基＝极性基团(DHN组)
该组全部具有α位碳原子上作为侧链结合了亚甲基、且该亚甲基前端具有极性基团这样的特征。具有作为非极性基团的亚甲基的物理大小极其相近的特征，包括N(Asn、天冬酰胺；极性基团为酰胺基)、D(Asp、天冬氨酸；极性基团为羧基)和H(His、组氨酸；极性基团为咪唑基)。
6)二亚甲基＝极性基团(EKQR组)
该组全部具有α位碳原子上作为侧链结合了二亚甲基以上的直链烃、且该直链烃前端具有极性基团这样的特征。具有作为非极性基团的二亚甲基的物理大小极其相近的特征。包括E(Glu、谷氨酸；极性基团为羧基)、K(Lys、赖氨酸；极性基团为氨基)、Q(Gln、谷氨酰胺；极性基团为酰胺基)和R(Arg、精氨酸；极性基团为亚氨基和氨基)。
7)芳香族(FYW组)
该组是侧链具有苯核的芳香族氨基酸的组，以芳香族特有的化学性质为特征。包括F(Phe、苯丙氨酸)、Y(Tyr、酪氨酸)和W(Trp、色氨酸)。
8)环状和极性(HY组)
该组是侧链具有环状结构同时具有极性的氨基酸的组，包括H(His、组氨酸；环状结构和极性基团均为咪唑基)、Y(Tyr、酪氨酸；环状结构为苯核，极性基团为羟基)。
如上，判定在序列号1～3所示的规定氨基酸序列中，表示为Xaa的氨基酸残基可以是任意氨基酸，表示为Xaa的氨基酸残基也可以在上述1)～8)的组内进行氨基酸替换。即，在本发明中，CC-NBS-LRR基因只要编码具有包含序列号3和2所示氨基酸序列的2个共有序列、优选为具有包含序列号1～3所示氨基酸序列的3个共有序列的蛋白质即可，可以是来源于任何植物的CC-NBS-LRR基因。
更具体地说，作为拟南芥中具有包括序列号1～3所示规定氨基酸序列的共有序列的CC-NBS-LRR的基因，可列举AT1G59124、AT1G58807、AT1G59218、AT1G58848、AT1G58602、AT1G58410、AT1G58400、AT1G58390、AT1G59620、AT1G59780、AT1G50180、AT1G53350、AT5G43470、AT5G48620、AT5G35450和AT1G10920，在本发明中，在植物体内导入选自这些基因群中的至少1种基因，或者改变其内在的该基因的表达控制区域。尤其在本发明中，在植物体内导入以AT1G59124、AT1G58807、AT1G59218、AT1G58848和AT1G58602特定的基因、更优选为以AT1G58602特定的基因，或者改变其内在的该基因的表达控制区域。
作为一例，将以AT1G58602特定的基因中的编码区的碱基序列示于序列号4，将由以AT1G58602特定的基因所编码的CC-NBS-LRR的氨基酸序列示于序列号5。
另外在本发明中，还可以在植物体内导入与上述列举的基因在功能上等同的基因。这里所谓在功能上等同的基因，是包括下述基因的含义，所述基因来源于例如除拟南芥以外的生物，且编码具有包括序列号3和2所示氨基酸序列的2个共有序列的CC-NBS-LRR。另外，所谓在功能上等同的基因，是编码具有CC-NBS-LRR、且与效应物直接或间接地相互作用的R蛋白质的基因。
作为上述除拟南芥以外的生物，可列举葡萄(Vitis vinifera)为例。更具体地说，作为葡萄的基因，可列举以登录号A7Q3G8特定的基因、以A5BY93特定的基因、以A7Q3G6特定的基因、以A5C0R9特定的基因和以A7Q3H1特定的基因。
以这些为代表的除拟南芥以外的植物中的、编码具有包含序列号3和2所示氨基酸序列的2个共有序列的CC-NBS-LRR的基因，可以基于上述列举的由来源于拟南芥的AT1G58602基因所编码的氨基酸序列，从GenBank等公知的数据库中容易地检索、鉴定出。
此外，在本发明中，作为CC-NBS-LRR基因，不限于包含以如上所述的序列号特定的碱基序列和氨基酸序列的CC-NBS-LRR基因。即，作为CC-NBS-LRR基因，还可以是包含在以如上所述的序列号特定的氨基酸序列中缺失、替换、添加或插入1个或多个氨基酸而得的氨基酸序列，并具有作为CC-NBS-LRR发挥功能的活性的基因。这里，作为多个氨基酸，例如为1～20个，优选为1～10个，更优选为1～7个，进而优选为1个～5个，特别优选为1个～3个。此外，对于氨基酸的缺失、替换或添加，可以通过用该技术领域公知的方法改变编码上述CC-NBS-LRR的基因的碱基序列来进行。为了在碱基序列中引入突变，可以通过Kunkel法或Gapped duplex法(缺口双链体法)等公知方法或依据这些公知方法的方法来进行，例如，使用利用了定点诱变法的突变引入用试剂盒(例如Mutant-K、Mutant-G(均为商品名，TAKARA Bio社制))等，或使用LAPCR in vitro Mutagenesis系列试剂盒(商品名，TAKARA Bio社制)引入突变。另外，作为突变引入方法，还可以是使用以EMS(甲磺酸乙酯)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、其他致癌性化合物为代表的化学诱变剂的方法，还可以是利用以X射线、α射线、β射线、γ射线、离子束为代表的放射线处理和/或紫外线处理的方法。
另外，作为CC-NBS-LRR基因，还可以是包含以如上所述的序列号特定的碱基序列和氨基酸序列的CC-NBS-LRR基因的同源基因。这里，所谓同源基因，一般是指由共同的祖先基因趋异进化而得的基因，其含义包括2种物种的同源基因(直系同源(ortholog))和由同一物种内的反复趋异进化产生的同源基因(并系同源(paralog))。换言之，上述“在功能上等同的基因”的含义包括直系同源、并系同源等的同源基因。但上述“在功能上等同的基因”还包括不由共同基因进化、而仅仅具有类似的功能的基因。
作为与包含以如上所述的序列号特定的碱基序列和氨基酸序列的CC-NBS-LRR基因类似的基因，可列举编码下述蛋白质的基因，所述蛋白质具有与这些氨基酸序列的相似性(Similarity)例如为70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、最优选为95％以上的氨基酸序列，且具有CC-NBS-LRR活性，所述CC-NBS-LRR具有包含序列号1所示氨基酸序列的共有序列。这里，相似性的值是指使用安装了BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)程序的计算机程序和存储了基因序列信息的数据库、以默认设定求得的值。
另外，对于与包含以如上所述的序列号特定的碱基序列和氨基酸序列的CC-NBS-LRR2C基因类似的基因，在其植物基因组信息不清楚的情况下，从对象植物提取基因组或者构建对象植物的cDNA文库，通过分离与包含以如上所述的序列号特定的碱基序列和氨基酸序列的CC-NBS-LRR基因的至少一部分在严格条件下杂交的基因组区域或cDNA来进行鉴定。这里，严格条件是指形成所谓特异性的杂交体、不形成非特异性的杂交体的条件。例如，可列举在45℃、6×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)下进行杂交、然后在50～65℃、0.2～1×SSC、0.1％SDS下进行洗涤，或者作为这样的条件，可列举在65～70℃、1×SSC下进行杂交、然后在65～70℃、0.3×SSC下进行洗涤。杂交可以按照J.Sambrook等人，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd Ed.(分子克隆实验指南第二版)，Cold SpringHarbor Laboratory(1989)所记载的方法等现有公知的方法来进行。
本发明所涉及的植物体通过在植物体内导入编码具有包含序列号3和2所示氨基酸序列的2个共有序列的CC-NBS-LRR的基因，或者改变其内在的该基因的表达控制区域，从而在生物量与野生型相比显著提高的同时，具有盐胁迫耐性。作为将该CC-NBS-LRR基因导入植物体内的方法，可列举导入表达载体的方法，该表达载体中，在能够在植物体内表达的启动子控制下配置有外源性的CC-NBS-LRR基因。作为改变其内在的该基因的表达控制区域的方法，可列举改变作为对象的植物体中的内源性CC-NBS-LRR基因的启动子的方法。
作为一例，优选将在能够在植物体内表达的启动子控制下配置有上述CC-NBS-LRR基因的表达载体导入对象植物中的方法。
表达载体
表达载体构建成包含能够在植物体内表达的启动子和上述CC-NBS-LRR基因那样。作为表达载体的母体的载体，可以使用现有公知的各种载体。例如，可以使用质粒、噬菌体或粘粒等，可以根据所导入的植物细胞和/或导入方法来适当选择。具体地说，可列举例如，pBR322、pBR325、pUC19、pUC119、pBluescript、pBluescriptSK、pBI系列的载体等。特别是在向植物体导入载体的导入法是使用农杆菌的方法时，优选使用pBI系列的双元载体。作为pBI系列的双元载体，具体地说，可列举例如，pBIG、pBIN19、pBI101、pBI121、pBI221等。
启动子只要是能够在植物体内表达CC-NBS-LRR基因的启动子即可，不特别限定，优选使用公知的启动子。作为所述启动子，可列举例如，花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、各种肌动蛋白基因启动子、各种遍在蛋白基因启动子、胭脂碱合成酶基因的启动子、烟草的PR1a基因启动子、番茄的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因启动子、Napin(油菜贮藏蛋白)基因启动子等。其中，更优选使用花椰菜花叶病毒35S启动子、肌动蛋白基因启动子或遍在蛋白基因启动子。如果使用上述各启动子，则能够使任意的基因在被导入植物细胞内时增强表达。
另外，作为启动子，还可以使用具有使目标基因在植物中部位特异性地表达的功能的启动子。作为这样的启动子，可以使用现有公知的任何启动子。通过使用这样的启动子，使上述CC-NBS-LRR基因部位特异性地表达，从而可以使表达的植物器官与野生型相比增大。
此外，表达载体中除了启动子和上述CC-NBS-LRR基因之外，还可以含有其他DNA片段。对该其他DNA片段不特别限定，可列举终止子、筛选标记、增强子、用于提高翻译效率的碱基序列等。另外，上述重组表达载体还可以具有T-DNA区域。T-DNA区域特别是在使用农杆菌将上述重组表达载体导入植物体时可以提高基因导入的效率。
转录终止子只要具有作为转录终止部位的功能即可，不特别限定，可以是公知的终止子。例如，具体来说，优选使用胭脂碱合成酶基因的转录终止区(Nos终止子)、花椰菜花叶病毒35S的转录终止区(CaMV35S终止子)等。其中更优选使用Nos终止子。在上述重组载体中，可以通过将转录终止子配置在适当的位置，从而在导入植物细胞之后防止发生合成过长的转录物、强启动子使质粒的拷贝数减少等现象。
作为转化体筛选标记，例如，可以使用抗药性基因。作为所述抗药性基因的具体例子，可列举例如，针对潮霉素、博来霉素、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素等的抗药性基因。由此，通过选择在含有上述抗生素的培养基中生长的植物体，可以容易地筛选出被转化的植物体。
作为用于提高翻译效率的碱基序列，可列举例如，来源于烟草花叶病毒的omega序列。通过使该omega序列配置在启动子的非翻译区(5’UTR)，可以提高上述融合基因的翻译效率。这样，上述重组表达载体可以含有适应目标的各种DNA片段。
对于重组表达载体的构建方法也不特别限定，只要在适当选择出的作为母体的载体中以规定顺序导入上述启动子、上述CC-NBS-LRR基因、转录抑制转换多核苷酸、以及根据需要的上述其他DNA片段即可。例如，将上述CC-NBS-LRR基因与启动子(以及根据需要的转录终止子等)连接来构建表达盒(expression cassette)，将其导入载体即可。在表达盒的构建中，例如，可以预先使各DNA片段的切割部位形成彼此互补的突出末端，然后用连接酶使其反应，从而规定该DNA片段的顺序。此外，在表达盒包含终止子的情况下，从上流开始依次为启动子、上述CC-NBS-LRR基因、终止子即可。另外，对于用于构建表达载体的试剂类、即限制性酶和/或连接酶等的种类也不特别限定，只要适当选择使用市售的试剂即可。
另外，对上述重组表达载体的增殖方法(生产方法)也不特别限定，可以使用现有公知的方法。一般以大肠杆菌为宿主使其在该大肠杆菌内增殖即可。这时，可以根据载体的种类来选择优选的大肠杆菌的种类。
转化
上述表达载体可通过一般的转化方法导入对象植物内。对将表达载体导入植物细胞的方法(转化方法)不特别限制，可以根据植物细胞而使用适当的现有公知的方法。具体地说，例如，可以使用利用农杆菌的方法、直接导入植物细胞的方法。作为利用农杆菌的方法，例如，可以使用Bechtold，E.，Ellis，J.和Pelletier，G.(1993)In Planta Agrobacterium-mediated genetransfer by infiltration of adult Arabidopsis plants.C.R.Acad.Sci.ParisSci.Vie，316，1194-1199.或Zyprian E，Kado Cl，Agrobacterium-mediatedplant transformation by novel mini-T vectors in conjunction with ahigh-copy vir region helper plasmid.Plant Molecular Biology，1990，15(2)，245-256.所记载的方法。
作为将表达载体直接导入植物细胞的方法，例如，可以使用微注射法、电穿孔法、聚乙二醇法、基因枪法、原生质体融合法、磷酸钙法等。
另外，如果采用将DNA直接导入植物细胞的方法，则只要是包含作为对象的基因的表达所需的转录单位、例如启动子、转录终止子和作为对象的基因的DNA就足够了，载体功能并不是必须的。而且，即使是不具有转录单位而仅含有作为对象的基因的蛋白质编码区的DNA也可以，只要是能够整合到宿主的转录单位中、表达作为对象的基因即可。
作为导入了上述表达载体、和/或不含表达载体而含有对象基因的表达盒的植物细胞，可列举例如，花、叶、根等植物器官中的各组织的细胞、愈伤组织、悬浮培养细胞等。这里，作为表达载体，既可以根据要生产的植物体的种类来构建适当载体，也可以预先构建通用的重组表达载体，将其导入植物细胞。
对作为导入表达载体的对象的植物、换言之即作为生物量增产对象的植物，不特别限定。即，通过导入上述CC-NBS-LRR基因，可以对于所有植物体期待生物量增产效果。作为对象的植物，可列举例如，双子叶植物、单子叶植物，例如，属于十字花科、禾本科、茄科、豆科、杨柳科等的植物(参考下述)，但并不限于这些植物。
十字花科：拟南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica rapa、Brassicanapus)、卷心菜(Brassica oleracea var.capitata)、油菜籽(Brassica rapa、Brassica napus)、油菜花(Brassica rapa、Brassica napus)、大白菜(Brassicarapa var.pekinensis)、青梗菜(Brassica rapa var.chinensis)、芜青(Brassicarapa var.rapa)、野泽菜(Brassica rapa var.hakabura)、日本芜青(Brassicarapa var.lancinifolia)、小松菜(Brassica rapa var.peruviridis)、小白菜(パクチヨイ，Brassica rapa var.chinensis)、萝卜(Brassica Raphanus sativus)、山葵(Wasabia japonica)等。
茄科：烟草(Nicotiana tabacum)、茄子(Solanum melongena)、马铃薯(Solaneum tuberosum)、番茄(Lycopersicon lycopersicum)、辣椒(Capsicumannuum)、矮牵牛(Petunia)等。
豆科：大豆(Glycine max)、豌豆(Pisum sativum)、蚕豆(Vicia faba)、多花紫藤(Wisteria floribunda)、花生(Arachis.hypogaea)、日本百脉根(Lotus corniculatus var.japonicus)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、赤小豆(Vigna angularis)、金合欢(Acacia)等。
菊科：菊(Chrysanthemum morifolium)、向日葵(Helianthus annuus)等。
棕榈科：油棕(Elaeis guineensis、Elaeis oleifera)、椰子(Cocos nucifera)、海枣(Phoenix dactylifera)、巴西棕榈(Copernicia)
漆树科：野漆树(Rhus succedanea)、腰果(Anacardium occidentale)、漆树(Toxicodendron vernicifluum)、芒果(Mangifera indica)、阿月浑子(Pistacia vera)
葫芦科：南瓜(Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbitapepo)、黄瓜(Cucumis sativus)、王瓜(Trichosanthes cucumeroides)、葫芦(Lagenaria siceraria var.gourda)
蔷薇科：扁桃(Amygdalus communis)、玫瑰(Rosa)、草莓(Fragaria)、樱(Prunus)、苹果(Malus pumila var.domestica)等。
石竹科：康乃馨(Dianthus caryophyllus)等。
杨柳科：杨(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula)
禾本科：玉米(Zea mays)、稻(Oryza sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、小麦(Triticum aestivum)、毛竹属(Phyllostachys)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、象草(Pennisetum pupureum)、沙生蔗茅(Erianthus ravenae)、条芒(芒)(Miscanthus virgatum)、高粱属(Sorghum)、黍属(Panicum)等。
百合科：郁金香属(Tulipa)、百合属(Lilium)等。
其中，优选以甘蔗和/或玉米、油菜籽、向日葵等能够作为生物燃料的原料的能量作物为对象。这是因为，通过使能量作物的生物量增产，可以实现生物乙醇、生物柴油、生物甲醇、生物DME、生物GTL(BTL)和生物丁醇等生物燃料的低成本化。
另外，如上所述，能够在本发明中使用的CC-NBS-LRR基因可以从各种植物中分离出来使用，也可以根据作为生物量增产对象的植物的种类来适当选择使用。即，在作为生物量增产对象的植物是单子叶植物的情况下，优选导入从单子叶植物中分离出CC-NBS-LRR基因。
此外，在本发明中，即使作为生物量增产对象的植物是单子叶植物，也可以导入来源于双子叶植物的CC-NBS-LRR基因。即，例如，来源于拟南芥的CC-NBS-LRR基因(序列号4)不仅可以导入双子叶植物中表达，还可以广泛地导入被分类为单子叶植物的植物中表达。
其他工序、其他方法
在上述转化处理之后，可以按照现有公知的方法进行从植物体中筛选适当的转化体的筛选工序。对筛选的方法不特别限制，例如，可以以潮霉素抗性等抗药性为基准进行筛选，也可以在培育出转化体之后，测定植物体本身或任意器官和/或组织的重量并与野生型进行比较，从而筛选出显著增产的植物体。
另外，可以按照常规方法由经转化处理所得的转化植物获得后代植物。以其生物量为基准来筛选出保持导入了上述CC-NBS-LRR基因的性状或其内在的该CC-NBS-LRR基因的表达控制区域发生了改变的性状的后代植物，从而根据具有上述性状来制成生物量增产了的稳定植物系统。此外，还可以从转化植物和/或其后代获得植物细胞和/或种子、果实、植株、愈伤组织、块茎、扦插枝、块等繁殖材料，以它们为基础根据具有上述性状来大量生产生物量增产了的稳定植物系统。
此外，所谓本发明中的植物体，包括长成的植物个体、植物细胞、植物组织、愈伤组织、种子的至少任一者。即，在本发明中，只要是最终能生长成植物个体的状态即全部可看作是植物体。另外，上述植物细胞包括各种形态的植物细胞。作为所述植物细胞，包含例如，悬浮培养细胞、原生质体、叶的切片等。通过使这些植物细胞增殖、分化可以获得植物体。此外，由植物细胞再生植物体可以根据植物细胞的种类使用现有公知的方法来进行。
如以上所说明的那样，根据本发明，通过在植物体内导入具有上述特定的共有序列的CC-NBS-LRR基因，或改变其内在的该CC-NBS-LRR基因的表达控制区域，可以提供与野生型的植物体相比，每个个体的生物量显著增产、并具有盐胁迫耐性的植物体。这里，所谓生物量显著增产，意味着与野生型相比每一个体的总重量在统计学上显著增大。这时，即使是植物体的一部分组织特异性地增大、其他组织与野生型同等，只要植物体整体的总重量增大，就判断为生物量增产。另外，所谓盐胁迫耐性，是指能够生长的盐浓度的上限值与野生型相比显著变大。换言之，所谓盐胁迫耐性，是指即使土壤和/或培养基等生长环境所含的盐浓度是野生型植物会生长不良或枯死的程度的高浓度，也不会发生生长不良和/或枯死。具体地说，对于导入了具有上述特定的共有序列的CC-NBS-LRR的基因、或其内在的该CC-NBS-LRR基因的表达控制区域发生了改变植物体，显示在盐浓度为300mM、优选为250mM、更优选为200mM、最优选为150mM的培养基中能够生长这样的盐胁迫耐性。
根据本发明，由于植物体的生物量增产，因而在以植物体整体为生产目的的情况和以植物体的一部分组织(例如种子等)和/或其含有成分为生产目的的情况的任一情况下都能够提高生产性。例如，在以植物种子所含的油脂为生产目的的情况下，能够大幅提高每单位栽培面积可回收的油脂量。这里作为油脂，不特别限制，例如，可例示大豆油、胡麻油、橄榄油、椰子油、米糠油、棉籽油、向日葵油、玉米油、红花油和菜籽油等来源于植物的油脂。另外，所制造的油脂可在家庭用途和/或工业用途中广泛利用，还可以作为生物柴油燃料的原料使用。即，根据本发明，通过利用导入了上述CC-NBS-LRR基因、或其内在的该CC-NBS-LRR基因的表达控制区域发生了改变的植物体，能够以低成本制造上述家庭用途或工业用途的油脂、生物柴油燃料等。
而且，根据本发明，因为植物体的盐胁迫耐性提高，所以能够在野生型的植物体不能够生长的高盐浓度土壤中生长。作为高盐浓度土壤，可列举沿海地区的土壤。由此，可以在到目前为止判断为不能栽培的土壤中进行栽培，与上述生物量的增产效果相应地可以实现植物体的高生产。另外，即使在植物种子所含的油脂为生产目的的情况下，也可以利用高盐浓度土壤进行高生产，并且以低成本制造上述家庭用途或工业用途的油脂和/或生物柴油燃料等。
实施例
以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术范围不限于这些实施例。
[实施例1]
1.材料和方法
1-1.实验材料
实验材料使用拟南芥突变体(激活标签T-DNA系统：Weigel T-DNS系统、计20072系统)的种子。此外，种子自Nottingham Arabidopsis StockCentre(NASC)购入。关于作为实验材料使用的种子，可以参考Weigel，D.等人，Plant Physiol.122，1003-1013(2000)。
1-2.方法
1-2-1.耐盐性突变体的筛选
将Weigel T-DNA系统的种子无菌接种在含NaCl 125mM或150mM的改良MS琼脂(1％)培养基[B5培养基的维生素、蔗糖10g/l、琼脂(细菌培养基用；和光纯药工业社制)8g/L]中，在22℃、30～100μmol/m2/sec的照明下(16小时光周期/8小时暗周期的循环)培养。在接种后2～4周之后，筛选出耐盐性突变体候选体。其中，MS培养基参照Murashige，T.等人，(1962)Physiol.Plant.15，473-497。另外，关于B5培养基参照Gamborg，O.L.等人，(1968)Experimental Cell Research 50，151-158。
1-2-2.DNA制备
通过TAIL-PCR法确定筛选出的耐盐性拟南芥系统的基因组中的T-DNA插入部位。首先，自栽培出的拟南芥采摘嫩叶，在液氮冻结下粉碎。使用QlAGEN社制DNA制备试剂盒(DNeasy Plant Mini Kit)按照试剂盒附带的标准方案制备DNA。
1-2-3.TAIL-PCR法和T-DNA插入部位的推定
在Weigel T-DNA系统中使用的激活标签用载体(pSKI015：GenBank登录号AF187951)的左边界T-DNA序列(T-DNA left border)附近设定3种特异性引物TL1、TL2和TL3，使用随机引物P1，在以下PCR反应液和反应条件下进行TAIL-PCR(岛本功、佐佐木卓治主编，新版，植物のPCR実験プロトコ一ル(植物的PCR实验方案)，2000，83-89pp，秀润社，东京；Genomics 25，674-681，1995；Plant J.，8，457-463，1995)，扩增出与T-DNA邻近的基因组DNA。
引物TL1、TL2、TL3和P1的具体序列如下。
TL1：5’-TGC TTT CGC CAT TAA ATA GCG ACG G-3’(序列号6)
TL2：5’-CGC TGC GGA CAT CTA CAT TTT TG-3’(序列号7)
TL3：5’-TCC CGG ACA TGA AGC CAT TTA C-3’(序列号8)
P1：5’-NGT CGA SWG ANA WGA A-3’(序列号9)
此外，在序列号9中，n表示a、g、c或t(存在位置：1和11)，另外s表示g或c(存在位置：7)，另外w表示a或t(存在位置：8和13)。
第1次PCR反应液组成和反应条件分别示于表1和表2。
表1：
模板(基因组DNA) ：10ng
10×PCR缓冲液(TAKARA Bio社制)：2μl
2.5mM dNTPs(TAKARA Bio社制) ：1.6μl
第1个特异性引物(TL1：序列号6)：0.5pmol
随机引物P1(序列号9) ：100pmol
TaKaRa Ex Taq(TAKARA Bio社制)：1.0单位
总容量 20μl
表2：
#1：94℃(30秒)/95℃(30秒)
#2：将94℃(30秒)/65℃(30秒)/72℃(1分钟)进行5个循环
#3：将94℃(30秒)/25℃(1分钟)→经3分钟至72℃/72℃(3分钟)进行1个循环
#4：将94℃(15秒)/65℃(30秒)/72℃(1分钟)
94℃(15秒)/68℃(30秒)/72℃(1分钟)
94℃(15秒)/44℃(30秒)/72℃(1分钟)进行15个循环
#5：72℃(3分钟)
第2次PCR反应液组成和反应条件分别示于表3和表4。
表3：
模板(第1次PCR产物50倍稀释) ：1μl
10×PCR缓冲液(TAKARA Bio社制)：2μl
2.5mM dNTPs(TAKARA Bio社制) ：1.5μl
第2个特异性引物(TL2：序列号7)：5pmol
随机引物P1(序列号9) ：100pmol
TaKaRa Ex Taq(TAKARA Bio社制)：0.8单位
总容量 20μl
表4：
#6：将94℃(15秒)/64℃(30秒)/72℃(1分钟)
94℃(15秒)/64℃(30秒)/72℃(1分钟)
94℃(15秒)/44℃(30秒)/72℃(1分钟)进行12个循环
#5：72℃(5分)
第3次PCR反应液组成和反应条件分别示于表5和表6。
表5：
模板(第2次PCR产物50倍稀释) ：1μl
10×PCR缓冲液(TAKARA Bio社制)：5μl
2.5mM dNTPs(TAKARA Bio社制) ：0.5μl
第3个特异性引物(TL3：序列号8)：10pmol
随机引物P1(序列号9) ：100pmol
TaKaRa Ex Taq(TAKARA Bio社制)：1.5单位
总容量 50μl
表6：
#7：将94℃(30秒)/44℃(30秒)/72℃(1分钟)进行20个循环
#5：72℃(3分钟)
接着，将第2次和第3次的反应产物用琼脂糖凝胶进行电泳，然后确认有无扩增以及反应产物的特异性。另外，第3次的扩增产物使用特异性引物TL3直接以BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit Ver.3.1(Applied Biosystem社制)进行测序反应，通过ABI PRISM 3100GeneticAnalyzer(Applied Biosystem社制)确定碱基序列。
其结果确定了5种碱基序列。即，得到了538bp的序列信息、311bp的序列信息、498bp的序列信息、633bp的序列信息和448bp的序列信息。将得到的序列信息依次示于序列号10～14。
使用得到的这些序列信息，通过The Arabidopsis InformationResource(TAIR：http://www.arabidopsis.org/)的BLAST进行检索，结果判明了T-DNA插入部位分别依次为拟南芥1号染色体的基因[AGI(TheArabidopsis Genome Initiative gene code)代码：At1g69990]与基因[AGI(The Arabidopsis Genome Initiative gene code)代码：At1g70000]之间、拟南芥5号染色体的基因[AGI(The Arabidopsis Genome Initiative gene code)代码：At5g39400]、拟南芥3号染色体的基因[AGI(The ArabidopsisGenome Initiative gene code)代码：At3g05630]、拟南芥2号染色体的基因[AGI(The Arabidopsis Genome Initiative gene code)代码：At2g33110]和拟南芥1号染色体的基因[AGI(The Arabidopsis Genome Initiative gene code)代码：At1g58520]。
1-2-4.被活化的基因的预测
由存在于通过1-2-3.判明的各个T-DNA插入部位(At1g69990与At1g70000之间、At5g39400、At3g05630、At2g33110以及At1g58520)附近10Kb以内的推定开放阅读框(Open reading frame，ORF)基因的序列，来预测被激活的基因。
1-2-5.导入了所预测的基因的突变体的制作
为了扩增包括在1-2-4.中预测被激活(活化)的LRR-RLK(富亮氨酸重复类受体样蛋白激酶，leucine-rich repeat receptor-like protein kinase)基因(AT1G69990)、LRR-RLK(leucine-rich repeat receptor-like protein kinase)基因(AT5G39390)、LRR(富亮氨酸重复，leucine-rich repeat)蛋白质基因(AT3G05650)和LRR(leucine-rich repeat)蛋白质基因(AT2G33080)的ORF区域的片段，基于TAIR(http://www.arabidopsis.org/home.html)所公开的序列信息分别设计、合成引物对(表7)。此外，要设计成在这些引物对中添加导入表达载体时所需的限制性酶位点那样(表7)。
表7：
另外，为了扩增包含CC(卷曲螺旋，coiled-coli)-NBS(核算结合位点，nucleotide binding site)-LRR(富亮氨酸重复，leucine-rich repeat)蛋白质基因(AT1G58602)的ORF区域的片段，基于TAIR(http://www.arabidopsis.org/home.html)所公开的序列信息分别设计、合成三组引物(表8)。此外，设计成在这三组引物内的正向引物1和反向引物3引物中添加导入表达载体时所需的限制性酶位点那样(表8)。
表8：
按照1-2-2.所述的方法，由野生型拟南芥Col-0生态型制备模板DNA。作为酶，使用Takara Ex Taq(TAKARA Bio社制)、Platinum Pfx DNAPolymerase(Invitrogen社制)或Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(NEW ENGLAND BioLabs：NEB社制)；作为引物，使用表7所示的引物对。PCR的反应液组成和反应条件按照各酶所附带的方案。另外，对于CC-NBS-LRR蛋白质基因(AT1G58602)，使用表8所示的三组引物，并使用Platinum Pfx DNA Polymerase(Invitrogen社制)作为酶来进行PCR，从而获得3种PCR扩增产物。将各PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶(TAE缓冲液)进行电泳，用溴化乙锭将片段染色。用手术刀切下包含目的片段的凝胶，使用GFX PCR DNA and GEL Band Purification Kit(Amersham社制)溶出、纯化目的DNA片段。以得到的3种DNA片段为模板，使用正向引物1和反向引物3作为引物进行重叠PCR。
将各PCR扩增产物与上述同样地用琼脂糖凝胶进行电泳、然后切下纯化。对在得到的DNA片段使用A-Addition Kit(QIAGEN社制)添加腺嘌呤。使用TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen社制)将添加了腺嘌呤之后的扩增DNA与TA-Cloning用pCR2.1载体连接，然后转化到试剂盒所附带的感受态细胞(E.coli TOP 10)中。转化后，用添加了50μl/ml的卡那霉素的LB培养基培养，从而筛选转化体。将出现的菌落用添加了50μl/ml的卡那霉素的LB培养基进行液体培养，使用QIAGEN社制Plasmid Mini Kit由得到的菌体制备质粒DNA。
对得到的克隆有包含LRR-RLK基因(AT1G69990)的ORF的片段的载体、克隆有包含LRR-RLK基因(AT5G39390)的ORF的片段的载体、克隆有包含LRR蛋白质基因(AT3G05650)的ORF的片段的载体、克隆有包含LRR蛋白质基因(AT2G33080)的ORF的片段的载体和克隆有包含CC-NBS-LRR蛋白质基因(AT1G58602)的ORF的片段的载体分别进行碱基序列确定和序列分析。
1-2-6.植物表达用载体的制作
在包含来源于烟草花叶病毒的omega序列的植物表达用载体pBI121中插入包含LRR-RLK基因(AT1G69990)、LRR-RLK基因(AT5G39390)、LRR蛋白质基因(AT3G05650)、LRR蛋白质基因(AT2G33080)、CC-NBS-LRR蛋白质基因(AT1G58602)的ORF的片段，从而制成构建体。
首先，将在1-2-5.中制作的克隆有包含LRR-RLK基因(AT1G69990)的ORF的片段的pCR2.1载体用限制性酶SalI和BsrG I处理。
接着，同样地将包含omega序列的pBI121用限制性酶SalI和BsrG I处理。对于这些限制性酶消化产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，使用GFXPCR DNA and GEL Band Purification Kit(Amersham)，分别从凝胶中分离、纯化约1850bp的包含LRR-RLK基因(AT1G69990)的ORF的片段和包含omega序列的pBI121。
为了以包含omega序列的pBI121的片段为载体导入包含LRR-RLK基因(AT1G69990)的ORF的片段，以载体：插入片段比为1∶10那样进行混合，使用等量的TaKaRa Ligation Kit ver.2(TAKARA Bio社制)在16℃进行过夜连接反应。
将反应液的总量添加到100μl的感受态细胞(E.coli strain DH5α，TOYOBO)中，按照试剂盒所附带的方案进行转化。涂布在含50μg/ml的卡那霉素的LB琼脂培养基上进行过夜培养，将出现的菌落用添加有50μg/ml的卡那霉素的LB培养基进行液体培养，使用Plasmid Mini Kit(QIAGEN社制)由得到的菌体制备质粒DNA。
对得到的亚克隆有包含LRR-RLK基因(AT1G69990)的ORF的片段的表达载体进行碱基序列确定和序列分析。
此外，对于LRR-RLK基因(AT5G39390)和LRR蛋白质基因(AT2G33080)，除了使用了表7所记载的引物以外，按照上述方法插入到表达载体中，进行碱基序列确定和序列分析。对于LRR蛋白质基因(AT3G05650)，在克隆到TA-Cloning用pCR2.1载体中之后，用限制性酶EcoR I处理，然后使用DNA Blunting Kit(TAKARA Bio社制)进行平端化，再进行酚-氯仿处理，然后用限制性酶BsrG I处理。包含omega序列的pBI121在用限制性酶Sal I处理之后，使用DNA Blunting Kit(TAKARABio社制)进行平端化，再进行酚-氯仿处理，然后用限制性酶BsrG I处理。按照上述方法插入到表达载体中，进行碱基序列确定和序列分析。对于CC-NBS-LRR蛋白质基因(AT1G58602)，在用限制性酶Not I处理之后，使用DNA Blunting Kit(TAKARA Bio社制)进行平端化，再进行酚-氯仿处理，然后用限制性酶Sal I处理。同样地将包含omega序列的pBI121用限制性酶BsrG I处理之后，使用DNA Blunting Kit(TAKARA Bio社制)进行平端化，再进行酚-氯仿处理，然后用限制性酶Sal I处理。按照上述方法插入到表达载体中，进行碱基序列确定和序列分析。
1-2-7.使用农杆菌法向拟南芥进行基因导入
通过电穿孔法(Plant Molecular Biology Mannal，Second Edition，B.G.Stanton A.S.Robbert，Kluwer Acdemic Publishers 1994)将1-2-6.所制作的各植物表达用载体导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C 1株中。接着通过Clough等所记载的浸润法(Plant J.16，735-743，1998)将导入有植物表达用载体的根癌农杆菌导入野生型拟南芥生态型Col-0中。
用含卡那霉素的培养基筛选转化体，通过自花传粉来制作T2代植物。
1-2-8.转化体的表型的确认
耐盐性试验：
将1-2-7所制作的各个种子、以及作为比较对象的非重组野生型拟南芥的种子无菌接种到含150mM NaCl的MS琼脂培养基中。将它们在22℃、16小时光周期、8小时暗周期、光强度约30～45μE/cm2的条件下培养10天，进行耐盐性试验。
生物量测定：
将1-2-7所制作的各T2种子无菌接种至包含50mg/L卡那霉素和0.5％蔗糖的MS琼脂培养基中，2周后移栽至加入有蛭石混合土的直径50mm的盆中。作为比较对象，移栽无菌接种至含0.5％蔗糖的MS琼脂培养基中所得的非重组拟南芥。将它们在23℃、8小时光周期、16小时暗周期(短日条件)、光强度约160μE/cm2的条件下栽培，在移栽后合计栽培6周。栽培之后，将地上部分的植物体装入纸袋，在22℃、湿度60％的条件下干燥2周，然后用电子天平秤量总生物量。
2.结果
作为上述1-2-8.的耐盐性试验结果，野生型和导入了包含CC-NBS-LRR蛋白质基因(AT1G58602)的ORF的片段的转化植物体的平板的拍摄照片示于图2。由图2可明确：导入了包含CC-NBS-LRR蛋白质基因(AT1G58602)的ORF的片段的转化植物体在高盐浓度培养基中发芽、生长，与野生型相比耐盐性提高。
另外，作为上述1-2-8.的生物量测定的结果，将野生型和导入了包含CC-NBS-LRR蛋白质基因(AT1G58602)的ORF的片段的转化植物体的地上部分的拍摄照片示于图3。另外，对于野生型的植物体、导入了LRR-RLK蛋白质基因(AT1G69990)的转化植物体、导入了LRR-RLK蛋白质基因(AT5G39390)的转化植物体、导入了LRR蛋白质基因(AT3G05650)的转化植物体、导入了LRR蛋白质基因(AT2G33080)的转化植物体和导入了CC-NBS-LRR蛋白质基因(AT1G58602)的转化植物体，分别将地上部分的总生物量的测定结果示于图4。
由图3和图4可明确，对于导入了包含CC-NBS-LRR蛋白质基因(AT1G58602)的ORF的片段的转化植物体，其地上部分的总生物量与野生型相比大幅(约1.5倍)提高。另一方面，对于导入了LRR-RLK基因(AT1G69990)、LRR-RLK基因(AT5G39390)、LRR蛋白质基因(AT3G05650)或LRR蛋白质基因(AT2G33080)的转化植物体，其生物量与野生型的植物体基本同等。
由以上结果可明确，导入了AT1G58602基因的植物体在显示盐胁迫耐性的同时，生物量大幅提高。
本说明书所引用的所有出版物、专利和专利申请均直接作为参考引入本说明书中。
Claims (27)
1.一种植物体，其中，导入了编码具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质的基因，或其内在的该基因的表达控制区域发生了改变，所述蛋白质从N末端一侧起依次具有包含序列号3所示氨基酸序列的共有序列和包含序列号2所示氨基酸序列的共有序列。
2.根据权利要求1所述的植物体，其特征在于，上述蛋白质在上述包含序列号3所示氨基酸序列的共有序列的N末端一侧还具有包含序列号1所示氨基酸序列的共有序列。
3.根据权利要求1所述的植物体，其特征在于，上述基因是选自AT1G59124、AT1G58807、AT1G59218、AT1G58848、AT1G58602、AT1G58410、AT1G58400、AT1G58390、AT1G59620、AT1G59780、AT1G50180、AT1G53350、AT5G43470、AT5G48620、AT5G35450和AT1G10920中的至少1种基因或与该基因在功能上等同的基因。
4.根据权利要求1所述的植物体，其特征在于，上述基因编码以下(a)～(c)的任一蛋白质，
(a)包含序列号5所示氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含在序列号5所示氨基酸序列中缺失、置换、添加或插入1个或多个氨基酸而得的氨基酸序列，并具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质，
(c)由与包含序列号4所示碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码，并具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质。
5.根据权利要求3所述的植物体，其特征在于，上述在功能上等同的基因是编码来源于除拟南芥以外的生物的具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质的基因。
6.根据权利要求5所述的植物体，其特征在于，上述除拟南芥以外的生物是葡萄。
7.根据权利要求1～6的任一项所述的植物体，其特征在于，是双子叶植物。
8.根据权利要求1～6的任一项所述的植物体，其特征在于，是十字花科植物。
9.根据权利要求1～6的任一项所述的植物体，其特征在于，是拟南芥。
10.使生物量增产并赋予植物体以盐胁迫耐性的方法，其中，导入编码具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质的基因，或改变其内在的该基因的表达控制区域，所述蛋白质从N末端一侧起依次具有包含序列号3所示氨基酸序列的共有序列和包含序列号2所示氨基酸序列的共有序列。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，上述蛋白质在上述包含序列号3所示氨基酸序列的共有序列的N末端一侧还具有包含序列号1所示氨基酸序列的共有序列。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，上述基因是选自AT1G59124、AT1G58807、AT1G59218、AT1G58848、AT1G58602、AT1G58410、AT1G58400、AT1G58390、AT1G59620、AT1G59780、AT1G50180、AT1G53350、AT5G43470、AT5G48620、AT5G35450和AT1G10920中的至少1种基因或与该基因在功能上等同的基因。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，上述基因编码以下(a)～(c)的任一蛋白质，
(a)包含序列号5所示氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含在序列号5所示氨基酸序列中缺失、置换、添加或插入1个或多个氨基酸而得的氨基酸序列，并具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质，
(c)由与包含序列号4所示碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码，并具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，上述在功能上等同的基因是编码来源于除拟南芥以外的生物的具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质的基因。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，上述除拟南芥以外的生物是葡萄。
16.根据权利要求10～15的任一项所述的方法，其特征在于，生物量是双子叶植物的生物量。
17.根据权利要求10～15的任一项所述的方法，其特征在于，生物量是十字花科植物的生物量。
18.根据权利要求10～15的任一项所述的方法，其特征在于，生物量是拟南芥的生物量。
19.植物体的制造方法，包括以下工序：
准备转化植物的工序，在所述转化植物中，导入了编码具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质的基因，或其内在的该基因的表达控制区域发生了改变，所述蛋白质从N末端一侧起依次具有包含序列号3所示氨基酸序列的共有序列和包含序列号2所示氨基酸序列的共有序列；以及
测定所述转化植物的后代植物的生物量和盐胁迫耐性，从而筛选出该生物量显著提高并显示盐胁迫耐性的系统的工序。
20.根据权利要求19所述的制造方法，其特征在于，上述蛋白质在上述包含序列号3所示氨基酸序列的共有序列的N末端一侧还具有包含序列号1所示氨基酸序列的共有序列。
21.根据权利要求19所述的制造方法，其特征在于，上述基因是选自AT1G59124、AT1G58807、AT1G59218、AT1G58848、AT1G58602、AT1G58410、AT1G58400、AT1G58390、AT1G59620、AT1G59780、AT1G50180、AT1G53350、AT5G43470、AT5G48620、AT5G35450和AT1G10920中的至少1种基因或与该基因在功能上等同的基因。
22.根据权利要求19所述的制造方法，其特征在于，上述基因编码以下(a)～(c)的任一蛋白质，
(a)包含序列号5所示氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含在序列号5所示氨基酸序列中缺失、置换、添加或插入1个或多个氨基酸而得的氨基酸序列，并具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质，
(c)由与包含序列号4所示碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码，并具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质。
23.根据权利要求21所述的制造方法，其特征在于，上述在功能上等同的基因是编码来源于除拟南芥以外的生物的具有卷曲螺旋结构、核酸结合部位和富亮氨酸重复结构的蛋白质的基因。
24.根据权利要求23所述的制造方法，其特征在于，上述除拟南芥以外的生物是葡萄。
25.根据权利要求19～24的任一项所述的制造方法，其特征在于，上述植物体是双子叶植物。
26.根据权利要求19～24的任一项所述的制造方法，其特征在于，上述植物体是十字花科植物。
27.根据权利要求19～24的任一项所述的制造方法，其特征在于，上述植物体是拟南芥。
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