BRPI0919120B1 - Métodos para aumentar a produção de biomassa e conferir resistência ao estresse salino a uma planta e de produção de planta - Google Patents

Description

(54) Título: MÉTODOS PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE BIOMASSA E CONFERIR RESISTÊNCIA AO ESTRESSE SALINO A UMA PLANTA E DE PRODUÇÃO DE PLANTA (51) Int.CI.: C12N 15/29; A01H 1/00; A01H 5/00 (30) Prioridade Unionista: 25/09/2008 JP 2008-246233 (73) Titular(es): TOYOTA JIDOSHA KABUSHIKI KAISHA (72) Inventor(es): SATOSHI KONDO; NORIHIRO MITSUKAWA; ETSUKO HATTORI; CHIKARA OHTO; KENICHI OGAWA (85) Data do Início da Fase Nacional: 25/03/2011

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE BIOMASSA E CONFERIR RESISTÊNCIA AO ESTRESSE SALINO A UMA PLANTA E DE PRODUÇÃO DE PLANTA.

Campo Técnico

A presente invenção refere-se a uma planta na qual um determinado gene foi introduzido ou na qual uma região de controle de expressão do gene que é apresentada de forma endógena foi alterada, um método para aumentar a produção de biomassa e conferir resistência ao estresse salino a uma planta, através da introdução de um determinado gene na mesma ou alteração de uma região de controle de expressão do gene que é apresentada de forma endógena na mesma, e um método para produzir uma planta com uma produção aumentada de biomassa, à qual foi conferida resistência ao estresse ambiental.

Antecedentes da técnica

O termo biomassa refere-se, geralmente, à quantidade total de organismos que habitam ou existem em uma determinada área. Quando este termo é usado com relação a plantas, em particular, ele refere-se ao peso a seco por unidade de área. As unidades de biomassa são quantificadas em termos de massa ou energia. A expressão biomassa é sinônimo de a quantidade de matéria viva ou a massa de um organismo. No caso de biomassa de planta, o termo standing crop é ocasionalmente usado para biomassa. Como a biomassa de planta é gerada pela fixação de dióxido de carbono atmosférico com o uso de energia solar, ela pode ser considerada como a chamada energia neutra de carbono. Consequentemente, um au25 mento da biomassa de plantas é eficaz para a preservação ambiental global, para a prevenção do aquecimento global, e mitigação de emissões de gases estufa. Desta forma, as tecnologias para aumentar a produção de biomassa de planta têm sido significativas industrialmente.

As plantas são cultivadas com o propósito de usar alguns de seus tecidos (por exemplo, sementes, raízes, folhas, ou hastes) ou com o propósito de produzir vários materiais, tais como gorduras e óleos. Exemplos de gorduras e óleos produzidos a partir de plantas que são conhecidos até o

Petição 870180014925, de 23/02/2018, pág. 6/13

2/41 momento incluem óleo de soja, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de coco, óleo de arroz, óleo de caroço de algodão, óleo de girassol, óleo de milho, óleo de açafrão, óleo de babaçu, e óleo de semente de colza. Estas gorduras e óleos são muito usados para aplicações domésticas e industriais. Ainda, as gorduras e óleos produzidos a partir de plantas são usados como matérias-primas para combustível biodiesel ou bioplástico, e a sua aplicabilidade está aumentando para energia alternativa ao petróleo.

Em particular, um cultivo para geração de energia, tal como cana de açúcar, pode ser usado como uma matéria-prima para biocombustível. Então, espera-se a produção aumentada da massa total de uma planta em si (a quantidade de biomassa de planta). Sob estas circunstâncias, o aprimoramento na produtividade por unidade de área de cultivo é necessário de modo a aumentar a produção de biomassa de planta. Descobriu-se que se o número de plantas cultivadas for considerado constante por unidade de área de cultivo, um aprimoramento na quantidade de biomassa por planta seria necessário.

Entretanto, acredita-se que já que muitos genes estão envolvidos na quantidade de biomassa de planta (um chamado tipo de característica quantitativa), a introdução de um gene individual ou modificação genética individual pode não levar a um aumento eficaz na produção. Entretanto, muitas dificuldades estão associadas à introdução de muitos genes em um estado desejado em uma planta. Esta introdução gênica também é problemática porque se ocorrer uma introdução bem sucedida, as características desejáveis podem nem sempre ser adquiridas.

Várias técnicas para introdução de genes são conhecidas como técnicas para aumentar a produção de biomassa de planta, conforme apresentado nos documentos de patente 1 a 7, por exemplo. Entretanto, no caso de todos os documentos, deve ser dada atenção aos efeitos do aumento da produção de biomassa, embora nenhuma técnica seja revelada para conferir resistência ao estresse salino a uma planta.

Documento de Patente 1: Publicação de Patente JP (Kohyo) N°

2001-505410 A

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Documento de patente 2: Publicação de Patente JP (Kohyo) N° 2001-519659 A

Documento de patente 3: Publicação de Patente JP (Kohyo) N° 2007-530063 A

Documento de patente 4: Publicação de Patente JP (Kokai) N° 2005-130770 A

Documento de patente 5: Publicação de Patente JP (Kohyo) N° 2000-515020 A

Documento de patente 6: Publicação de Patente JP (Kohyo) N° 9-503389 (1997) A

Documento de patente 7: Publicação de Patente JP (Kokai) N° 2005-52114 A Descrição da invenção Problema a ser solucionado pela invenção

Devido às circunstâncias acima, um objetivo da presente invenção é buscar genes que possuem novas funções de aumentar drasticamente a quantidade de biomassa de planta e, deste modo, fornecer uma técnica com a qual a produção de biomassa de planta pode ser drasticamente aumentada e resistência ao estresse salino pode ser conferida à planta.

Meios para solucionar o problema

Como um resultado de intensos estudos para atingir o objetivo acima, os presentes inventores obtiveram um novo achado ao efeito de que a quantidade de biomassa de planta pode ser drasticamente aprimorada e resistência ao estresse salino pode ser conferida a uma planta através da introdução de um gene que codifica uma proteína que tem uma estrutura enrolada em espiral (coiled-coil), um sítio de ligação de ácido nucleico, e uma estrutura de repetições ricas em leucina nas suas moléculas e que compreende sequências comuns características ou a alteração de uma região de controle de expressão do tal gene que é apresentada de forma endógena. Isto levou à conclusão da presente invenção.

Especificamente, a planta da presente invenção é caracterizada pelo fato de que um gene que codifica uma proteína que compreende uma

4/41 sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3 e uma sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2, nesta ordem a partir da porção Nterminal, e que tem uma estrutura enrolada em espiral, um sítio de ligação de ácido nucléico, e uma estrutura de repetições ricas em leucina foi introduzido na mesma ou uma região de controle de expressão do gene que é apresentada de forma endógena foi alterada na mesma.

Ademais, o método para aumentar a produção de biomassa e conferir resistência ao estresse salino a uma planta da presente invenção é um método para introduzir um gene que codifica uma proteína que compreende uma sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3 e uma sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 nesta ordem a partir da porção Nterminal e que tem uma estrutura enrolada em espiral, um sítio de ligação de ácido nucléico, e uma estrutura de repetições ricas em leucina, em uma planta ou alterar uma região de controle de expressão do gene que é apresentada de forma endógena em uma planta.

Além disso, o método de produção da planta da presente invenção é um método que compreende as etapas de: preparar uma planta transformada na qual um gene que codifica uma proteína que compreende uma sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3 e uma sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 nesta ordem a partir da porção Nterminal e que tem uma estrutura enrolada em espiral, um sítio de ligação de ácido nucléico, e uma estrutura de repetições ricas em leucina foi introduzido ou na qual uma região de controle de expressão do gene que é apresentado de forma endógena foi alterada; e determinar a quantidade de biomassa e resistência ao estresse salino de uma planta de progênie da planta transformada e selecionar uma linhagem que exibe uma quantidade significativamente aumentada de biomassa e resistência ao estresse salino.

De acordo com a presente invenção, de preferência, a proteína compreende, adicionalmente, uma sequência comum que consiste na se5/41 quência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1 na porção N-terminal de uma sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3.

De acordo com a presente invenção, o gene supracitado pode ser pelo menos um gene selecionado do grupo que consiste em AT1G59218,

AT1G58390,

AT1G59124,

AT1G58410,

AT1G50180,

AT1G58807,

AT1G58400,

AT1G58848,

AT1G59620,

AT1G58602,

AT1G59780,

AT1G53350, AT5G43470, AT5G48620, AT5G35450, e

AT1G10920 ou um gene funcionalmente equivalente a estes.

De acordo com a presente invenção, de preferência, o gene supracitado é um gene que codifica qualquer uma das seguintes proteínas (a) a (c).

(a) Uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 5.

(b) Uma proteína que compreende uma sequência de aminoácido que tem uma deleção, uma substituição, uma adição, ou uma inserção de um ou de uma pluralidade de aminoácidos com relação à sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 5 e que tem uma estrutura enrolada em espiral, um sítio de ligação de ácido nucléico, e uma estrutura de repetições ricas em leucina.

(c) Uma proteína que é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes a um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 4 e que tem uma estrutura enrolada em espiral, um sítio de ligação de ácido nucléico, e uma estrutura de repetições ricas em leucina.

Além disso, de acordo com a presente invenção, um exemplo do gene funcionalmente equivalente acima é um gene de um organismo diferente de Arabidopsis thaliana que codifica uma proteína que tem uma estrutura enrolada em espiral, um sítio de ligação de ácido nucléico, e uma estrutura de repetições ricas em leucina. Um exemplo de um organismo diferente de Arabidopsis thaliana é uma uva.

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Exemplos de plantas a serem submetidas à presente invenção incluem dicotiledôneas, tais como plantas da família Brassicaceae. Exemplos de plantas da família Brassicaceae incluem Arabidopsis thaliana e colza. Outros exemplos de plantas a ser submetidas à presente invenção incluem monocotiledôneas, tais como plantas da família Gramineae. Exemplos de plantas da família Gramineae incluem arroz e cana-de-açúcar.

Esta descrição inclui parte ou todo o conteúdo apresentado na descrição e/ou desenhos do Pedido de Patente Japonês n° 2008-246233, que é um documento de prioridade do presente pedido.

Efeitos da invenção

A planta de acordo com a presente invenção é uma planta com uma quantidade significativamente aumentada de biomassa em comparação às plantas do tipo selvagem, às quais foi conferida resistência ao estresse ambiental. Além disso, o método para aumentar a produção de biomassa e conferir resistência ao estresse salino a uma planta de acordo com a presente invenção pode obter produção significativamente aumentada de biomassa em comparação a plantas-alvo do tipo selvagem e resistência ao estresse salino pode ser conferida a uma planta. Além disso, o método para produzir uma planta de acordo com a presente invenção torna possível produzir uma planta com uma quantidade drasticamente aumentada de biomassa em comparação a plantas do tipo selvagem e que possui resistência ao estresse salino. Portanto, através da aplicação da presente invenção, por exemplo, pode-se aumentar a produtividade quando a planta em si é um produto e isto pode ser alcançado com baixo custo. Além disso, as plantas podem crescer em um ambiente com uma alta concentração de sal.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1-1 é um diagrama característico que mostra os resultados da análise por alinhamento com o uso de um programa de alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL W (1.83) para as sequências de aminoácido codificadas por AT1G59124, AT1G58807, AT1G59218, AT1G58848, AT1G58602, AT1G58410, AT1G58400, AT1G58390, AT1G59620, AT1G59780, AT1G50180, AT1G53350, AT5G43470, AT5G48620,

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AT5G35450, e AT1G10920.

A figura 1-2 é um diagrama característico que mostra os resultados da análise por alinhamento com o uso de um programa de alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL W (1.83) para as sequências de aminoácido codificadas por AT1G59124, AT1G58807, AT1G59218, AT1G58848, AT1G58602, AT1G58410, AT1G58400, AT1G58390, AT1G59620, AT1G59780, AT1G50180, AT1G53350, AT5G43470, AT5G48620, AT5G35450, e AT1G10920.

A figura 1-3 é um diagrama característico que mostra os resultados da análise por alinhamento com o uso de um programa de alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL W (1.83) para as sequências de aminoácido codificadas por AT1G59124, AT1G58807, AT1G59218, AT1G58848, AT1G58602, AT1G58410, AT1G58400, AT1G58390, AT1G59620, AT1G59780, AT1G50180, AT1G53350, AT5G43470, AT5G48620, AT5G35450, e AT1G10920.

A figura 1-4 é um diagrama característico que mostra os resultados da análise por alinhamento com o uso de um programa de alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL W (1.83) para as sequências de aminoácido codificadas por AT1G59124, AT1G58807, AT1G59218, AT1G58848, AT1G58602, AT1G58410, AT1G58400, AT1G58390, AT1G59620, AT1G59780, AT1G50180, AT1G53350, AT5G43470, AT5G48620, AT5G35450, e AT1G10920.

A figura 1-5 é um diagrama característico que mostra os resultados da análise por alinhamento com o uso de um programa de alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL W (1.83) para as sequências de aminoácido codificadas por AT1G59124, AT1G58807, AT1G59218, AT1G58848, AT1G58602, AT1G58410, AT1G58400, AT1G58390, AT1G59620, AT1G59780, AT1G50180, AT1G53350, AT5G43470, AT5G48620, AT5G35450, e AT1G10920.

A figura 1-6 é um diagrama característico que mostra os resultados da análise por alinhamento com o uso de um programa de alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL W (1.83) para as sequências de aminoá8/41 cido codificadas por AT1G59124, AT1G58807, AT1G59218, AT1G58848, AT1G58602, AT1G58410, AT1G58400, AT1G58390, AT1G59620, AT1G59780, AT1G50180, AT1G53350, AT5G43470, AT5G48620, AT5G35450, e AT1G10920.

A figura 1-7 é um diagrama característico que mostra os resultados da análise por alinhamento com o uso de um programa de alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL W (1.83) para as sequências de aminoácido codificadas por AT1G59124, AT1G58807, AT1G59218, AT1G58848, AT1G58602, AT1G58410, AT1G58400, AT1G58390, AT1G59620, AT1G59780, AT1G50180, AT1G53350, AT5G43470, AT5G48620, AT5G35450, e AT1G10920.

A figura 2 é uma foto de sementes cultivadas em uma placa para plantas do tipo selvagem e uma foto de sementes cultivadas em uma placa para plantas transformadas nas quais foi introduzido um fragmento que contém a ORF deAT1G58602.

A figura 3 é uma foto mostrando as partes aéreas de plantas do tipo selvagem e de plantas transformadas nas quais foi introduzido um fragmento contendo a ORF de AT1G58602.

A figura 4 é um gráfico característico que mostra os resultados obtidos pela determinação da quantidade total de biomassa nas partes aéreas da planta do tipo selvagem, da planta transformada na qual o gene da proteína LRR-RLK (AT1G69990) foi introduzido, da planta transformada na qual o gene da proteína LRR-RLK (AT5G39390) foi introduzido, da planta transformada na qual o gene da proteína LRR (AT3G05650) foi introduzido, da planta transformada na qual o gene da proteína LRR (AT2G33080) foi introduzido, e da planta transformada na qual o gene da proteína CC-NBSLRR (AT1G58602) foi introduzido.

Melhor modo para executar a invenção

Deste ponto em diante no presente documento, a presente invenção é descrita em detalhes.

A planta da presente invenção é uma planta na qual foi introduzido um gene que codifica uma proteína que compreende sequências co9/41 muns características e que tem uma estrutura enrolada em espiral, um sítio de ligação de ácido nucleico, e uma estrutura de repetições ricas em leucina (deste ponto em diante abreviada como CC-NBS-LRR) ou uma planta na qual uma região de controle de expressão do gene que é apresentado de forma endógena foi alterada. Esta planta tem uma quantidade significativamente aumentada de biomassa em comparação às plantas do tipo selvagem e resistência ao estresse salino foi conferida a ela. Um gene-alvo exógeno é introduzido em uma planta, ou uma região de controle de expressão deste gene que é apresentado de forma endógena na planta é alterada para que o nível de expressão do gene-alvo possa ser significativamente aumentado para um nível maior do que a sua expressão em plantas do tipo selvagem. Além disso, o gene CC-NBS-LRR descrito acima pode ser expresso em todos os tecidos da planta da presente invenção. Ele pode, também, ser expresso em pelo menos alguns dos tecidos da planta. Aqui, o termo tecido(s) de planta refere-se a órgão(s) da planta, tais como folhas, hastes, sementes, raízes e flores.

Além disso, o termo região de controle de expressão inclui no seu significado uma região promotora para a ligação da RNA polimerase e uma região para a ligação de um fator de transcrição diferente. Para a alteração da região de controle transcricional, é preferível substituir, por exemplo, uma região promotora na região de controle transcricional endógena por uma região promotora que pode ser mais altamente expressa do que a região promotora endógena.

Gene CC-NBS-LRR

De acordo com a presente invenção, o gene CC-NBS-LRR codifica uma proteína CC-NBS-LRR que compreende uma sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3 e uma sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 nesta ordem a partir da porção N-terminal. Além disso, conforme descrito na referência (1) (The Plant Cell, Vol. 15, 809-834, abril de 2003), a CC-NBS-LRR tem um sítio de ligação de ácido nucleico e é classificada como um tipo de proteína de resistência de planta (também chamada

10/41 de uma proteína R). Em particular, a CC-NBS-LRR que compreende as sequências comuns acima é classificada como CNL-D na referência acima. A CNL-D é similar a outras CC-NBS-LRRs em que ela possui uma estrutura enrolada em espiral, um sítio de ligação de ácido nucleico, e uma estrutura de repetições ricas em leucina a partir da porção N-terminal. Entretanto, a CNL-D é caracterizada por uma porção de um motivo de ligação de ácido nucleico localizado entre uma estrutura enrolada em espiral e uma estrutura de repetições ricas em leucina. Portanto, acredita-se que a CNL-D tenha funções biológicas diferentes daquelas de outras CC-NBS-LRRs.

Exemplos de CC-NBS-LRR classificadas como tal CNL-D incluem AT1G59124, AT1G58807, AT1G59218, AT1G58848, AT1G58602, AT1G58410, AT1G58400, AT1G58390, AT1G59620, AT1G59780,

AT1G50180, AT1G53350, AT5G43470, AT5G48620, AT5G35450, e AT1G10920, conforme mostrado na figura 4A da referência (1). As figuras 11 a 1-7 mostram os resultados de análises por alinhamento com o uso de um programa de alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL W (1.83) (que pode ser usado junto ao DDBJ do Instituto Nacional de Genética (National Institute of Genetics) (http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html)) para os exemplos de CC-NBS-LRR acima, classificados como CNL-D (desde que a matriz BLOSUM compreendendo os valores padrão seja usada para uma tabela de matriz de substituição de sequência de aminoácido).

Conforme mostrado nas figuras 1-1 a 1-7, entende-se que os exemplos de CC-NBS-LRR classificados como CNL-D possuem as regiões altamente conservadas (3) e (2) nesta ordem a partir da porção N-terminal. Especificamente, estas regiões altamente conservadas (3) e (2) podem ser definidas como sendo correspondentes à sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3 e à sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2, respectivamente. Em outras palavras, a sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3 e a sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 são sequências específicas da CNL-D usada para a classificação de CC-NBS11/41

LRR, conforme descrito acima. Portanto, as sequências podem ser usadas como sequências padrão para uma clara distinção de outros grupos.

Além disso, conforme mostrado na figura 1, entende-se que a CC-NBS-LRR classificada como CNL-D tem uma região altamente conservada (1) localizada na porção N-terminal da região (3), além das regiões (3) e (2). Especificamente, esta região altamente conservada (1) pode ser definida como correspondente à sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1. Isto quer dizer que a CC-NBSLRR classificada como CNL-D pode também ser definida como possuindo ainda a sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1 na porção N-terminal na sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3, além da sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3 e da sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2.

Na presente invenção, um resíduo de aminoácido chamado de Xaa na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1 é um aminoácido arbitrário e não se limita a nenhum aminoácido particular. Observe que o terceiro resíduo de aminoácido da porção N-terminal na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1 é, de preferência, isoleucina (código de três letras: lie; código de uma letra: I (e o mesmo se aplica deste ponto em diante no presente documento)), leucina (Leu, L), ou valina (Vai, V). De preferência, o quarto resíduo de aminoácido da porção N-terminal na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1 é treonina (Thr, T), serina (Ser, S), ou alanina (Ala, A). O sexto resíduo de aminoácido da porção N-terminal na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1 é, de preferência, metionina (Met, M) ou leucina (Leu, L). O nono resíduo de aminoácido da porção N-terminal na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1 é, de preferência, leucina (Leu, L) ou isoleucina (lie, I). O décimo sexto resíduo de aminoácido da porção N-terminal na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1 é, de preferência, lisina (Lys, K) ou arginina (Arg, R). O décimo oitavo resíduo de aminoácido da porção N-terminal na sequência

12/41 de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1 é, de preferência, valina (Vai, V) ou isoleucina (lie, I). O vigésimo resíduo de aminoácido da porção N-terminal na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1 é, de preferência, asparagina (Asn, N), ácido aspártico (Asp, D), ou histidina (His, Η). O vigésimo segundo resíduo de aminoácido da porção N-terminal na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1 é, de preferência, ácido glutâmico (Glu, E) ou ácido aspártico (Asp, D). Isto quer dizer que um exemplo mais específico da sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1 é, de preferência,

VS(I/L/V)(T/S/A)G(M/L)GG(L/I)GKTTLA(K/R)Q(V/I)F(N/D/H)H(E/D). Nesta sequência de aminoácido, uma pluralidade de aminoácidos entre parênteses representam variações dos resíduos de aminoácido que pode estar presentes como as posições relevantes.

Na presente invenção, um resíduo de aminoácido chamado de Xaa na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 é um aminoácido arbitrário e não se limita a nenhum aminoácido particular. Observe que o segundo resíduo de aminoácido da porção N-terminal na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 é, de preferência, histidina (His, H), arginina (Arg, R), ou glutamina (Gin, Q). O terceiro resíduo de aminoácido da porção N-terminal na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 é, de preferência, leucina (Leu, L) ou metionina (Met, Μ). O sexto resíduo de aminoácido da porção N-terminal na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 é, de preferência, metionina (Met, M), isoleucina (lie, I), ou leucina (Leu, L). O sétimo resíduo de aminoácido da porção N-terminal na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 é, de preferência, metionina (Met, M) ou valina (Vai, V). O décimo resíduo de aminoácido da porção N-terminal na sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2 é, de preferência, valina (Vai, V) ou isoleucina (lie, I). O décimo segundo resíduo de aminoácido da porção N-terminal na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 é, de preferência, leucina (Leu, L) ou isoleucina (lie, I). Isto quer dizer que um exemplo mais específico da sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 é, de pre13/41 ferência, C(H/R/Q)(L/M)HD(M/I/L)(MA/)RE(V/I)C(L/I). Nesta sequência de aminoácido, uma pluralidade de aminoácidos entre parênteses representam variações dos resíduos de aminoácido que pode estar presentes como as posições relevantes.

Na presente invenção, um resíduo de aminoácido chamado de Xaa na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3 é um aminoácido arbitrário e não se limita a nenhum aminoácido particular. Observa-se que o segundo resíduo de aminoácido da porção N-terminal na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3 é, de preferência, isoleucina (lie, I) ou leucina (Leu, L). O sexto resíduo de aminoácido da porção N-terminal na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3 é, de preferência, valina (Vai, V) ou alanina (Ala, A). O sétimo resíduo de aminoácido da porção Nterminal na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3 é, de preferência, arginina (Arg, R) ou lisina (Lys, K). O décimo resíduo de aminoácido da porção N-terminal na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3 é, de preferência, metionina (Met, M) ou leucina (Leu, L). O décimo primeiro resíduo de aminoácido da porção N-terminal na sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 3 é, de preferência, valina (Vai, V) ou isoleucina (lie, I). Isto quer dizer que um exemplo mais específico da sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3 é, de preferência, Y(I/L)EEL(V/A)(R/K)RN(M/L)(V/I). Nesta sequência de aminoácido, uma pluralidade de aminoácidos entre parênteses representam variações dos resíduos de aminoácido que pode estar presentes como as posições relevantes.

Variações dos resíduos de aminoácido que podem estar presentes em determinadas posições são determinadas com base nas seguintes razões. Conforme descrito na referência (2) (McKee Biochemistry, 3^a ed., Capítulo 5 Amino AcidDPeptideDProtein 5.1 Amino Acid; supervisor editorial: Atsushi Ichikawa; supervisor de tradução: Shinichi Fukuoka; editora: Ryosuke Sone; escritório de edição: Kaqaku-Dojin Publishing Company, INC, ISBN4-7598-0944-9), é bem conhecido que os aminoácidos são classificados com base nas cadeias laterais que têm propriedades similares (por e14/41 xemplo, propriedades químicas e tamanhos físicos). Também é bem conhecido que ocorre substituição evolucionária molecular frequentemente dentre resíduos de aminoácido classificados em um determinado grupo, embora a atividade da proteína seja mantida. Com base nestes conceitos, uma matriz de pontuação de substituição (mutação) (BLOSUM: Blocos da matriz da substituição do aminoácido) para os resíduos de aminoácido é proposta na figura 2 da referência (3): Henikoff S., Henikoff J. G., Amino-acid substitution matrices from protein blocks, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 10915-10919 (1992) e é amplamente usada. A referência (2) se baseia em um achado de que as substituições de aminoácido que ocorrem entre aminoácidos com cadeias laterais que tem propriedades químicas similares resultam em menos alterações estruturais ou funcionais na proteína completa. De acordo com as referências (2) e (3) acima, os grupos das cadeias laterais de aminoácido a serem usados no alinhamento múltiplo podem ser considerados com base em índices, tais como as propriedades químicas e tamanhos físicos. Eles são mostrados como grupos de aminoácido com uma pontuação de 0 ou mais e, de preferência, como grupos de aminoácido com uma pontuação de 1 ou mais através do uso da matriz de pontuações (BLOSUM) apresentada na referência (3). Os grupos típicos são os seguintes 8 grupos. Adicionalmente, grupos de aminoácido precisamente agrupados podem ser grupos de aminoácido com uma pontuação de 0 ou mais, de preferência, uma pontuação de 1 ou mais, e adicionalmente, de preferência uma pontuação de 2 ou mais.

1) Grupo de aminoácido hidrofóbico alifático (grupo ILMV)

Este grupo é um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais hidrofóbicas alifáticas, dentre os aminoácidos não polares neutros apresentados na referência (1) acima, e que é composto por V (Vai, valina), L (Leu, leucina), I (lie, isoleucina), e M (Met, metionina). Dentre os aminoácidos classificados como aminoácidos não polares neutros de acordo com a referência (1), FGACWP não está incluído neste grupo de aminoácido hidrofóbico alifático por causa das seguintes razões: G (Gli, glicina) e A (Ala, alanina) tem o mesmo tamanho que, ou são menores que, um grupo metila e

15/41 possuem efeitos não polares fracos; C (Cis, cisteína) pode desempenhar um importante papel nas ligações S-S e possuem uma propriedade de formação de uma ponte de hidrogênio com um átomo de oxigênio ou um átomo de nitrogênio; F (Fe, fenilalanina) e W (Trp, triptofano) possuem cadeias laterais com pesos moleculares significativamente maiores e possuem fortes efeitos aromáticos; P (Pro, prolina) tem fortes efeitos de iminoácido, de modo a fixar o ângulo da cadeia principal do polipeptídeo.

2) Grupo contendo grupo hidroximetileno (grupo ST)

Este grupo é um grupo de aminoácidos (dentre aminoácidos polares neutros) que tem grupos hidroximetileno nas cadeias laterais, que é composto por S (Ser, serina) e T (Thr, treonina). Os grupos hidróxi que existem nas cadeias laterais de S e T constituem sítios de ligação de açúcar, então estes sítios são frequentemente importantes para um polipeptídeo (proteína) ter uma atividade específica.

3) Aminoácido ácido (grupo DE)

Este grupo é um grupo de aminoácidos que tem grupo carboxila acídicos nas cadeias laterais, e que é composto por D (Asp, ácido aspártico) e E (Glu, ácido glutâmico).

4) Aminoácido básico (grupo KR)

Este grupo é um grupo de aminoácidos básicos, que é composto por K (Lis, lisina) e R (Arg, arginina). Estes K e R são carregados positivamente dentro de uma ampla faixa de pH e possuem propriedades básicas. Por outro lado, a H (His, histidina) classificada como aminoácido básico quase nunca está ionizada em pH 7, então a H não está classificada neste grupo.

5) Grupo metileno = grupo polar (grupo DHN)

Este grupo é caracterizado pelo fato de que: em todos os casos, um grupo metileno como uma cadeia lateral se liga a um elemento de carbono-D após o qual está presente um grupo polar; e os tamanhos físicos dos grupos metileno que grupos não polares são muito parecidos entre si. Este grupo é composto por N (Asn, asparagina; os grupos polares são grupos amida), D (Asp, ácido aspártico; os grupos polares são grupos carboxila), e

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H (His, histidina; os grupos polares são grupos imidazol).

6) Grupo dimetileno = grupo polar (grupo EKQR)

Este grupo é caracterizado pelo fato de que: em todos os casos, um hidrocarboneto linear que tem um comprimento maior que o de um grupo dimetileno se liga como uma cadeia lateral a um elemento de carbono-D, após o qual está presente um grupo polar; e os tamanhos físicos dos grupos dimetileno que são grupos não polares, são muito semelhantes entre si. Este grupo é composto de E (Glu, ácido glutâmico, o grupo polar é um grupo carboxila), K (Lis, lisina; os grupos polares são grupos amino), Q (Gin, glutamina; os grupos polares são grupos amida), e R (Arg, arginina; os grupos polares são grupos imino e grupos amino).

7) Séries aromáticas (grupo FYW)

Este grupo é um grupo de aminoácidos aromáticos que tem núcleos de benzeno nas cadeias laterais e é caracterizado por ter propriedades químicas exclusivas nas séries aromáticas. Este grupo é composto de F (Fe, fenilalanina), Y (Tir, tirosina), e W (Trp, triptofano).

8) Anel e polar (grupo HY)

Este grupo é um grupo de aminoácidos que tem tanto estruturas de anel nas cadeias laterais como polaridade, e é composto por Η (H, histidina; ambas as estruturas de anel e grupos polares são grupos imidazol), e Y (Tir, tirosina; as estruturas de anel são núcleos de benzeno e os grupos polares são grupos hidróxi).

Conforme descrito acima, entende-se que: nas determinadas sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOS: 1 a 3, um resíduo de aminoácido chamado de Xaa pode ser qualquer aminoácido; ou resíduos de aminoácido chamados de Xaa podem ser substituídos uns pelos outros dentro dos grupos 1) a 8) acima. Então, na presente invenção, o gene CCNBS-LRR pode ter qualquer origem de planta desde que ele tenha duas sequências comuns consistindo nas sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOS: 2 e 3 e, de preferência, três sequências comuns consistindo nas sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOS: 1 a 3.

Mais especificamente, para Arabidopsis thaliana, os exemplos

17/41 do gene CC-NBS-LRR que compreendem uma sequência comum que consiste nas sequências de aminoácido determinadas mostradas nas SEQ ID NOS: 1 a 3 incluem AT1G59124, AT1G58807, AT1G59218, AT1G58848, AT1G58602, AT1G58410, AT1G58400, AT1G58390, AT1G59620, AT1G59780, AT1G50180, AT1G53350, AT5G43470, AT5G48620, AT5G35450, e AT1G10920. De acordo com a presente invenção, pelo menos um gene selecionado a partir do grupo de genes acima é introduzido em uma planta ou uma região de controle de expressão do gene que é apresentado de forma endógena é alterada em uma planta. Em particular, de acordo com a presente invenção, os genes identificados com AT1G59124, AT1G58807, AT1G59218, AT1G58848, e AT1G58602 e, de preferência, o gene identificado com AT1G58602 são introduzidos em uma planta ou uma região de controle de expressão do gene relevante é alterada em uma planta.

Como exemplos, a sequência de nucleotídeo da região codificante do gene identificado com AT1G58602 é mostrada na SEQ ID NO: 4 e a sequência de aminoácido de CC-NBS-LRR codificada pelo gene identificado com AT1G58602 é mostrada na SEQ ID NO: 5.

Além disso, de acordo com a presente invenção, um gene que é funcionalmente equivalente a um gene descrito acima pode ser introduzido em uma planta. Aqui, o termo gene funcionalmente equivalente refere-se, por exemplo, a um gene e um organismo diferente de Arabidopsis thaliana que codifica CC-NBS-LRR compreendendo duas sequências comuns que consistem nas sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOS: 2 e 3. Adicionalmente, tal gene funcionalmente equivalente é um gene que codifica uma proteína que compreende CC-NBS-LRR, que é uma proteína R que interage diretamente ou indiretamente com um efetor.

Um exemplo de um organismo diferente de Arabidopsis thaliana é uma uva (Vitis vinifera). Mais especificamente, exemplos do gene deste organismo incluem os genes identificados com os seguintes números de acesso como genes de Vitis vinifera: A7Q3G8, A5BY93, A7Q3G6, A5C0R9, e A7Q3H1.

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Genes de plantas diferentes de Arabidopsis thaliana que codificam CC-NBS-LRR compreendendo duas sequências comuns que consistem nas sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOS: 2 e 3, que são representados pelos exemplos acima, podem ser facilmente pesquisadas ou identificadas em bases de dados, como o GenBank, com base nas sequências de aminoácido codificadas pelos genes AT1G58602 derivados de Arabidopsis thaliana supracitados.

Além disso, de acordo com a presente invenção, um gene CCNBS-LRR não se limita aos genes CC-NBS-LRR descritos acima que compreendem as sequências de nucleotídeo e as sequências de aminoácido identificadas com os números de sequência acima. Então, o gene CC-NBSLRR pode ser um gene que contém uma sequência de aminoácido que tem uma deleção, uma substituição, uma adição ou uma inserção de um ou uma pluralidade de aminoácidos com relação às sequências de aminoácido identificadas com os números de sequência acima e tem atividade de funcionar como um gene CC-NBS-LRR. Aqui, o termo uma pluralidade de aminoácidos refere-se a 1 a 20, de preferência, 1 a 10, com mais preferência, 1 a 7, ainda de preferência, 1 a 5, e particularmente de preferência 1 a 3 aminoácidos, por exemplo. Além disso, a deleção, substituição, ou adição de aminoácidos pode ser realizada pela alteração de uma sequência de nucleotídeos que codifica o gene CC-NBS-LRR acima por um método conhecido na técnica. Uma mutação pode ser introduzida em uma sequência de nucleotídeo por uma técnica conhecida, tal como o método de Kunkel ou o método de Gapped duplex ou um método baseado nos mesmos. Por exemplo, uma mutação é introduzida com um kit de mutagênese com o uso de mutagênese sítio-dirigida (por exemplo, Mutant-K ou Mutant-G (ambos são nomes comerciais da TAKARA Bio)) ou similares, ou um LA PCR in vitro Mutagenesis series kit (nome comercial, TAKARA Bio). Adicionalmente, um método de mutagênese pode ser: um método que usa um agente de mutação química representado pelo EMS (metanossulfonato de etila), 5-bromouracila, 2aminopurina, hidroxilamina, N-metil-N’-nitro-N nitrosoguanidina, ou outros compostos carcinogênicos; ou um método que envolve tratamento com radi19/41 ação ou tratamento com ultravioleta [UV] tipicamente com o uso de raios X, raios alfa, raios beta, raios gama, um feixe de íons, ou similares.

Além disso, genes CC-NBS-LRR podem ser genes homólogos aos genes CC-NBS-LRR que compreendem as sequências de nucleotídeo e as sequências de aminoácido identificadas com os números de sequência acima. Aqui, o termo gene homólogo refere-se geralmente a um gene que se ramificou evolutivamente a partir de um gene ancestral comum, incluindo um gene homólogo (ortólogo) de 2 tipos de espécies e um gene homólogo (parálogo) gerado por ramificação por sobreposição que ocorre dentro da mesma espécie. Em outras palavras, o termo gene funcionalmente equivalente acima se refere a um gene homólogo, tal como, um ortólogo ou um parálogo. Além disso, o termo gene funcionalmente equivalente acima pode, também referir-se um gene que não evolui a partir de um gene em comum, mas apenas tem funções análogas.

Exemplos de genes similares aos genes CC-NBS-LRR que compreendem as sequências de nucleotídeo e as sequências de aminoácido identificadas com os números de sequência acima incluem genes que codificam proteínas que têm, cada, uma sequência de aminoácido que tem 70% ou mais, de preferência 80% ou mais, com mais preferência 90% ou mais e, com a máxima preferência, 95% ou mais similaridade a qualquer uma destas sequências de aminoácido, uma sequência comum que consiste na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1, e que tem atividade de CCNBS-LRR. Aqui, o valor de similaridade refere-se a um valor que pode ser obtido com base nos ajustes padrão com o uso de um computador equipado com um programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) e uma base de dados contendo informações sobre a sequência do gene.

Adicionalmente, genes similares aos genes CC-NBS-LRR2C que compreendem as sequências de nucleotídeo e as sequências de aminoácido identificadas com os números de sequência acima podem ser identificados, quando a informação relacionada ao genoma da planta ainda não foi esclarecida, através da extração do genoma de uma planta-alvo ou construção de uma biblioteca de cDNA para uma planta-alvo e, então, isolamento de uma

20/41 região genômica ou hibridização de cDNA sob condições estringentes a pelo menos algumas porções dos genes CC-NBS-LRR que compreendem as sequências de nucleotídeo e as sequências de aminoácido identificadas com os números de sequência acima. Aqui, o termo condições estringentes refere-se às condições sob as quais um híbrido específico é formado, mas um híbrido inespecífico nunca é formado. Por exemplo, estas condições compreendem hibridização a 45°C com SSC 6 X (cloreto de sódio/citrato de sódio), seguido de lavagem a 50°C até 65°C com SSC 0,2 a 1 X e 0,1% de SDS. Alternativamente, estas condições compreendem hibridização a 65°C a 70°C com SSC 1 X, seguido de lavagem a 65°C até 70°C com SSC 0,3 X. A hibridização pode ser realizada por um método convencionalmente conhecido, tal como um método descrito em J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989).

A planta da presente invenção é obtida como uma planta que exibe uma quantidade significativamente aumentada de biomassa em comparação a plantas do tipo selvagem e resistência ao estresse salino através da introdução nelas de um gene que codifica CC-NBS-LRR que compreende duas sequências comuns que consistem nas sequências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOS: 2 e 3 ou da alteração de uma região de controle de expressão do gene que é apresentado de forma endógena nela. Um exemplo de uma técnica para introduzir este gene CC-NBS-LRR em uma planta é uma técnica para introduzir um vetor de expressão no qual um gene CC-NBS-LRR exógeno é colocado sob o controle de um promotor que permite a expressão em uma planta. Um exemplo de uma técnica para alterar uma região de controle de expressão do gene que é apresentado de forma endógena é uma técnica para alterar um promotor do gene CC-NBS-LRR que é apresentado de forma endógena em uma planta-alvo.

Um exemplo preferencial desta técnica é uma técnica para introduzir um vetor de expressão em uma planta-alvo, no qual o gene CC-NBSLRR descrito acima é colocado sob o controle de um promotor que permite expressão dentro de uma planta.

Vetor de expressão

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Um vetor de expressão é construído para conter um promotor que permite expressão em uma planta e o gene CC-NBS-LRR descrito acima. Como um vetor que serve como um corpo mãe para um vetor de expressão, vários vetores convencionalmente conhecidos podem ser usados. Por exemplo, plasmídios, fagos, cosmídios ou similares, podem ser usados e este vetor pode ser adequadamente selecionado dependendo das células de planta nas quais ele é introduzido e dos métodos de introdução. Exemplos específicos deste vetor incluem os vetores pBR322, pBR325, pUC19, pUC119, pBluescript, pBluescriptSK, e pBI. Particularmente, quando um método para a introdução de um vetor em uma planta usa Agrobacteríum, um vetor binário pBI é, de preferência, usado. Exemplos específicos destes vetor binário pBI incluem pBIG, pBIN19, pBI101, pBI121, e pBI221.

Um promotor a ser usado aqui não é particularmente limitado, contanto que ele permita a expressão de um gene CC-NBS-LRR em uma planta. Qualquer promotor conhecido pode ser apropriadamente usado. Exemplos deste promotor incluem um promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV35S), vários promotores do gene da actina, vários promotores do gene de ubiquitina, um promotor do gene de nopalina sintase, um promotor do gene PR1a de tabaco, um promotor do gene da subunidade pequena de ribulose 1,5-bisfosfato carboxilaseD oxidase de tomate e um promotor do gene de napina. Destes, um promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor, um promotor do gene da actina, ou um promotor do gene de ubiquitina podem ser usados com mais preferência. O uso de cada um dos promotores acima permite forte expressão de qualquer gene quando ele é introduzido nas células de planta.

Adicionalmente, um promotor que tem funções de causar expressão sítio-específica em uma planta pode também ser usado na presente invenção. Qualquer promotor convencionalmente conhecido pode ser usado como este promotor. Quando o gene CC-NBS-LRR descrito acima é introduzido de forma sítio-específica com o uso deste promotor, os órgãos de uma planta no qual o gene é expresso podem crescer mais do que os órgãos das plantas do tipo selvagem.

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Além disso, um vetor de expressão pode conter também outros segmentos de DNA em adição ao promotor e ao gene CC-NBS-LRR acima. Estes outros segmentos de DNA não são particularmente limitados e exemplos destes incluem um terminador, um marcador de seleção, um intensificador, e uma sequência de nucleotídeo para acentuar a eficiência da tradução. Além disso, o vetor de expressão recombinante acima pode, ainda, ter uma região de T-DNA. Uma região de T-DNA pode acentuar a eficiência da introdução do gene particularmente quando o vetor de expressão recombinante acima é introduzido em uma planta com o uso de Agrobacterium.

Um terminador de transcrição não é particularmente limitado, contanto que ele tenha funções como um sítio de término de transcrição e pode ser qualquer terminador de transcrição conhecido. Por exemplo, especificamente, uma região de terminação de transcrição de um gene de nopalina sintase (terminador Nos), uma região de terminação de transcrição de vírus do mosaico da couve-flor 35S (terminador de CaMV35S), ou similares podem ser preferivelmente usados. Destes, o terminador Nos pode ser usado com mais preferência. No caso do vetor recombinante acima, uma fenômeno, tal como um transcrito desnecessariamente comprido ser sintetizado e um promotor forte diminuir os números de cópias de um plasmídio após a introdução em células de planta, pode ser evitado por colocar um terminador de transcrição em uma posição adequada .

Como um marcador de seleção transformante, um gene de resistência a medicamentos pode ser usado, por exemplo. Exemplos específicos deste gene de resistência a medicamentos incluem genes de resistência a medicamentos contra higromicina, bleomicina, canamicina, gentamicina, cloranfenicol, e similares. As plantas transformadas podem ser facilmente selecionadas através da seleção de plantas que podem crescer em meio contendo os antibióticos acima.

Um exemplo de uma sequência de nucleotídeo para aumentar a eficiência da tradução é uma sequência ômega do vírus do mosaico do tabaco. Esta sequência ômega é disposta em uma região não traduzida (5’UTR) de um promotor, para que a eficiência de tradução do gene de fusão

23/41 possa ser aumentada. Como tal, o vetor de expressão recombinante pode conter vários segmentos de DNA dependendo das finalidades.

Um método para construir um vetor de expressão recombinante não é particularmente limitado. A um vetor adequadamente selecionado que serve como um corpo mãe, o promotor acima e o gene CC-NBS-LRR acima, um polinucleotídeo conversor de repressor de transcrição e, se necessário, os outros segmentos de DNA acima podem ser introduzidos em uma ordem predeterminada. Por exemplo, o gene acima e um promotor (e, se necessário, um terminador de transcrição ou similares) são ligados para construir um cassete de expressão e, então, o cassete pode ser introduzido em um vetor. Na construção de um cassete de expressão, por exemplo, sítios de divagem de segmentos de DNA são preparados para ter extremidades protuberantes complementares entre si e, então, uma reação é realizada com uma enzima de ligação, tornando possível especificar a ordem dos segmentos de DNA. Além disso, quando um cassete de expressão contém um terminador, os segmentos de DNA podem ser dispostos na seguinte ordem a partir da região à montante: um promotor, o gene CC-NBS-LRR acima, e um terminador. Ainda, reagentes para a construção de um vetor de expressão (isto é, tipos de enzimas de restrição, enzimas de ligação, e similares) também não são particularmente limitados. Então, reagentes comercialmente disponíveis podem ser adequadamente selecionados e usados.

Além disso, um método para replicação (um método para produção) do vetor de expressão acima não é particularmente limitado e métodos de replicação convencionalmente conhecidos podem ser usados na presente invenção. Em geral, este vetor de expressão pode ser replicado dentro de Escheríchia coli como um hospedeiro. Neste momento, tipos preferenciais de Escheríchia coli podem ser selecionados dependendo dos tipos de vetor.

T ransformação

O vetor de expressão descrito acima é introduzido em uma planta-alvo por um método de transformação geral. Um método para introduzir um vetor de expressão em células de planta (método de transformação) não é particularmente limitado. Métodos de introdução apropriados convencio24/41 nalmente conhecidos podem ser usados dependendo das células de planta. Especificamente, um método que usa Agrobacterium ou um método que envolve a introdução direta nas células de planta pode ser usado, por exemplo. Como um método que usa Agrobacterium, um método descrito em Bechtold, E., Ellis, J. e Pelletier, G. (1993) In Planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis plants. C. R. Acad. Sei. Paris Sei. Vie, 316, 1194-1199., ou um método descrito em Zyprian E, Kado Cl, Agrobacterium-mediated plant transformation by novel mini-T vectors in conjunction with a high-copy vir region helper plasmid, Plant Molecular Biology, 1990, 15(2), 245-256 pode ser empregado, por exemplo.

Como um método para introduzir diretamente um vetor de expressão em células de planta, microinjeção, eletroporação, um método com polietileno glicol, um método com arma de partículas, fusão de protoplasto, um método com fosfato de cálcio, ou similares, podem ser empregados.

Ainda, quando um método para introduzir diretamente DNA nas células de planta é empregado, o DNA que pode ser usado aqui contém unidades transcricionais necessárias para a expressão de um gene-alvo, tal como um promotor e um terminador de transcrição e um gene-alvo. As funções do vetor não são essenciais neste caso. Além disso, um DNA que contém somente uma região codificante de proteína de um gene-alvo e não tem unidade transcricional, pode ser usado aqui, contanto que ele seja integrado em uma unidade transcricional do hospedeiro e, então, o gene-alvo pode ser expresso.

Exemplos de células de planta nas quais o vetor de expressão acima ou um cassete de expressão que não contém um vetor de expressão, mas sim um gene-alvo, é introduzido incluem células de cada tecido de órgãos de planta, tais como flores, folhas, e raízes, calos, e células cultivadas em suspensão. Neste momento, um vetor de expressão adequado pode ser construído de acordo com o tipo de planta a ser produzido ou um vetor de expressão versátil pode ser construído antecipadamente e, então, introduzido nas células de planta.

As plantas nas quais um vetor de expressão é introduzido ou,

25/41 em outras palavras, as plantas-alvo para aumento de produção de biomassa não são particularmente limitadas. Especificamente, pode-se esperar que qualquer planta tenha os efeitos de aumento da produção de biomassa pela introdução do gene CC-NBS-LRR acima nelas. Exemplos de plantas-alvo incluem, mas não se limitam a, dicotiledôneas e monocotiledôneas, tais como plantas que pertencem às famílias Brassicaceae, Gramineae, Solanaceae, Leguminosae, Salicaceae, e similares (vide abaixo).

Família Brassicaceae: Arabidopsis thaliana, semente oleaginosa de colza (Brassica rapa, Brassica napus), repolho (Brassica oleracea var. capitata), colza (Brassica rapa, Brassica napus), mostarda (Brassica rapa, Brassica napus), repolho chinês (Brassica rapa var. pekinensis), ging-gengcai (Brassica rapa var. chinensis), nabo (Brassica rapa var. rapa), nabo verde (Brassica rapa var. hakabura), erva mostarda (Brassica rapa var. lancinifolia), Komatsuna (Brassica rapa var. peruviridis), pak choi (Brassica rapa var. chinensis), daikon (Brassica Raphanus sativus), raiz forte japonesa (Wasabia japonica), e similares.

Família Solanaceae: tabaco (Nicotiana tabacum), beringela (Solanum melongena), batata (Solaneum tuberosum), tomate (Lycopersicon lycopersicum), pimenta chilli (Capsicum annuum), petunia (Petunia), e similares.

Família Leguminosae: soja (Glycine max), ervilha (Pisum sativum), fava (Vicia faba), Wisteria (Wisteria floribunda), amendoim (Arachis hypogaea), comichão (Lotus comiculatus var. japonicus), feijão comum (Phaseolus vulgarís), feijão azuki (Vigna angularis), acácia (Acacia), e similares.

Família Asteraceae: crisântemo (Chrysanthemum morifolium), girassol (Helianthus annuus), e similares.

Família Arecaceae: palmeira de óleo (Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), coco (Cocos nucifera), tamareira (Phoenix dactylifera), copernicia (Copemicia), e similares.

Família Anacardiaceae: árvore de cera (Rhus succedanea), castanha de caju (Anacardium occidentale), árvore da laca (Toxicodendron ver26/41 nicifluum), manga (Mangifera indica), pistache (Pistacia vera), e similares.

Família Cucurbitaceae'. abóbora (Cucurbita maxima, Cucurbita moschata, Cucurbita pepo), pepino (Cucumis sativus), abóbora serpente (Trichosanthes cucumeroides), abóbora d'água (Lagenaria siceraria var. gourda), e similares.

Família Rosaceae'. amêndoa (Amygdalus communis), rosa (Rosa), morango (Fragaria), cereja (Prunus), maçã (Malus pumila var. domestica), e similares.

Família Caryophyllaceae: cravo (Dianthus caryophyllus) e similares.

Família Salicaceae: choupo (Populus tríchocarpa, Populus nigra, ou Populus tremula) e similares.

Família Gramineae: milho (Zea mays), arroz (Oryza sativa), cevada (Hordeum vulgare), trigo (Triticum aestivum), bambu (Phyllostachys), cana-de-açúcar (Saccharum officinarum), capim napier (Pennisetum pupureum), erianthus (Erianthus ravenae), miscanthus (Japanese silver grass) (Miscanthus virgatum), sorgo (Sorghum) e gramínea do tipo switchgrass (Panicum), e similares.

Família Liliaceae: tulipa (Tulipa), lírio (Lilium), e similares.

Destes exemplo, cultivos para geração de energia, tais como cana-de-açúcar, milho, colza, e girassol, que podem servir como matériasprimas para biocombustíveis, podem ser alvos preferíveis. Isto é porque os custos de biocombustíveis como, bioetanol, biodiesel, biometanol, bioDME, bioGTL (BTL), e biobutanol podem ser reduzidos mediante o aumento da produção de biomassa com o uso de cultivos para geração de energia.

Além disso, conforme descrito acima, os genes CC-NBS-LRR que podem ser usados na presente invenção podem ser isolados de várias plantas e usados. Estes genes CC-NBS-LRR podem ser adequadamente selecionados e usados, dependendo dos tipos de plantas-alvo para o aumento da produção de biomassa. Especificamente, quando uma planta que se deseja aumentar a produção de biomassa é uma monocotiledônea, um gene CC-NBS-LRR que foi isolado de uma monocotiledônea é introduzido,

27/41 de preferência.

Além disso, na presente invenção, mesmo quando uma planta que se deseja aumentar a produção de biomassa é uma monocotiledônea, um gene CC-NBS-LRR derivado de dicotiledônea pode ser introduzido. Especificamente, por exemplo, o gene CC-NBS-LRR derivado de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 4) pode ser introduzido não apenas em dicotiledôneas, mas também em uma variedade de plantas que são classificadas como monocotiledôneas.

Outras etapas e métodos

Após a transformação acima, uma etapa de seleção dos transformantes apropriados a partir das plantas pode ser realizada por um método convencionalmente conhecido. Este método de seleção não é particularmente limitado. Por exemplo, a seleção pode ser feita com base em resistência a medicamentos, tal como, resistência à higromicina. Alternativamente, após o crescimento dos transformantes, um transformante com um aumento significativo na produção de biomassa em comparação a uma planta do tipo selvagem pode ser selecionado pela determinação do peso de uma planta em si ou seu órgão ou tecido arbitrário.

Além disso, as plantas de progênie podem ser obtidas a partir das plantas transformadas obtidas por transformação de acordo com um método convencional. As plantas de progênie que retêm uma característica na qual o gene CC-NBS-LRR foi introduzido ou na qual uma região de controle de expressão do gene CC-NBS-LRR que é apresentado de forma endógena foi alterado são selecionadas com base nas suas quantidades de biomassa. Portanto, pode ser produzida uma linhagem de planta estável capaz de exercer a produção aumentada de biomassa por ter a característica acima. Ainda, as células de planta ou materiais reprodutivos, tais como, sementes, frutas, estoques, calos, tubérculos, espigas cortadas, ou agregados (lumps), podem ser obtidos a partir de uma planta transformada ou uma planta descendente da mesma. Uma linhagem de planta estável capaz de exercer a produção aumentada de biomassa por ter a característica acima pode ser produzida em massa a partir destas células ou materiais.

28/41

Ademais, a planta da presente invenção pode incluir uma matéria que compreende pelo menos qualquer um dentre uma planta adulta, células de planta, tecido de planta, calos, e sementes. Isto é, de acordo com a presente invenção, qualquer matéria em um estado que permita que ela eventualmente cresça para se tornar uma planta pode ser considerada como uma planta. Além disso, as células de planta acima incluem células de planta em várias formas. Exemplos destas células de planta incluem células cultivadas em suspensão, protoplastos, e seções de folha. Como um resultado da proliferação/diferenciação destas células de planta, uma planta pode ser obtida. Além disso, uma planta pode ser reproduzida a partir de células de planta através de um método convencionalmente conhecido dependendo dos tipos de células de planta.

Conforme explicado acima, de acordo com a presente invenção, plantas capazes de exercer produção significativamente aumentada de biomassa por planta, em comparação a plantas do tipo selvagem e que possuem resistência ao estresse salino podem ser fornecidas através da introdução de um gene CC-NBS-LRR que compreende as sequências comuns específicas acima ou alteração de uma região de controle de expressão do gene que é apresentado de forma endógena na mesma. Aqui, o termo produção de biomassa significativamente aumentada refere-se a uma situação na qual o peso total de cada planta é estatisticamente significativamente aumentado em comparação ao mesmo de uma planta selvagem. Nesse caso, mesmo quando alguns tecidos de planta se tornam especificamente grandes e os tamanhos dos outros tecidos são equivalentes aos de uma planta selvagem, conclui-se que a produção de biomassa é aumentada caso o peso total da planta inteira seja maior. Além disso, o termo resistência ao estresse salino refere-se a uma situação na qual o limite superior da concentração de sal na qual a planta pode crescer é significativamente maior que no caso de uma planta do tipo selvagem. Em outras palavras, o termo resistência ao estresse salino refere-se a uma situação na qual uma planta não experimenta crescimento insuficiente ou morte causada por murchamento mesmo que a concentração de sal em um ambiente de crescimento,

29/41 como o solo ou meio, seja suficientemente alta para fazer com que uma planta do tipo selvagem sofra crescimento insuficiente ou morte por murchamento. Especificamente, uma planta na qual o gene CC-NBS-LRR compreendendo as sequências comuns específicas acima foi introduzido ou na qual uma região de controle de expressão do gene CC-NBS-LRR que é apresentado de forma endógena foi alterada pode exibir resistência ao estresse salino e, desta forma, pode crescer em um meio com uma concentração de sal de 300 mM, de preferência 250 mM, com mais preferência 200 mM e, com a máxima preferência, 150 mM.

De acordo com a presente invenção, a produção de biomassa pelas plantas é aumentada. Então, o aprimoramento na produtividade pode ser obtido nos seguintes casos: um caso no qual um objetivo é produzir a planta inteira; e um caso no qual um objetivo é produzir alguns tecidos da planta (por exemplo, sementes) ou componentes contidos nas plantas. Por exemplo, quando um objetivo é produzir gorduras e óleos contidos em sementes de plantas, as quantidades de gorduras e óleos que podem ser coletadas por área sob cultivo podem ser muito melhoradas. Aqui, exemplos de gorduras e óleos incluem, mas não são particularmente limitados a, gorduras e óleos derivados de plantas, tais como óleo de soja, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de coco, óleo de arroz, óleo de caroço de algodão, óleo de girassol, óleo de milho, óleo de açafrão, e óleo de semente de colza. Adicionalmente, as gorduras e óleos assim produzidos podem ser amplamente usados para usos domésticos ou usos industriais e podem ser usados adicionalmente como matérias-primas para combustível biodiesel. Portanto, de acordo com a presente invenção, as gorduras e óleos acima para usos domésticos ou usos industriais, combustível biodiesel, e similares podem ser produzidas com baixo custo com o uso de plantas nas quais o gene CCNBS-LRR acima foi introduzido ou nas quais uma região de controle de expressão do gene que é apresentado de forma endógena foi alterada.

Adicionalmente, de acordo com a presente invenção, a resistência ao estresse salino de uma planta é aprimorada, permitindo crescimento da planta em solo com uma alta concentração de sal que não permitiria que

30/41 uma planta do tipo selvagem crescesse. Um exemplo de solo com uma alta concentração de sal é o solo coletado em uma área costeira. O uso deste solo permite o plantio em solo que foi considerado indisponível para plantio. Consequentemente, pode-se obter alta produção de uma planta com os efeitos acima de aumento da produção de biomassa. Além disso, também em um caso no qual um produto de interesse é gordura e/ou óleo contidos nas sementes da planta, pode-se obter alta produção com o uso de solo com uma alta concentração de sal. Além disso, as gorduras e óleos acima usados para usos domésticos ou usos industriais, combustível biodiesel e similares podem ser produzidos com baixo custo.

Exemplos

A presente invenção é descrita daqui em diante em maiores detalhes com referência aos seguintes exemplos, embora o escopo técnico da presente invenção não esteja limitado a eles.

Exemplo 1 1: Materiais e métodos

1-1. Materiais experimentais

Como materiais experimentais, sementes de mutantes de Arabidopsis thaliana (linhagens com marcador de ativação: linhagens Weigel TDNA, Total de 20072 linhagens) foram usadas. Além disso, as sementes foram compradas junto à Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC). Com relação às sementes usadas como materiais experimentais, pode ser feita referência a Weigel, D. etal, Plant Physiol. 122, 1003-1013 (2000).

1-2. Métodos

1-2-1. Seleção de mutantes resistentes a sal

Sementes das linhagens de T-DNA Weigel foram cultivadas assepticamente em meio de ágar (1%) MS modificado contendo 125 mM ou 150 mM de NaCl [vitaminas em meio B5, 10 g/l de sacarose, e 8 g/L de ágar (para meio bacteriano; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] e, então, cultivadas a 22°C sob 30 a 100 μmol/m²/seg de iluminação (um ciclo de 16 horas na luz/8 horas no escuro). Duas a quatro semanas após a semeadura, os mutantes resistentes a sal candidatos foram selecionados. Além disso, com relação ao meio MS, vide Murashige, T. et al. (1962) Physiol. Plant., 15, 47331/41

497. Ainda, com relação ao meio B5, vide Gamborg, O. L. et al. (1968) Experimental Cell Research 50, 151-158.

1-2-2. Preparação de DNA

Um local para inserção de T-DNA no genoma da linhagem de Arabidopsis thaliana resistente a sal assim selecionada foi determinada por um método de TAIL-PCR. Primeiro, folhas jovens foram coletadas a partir das plantas de Arabidopsis thaliana cultivadas e, então, esmagadas sob congelamento com nitrogênio líquido. O DNA foi preparado com o uso de um kit de preparação de DNA (DNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN) de acordo com os protocolos padrão incluídos com o kit.

-2-3. Método de TAIL-PCR e previsão do sítio de inserção de T-DNA

Foi determinado que três tipos de iniciadores específicos, TL1, TL2, e TL3, estariam localizados próximo da sequência de T-DNA esquerda (borda esquerda de T-DNA) de um vetor de marcação de ativação (pSKI015: n° de Acesso no Genbank AF187951) usado nas linhagens de T-DNA Weigel. Com o uso de um iniciador arbitrário P1 e das seguintes soluções de reação de PCR e condições de reação, o TAIL-PCR (supervisores, Isao Shimamoto e Takuji Sasaki, Nova Edição, Plant PCR Experimental Protocols, 2000, pp. 83-89, Shujunsha, Tóquio, Japão; Genomics 25, 674-681, 1995; Plant J., 8, 457-463, 1995) foi realizado para que o DNA genômico adjacente ao T-DNA fosse amplificado.

As sequências específicas dos iniciadores TL1, TL2, TL3, e P1 são as seguintes.

TL1: 5'-TGC TTT CGC CAT TAA ATA GCG ACG G-3' (SEQ ID NO: 6)

TL2: 5'-CGC TGC GGA CAT CTA CAT TTT TG-3' (SEQ ID NO: 7)

TL3: 5'-TCC CGG ACA TGA AGC CAT TTA C-3' (SEQ ID NO: 8)

P1: 5'-NGT CGA SWG ANA WGA A-3' (SEQ ID NO: 9)

Além disso, na SEQ ID NO: 9, n representa a, g, c, ou t (locais: 1 e 11), s representa g ou c (local: 7), e w representa a ou t (local: 8 e 13).

A composição da solução e condições de reação da 1^a reação de PCR são mostradas na tabela 1 e na tabela 2, respectivamente.

32/41

Tabela 1

Molde (DNA genômico) tampão de PCR 10 x (Takara Bio)

2,5 mM de dNTPs (Takara Bio)

1° iniciador específico (TL1: SEQ ID NO: 6)

Iniciador arbitrário P1 (SEQ ID NO: 9) TaKaRa Ex Taq (Takara Bio) ng 2 μΙ 1,6 μΙ 0,5 pmol

100 pmol 1,0 unidade

Volume total μΙ

Tabela 2 #1: 94°C (30 segundos)/95°C (30 segundos) #2: 5 ciclos de 94°C (30 segundos)/65°C (30 segundos)/72°C (1 minuto) #3: 1 ciclo de 94°C (30 segundos)/25°C (1 minuto) aumento para 72°C dentro de 3 minutos/72°C (3 minutos)

94°C (15 segundos)/65°C (30 segundos)/72°C (1 minuto),

94°C (15 segundos)/68°C (30 segundos)/72°C (1 minuto), e 15 ciclos de 94°C (15 segundos)/44°C (30 segundos)/72°C (1 minuto) #5: 72°C (3 minutos)

A composição da solução e condições de reação da 2^a reação de PCR são mostradas na tabela 3 e na tabela 4, respectivamente. 5 Tabela 3

Molde (diluição de 50 vezes do 1° produto de PCR) tampão de PCR 10 x (Takara Bio)

2,5 mM de dNTPs (Takara Bio)

2° iniciador específico (TL2: SEQ ID NO: 7) Iniciador arbitrário P1 (SEQ ID NO: 9)

TaKaRa Ex Taq (Takara Bio) : 1 μΙ : 2 μΙ : 1,5 μΙ : 5 pmol : 100 pmol : 0,8 unidade

Volume total μΙ

33/41

Tabela 4

94°C (15 segundos)/64°C (30 segundos)/72°C (1 minuto),

94°C (15 segundos)/64°C (30 segundos)/72°C (1 minuto), e 12 ciclos de 94°C (15 segundos)/44°C (30 segundos)/72°C (1 minuto) #5: 72°C (5 minutos)

A composição da solução e condições de reação da 3^a reação de PCR são mostradas na tabela 5 e na tabela 6, respectivamente.

Tabela 5

Molde (diluição 50 vezes do 2° produto de PCR) : 1 μ| tampão de PCR 10 x (Takara Bio) : 5 μΙ

2,5 mM de dNTPs (Takara Bio) : 0,5 μΙ

3° iniciador específico (TL3: SEQ ID NO: 8) : 10 pmol

Iniciador arbitrário P1 (SEQ ID NO: 9) : 100 pmol

TaKaRa Ex Taq (Takara Bio) : 1,5 unidades

Volume total 50 μΙ

Tabela 6 ciclos de

94°C (30 segundos)/44°C (30 segundos)/72°C (1 minuto) #5: 72°C (3 minutos)

Subsequentemente, o 2° e o 3° produtos de reação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose e, então, a presença ou a ausência de amplificação e a especificidade dos produtos de reação foram confirmadas. Além disso, os 3° produtos de amplificação foram submetidos a uma reação de sequenciamento usando diretamente um kit BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit Ver. 3. 1 (Applied Biosystems) e o iniciador específico TL3. Desta forma, as sequências de nucleotídeo foram determinadas com o uso de um equipamento ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Como um resultado, 5 diferentes sequências de nucleotídeo foram determinadas. Especificamente, a informação de sequência de 538-bp, a informação de sequência de 311-bp, a informação de sequência de 498bp, a informação de sequência de 633-bp, e a informação de sequência de

34/41

448-bp foram obtidas. As sequências obtidas são mostradas nas SEQ ID NOS: 10 a 14.

O Arabidopsis Information Resource (TAIR: http:

//www.arabidopsis.org/) foi submetido a uma pesquisa BLAST para a informação de sequência obtida. Desta forma, os sítios de inserção de T-DNA foram observados na seguinte ordem: um sítio entre o gene do cromossomo de Arabidopsis [código AGI (The Arabidopsis Genome Initiative gene code): At1g69990] e o gene [código AGI (The Arabidopsis Genome Initiative gene code): At1g70000]; um sítio do gene do cromossomo 5 de Arabidopsis [código AGI (The Arabidopsis Genome Initiative gene code): At5g39400]; um sítio do gene do cromossomo 3 de Arabidopsis [código AGI (The Arabidopsis Genome Initiative gene code): At3g05630]; um sítio do gene do cromossomo de Arabidopsis [AGI (The Arabidopsis Genome Initiative gene code): At2g33110]; e um sítio do gene do cromossomo 1 de Arabidopsis [código AGI (The Arabidopsis Genome Initiative gene code): At1g58520].

1-2-4. Previsão dos genes ativados

Os genes ativados foram previstos com base nas sequências dos genes da suposta fase aberta de leitura (ORF) existente em faixas de 10-Kb próximas aos respectivos sítios de inserção de T-DNA (o sítio entre At1g69990 e At1g70000, e o sítio de At5g39400, o sítio de At3g05630, o sítio de At2g33110, e o sítio de At1g58520) revelados no item 1-2-3 acima.

-2-5. Preparação de mutantes através da introdução dos genes previstos

Para amplificação dos fragmentos contendo as regiões de ORF do gene LRR-RLK (proteína quinase semelhante a receptor com repetições ricas em leucina) (AT1G69990), o gene LRR-RLK (proteína quinase semelhante a receptor com repetições ricas em leucina) (AT5G39390), o gene da proteína LRR (repetições ricas em leucina) (AT3G05650), e o gene da proteína LRR (repetições ricas em leucina) (AT2G33080) que foram previstos como estando ativados no item 1-2-4, um par de iniciadores de PCR foi desenhado e sintetizado para cada fragmento com base na informação de sequência apresentada no TAIR (http://www.arabidopsis.org/home.html) (Tabela 7). Além disso, cada par de iniciadores foi desenhado para que um sítio de

35/41 enzima de restrição necessário para a introdução nos vetores de expressão fosse adicionado a cada iniciador (Tabela 7).

Tabela 7

Gene	Direto	Reverso	Sítio de enzima de restrição
AT1G69990	5'-ACG CGT CGA CCC ATC ATG AAA ACG ATC TCA ATC TTC TTC GTC-3' (SEQ ID NO: 15)	5-TGTACATGT ACAAGT GAG AAC GGTAGATAAGTA AGT GG-3' (SEQ ID NO: 16)	Sal I	BsrG I
AT5G39390	5'-ACG CGT CGA CCAAAC GAC GTA TCT CATAAG TCG ACG CA-3' (SEQ ID NO: 17)	5-TGTACATGT ACA GGA GAA CTT TGAAGATCATCG AGA GG-3' (SEQ ID NO: 18)	Sal I	BsrG I
AT3G05650	5-ACG CGT CGA CCC ATC ACA CAC ACATAC ACA CAC3' (SEQ ID NO: 19)	5'-TGTACATGT ACA CAG CGT AAA TGA AGA ACA CCC CAAACT GAA C-3' (SEQ ID NO: 20)	Sal I	BsrG I
AT2G33080	5'-ACG CGT CGA CAT GTC AGG ATC ACA TCT GCGTTT GC-3' (SEQ ID NO: 21)	5'-TGTACATGT ACATCAGCA CTT GCT CCT GTT CTT CG-3' (SEQ ID NO: 22)	Sal I	BsrG I

De modo a amplificar um fragmento contendo a região de ORF do gene da proteína CC (enrolada em espiral)-NBS (sítio de ligação de nucleotídeo)-LRR (repetições ricas em leucina) (AT1G58602), três pares de iniciadores foram desenhados e sintetizados com base na informação de sequência apresentada em TAIR (http://www.arabidopsis.org/home.html) (tabela 8). Aqui, dentre os três conjuntos de iniciadores, os iniciadores (Dire10 to 1 e Reverso 3) foram desenhados para que um sítio de enzima de restrição necessário para a introdução nos vetores de expressão fosse adicionado a cada iniciador (tabela 8).

36/41

Tabela 8

Gene	Direto	Reverso	Sítio de enzima de restrição
AT1G58602	Direto 1 5'-ACG CGT CGA CAT GGC AGG GGA ACT TGT GTC GTT TGC-3' (SEQ ID NO: 23)	Reverso 1 5-CCT TCT TCC ATA TGT CGT CGA GG-3' (SEQ ID NO: 24)	Sal I
Direto 2 5-CCT CGA CGA CATATG GAAGAA GG-3' (SEQ ID NO: 25)	Reverso 2 5-CCATATTCC TCC TCA CCA GCT CCT CTATG-3' (SEQ ID NO: 26)
Direto 3 5-CATAGAGGA GCT GGT GAG GAG GAATAT GG-3' (SEQ ID NO: 27)	Reverso 3 5-AAG GAAAAA AGC GGC CGC CTC TGT GAT TGC TGA GAG CAT TCC TAG TCG TCG-3' (SEQ ID NO: 28)		Notl

De acordo com o método descrito em 1-2-2, um DNA molde foi preparado a partir de Arabidopsis thaliana selvagem (ecotipo Col-0). Takara Ex Taq (Takara Bio Inc.) e DNA polimerase Platinum Pfx (Invitrogen) ou DNA polimerase de alta fidelidade Phusion (New England BioLabs: NEB) foram usadas como enzimas e um par de iniciadores mencionados na tabela 7 foram usados como iniciadores. Para a composição da solução da reação de PCR e para as condições reacionais, foi feita referência aos protocolos anexados a cada enzima. Além disso, para o gene da proteína CC-NBS-LRR (AT1G58602), a PCR foi feita com o uso dos três pares de iniciadores listados na tabela 8 e DNA polimerase Platinum Pfx (Invitrogen) como uma enzima para que os três pares de produtos de amplificação por PCR fossem obtidos. Os produtos da amplificação por PCR foram submetidos à eletroforese com gel de agarose a 2% (tampão TAE) e, então, os fragmentos foram corados com brometo de etídio. Um gel contendo fragmentos-alvo foi cortado com o uso de um bisturi. Os fragmentos de DNA alvo foram eluídos e purificados com o uso de um kit de purificação de banda de gel (Amersham) e

37/41 de DNA de PCR GFX. A reação de PCR por sobreposição (overlapping PCR) foi conduzida com o uso dos três fragmentos de DNA como moldes e os iniciadores Direto 1 e Reverso 3.

Tal como no caso acima, cada produto de amplificação por PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose, seguido de corte e purificação. Adenina foi adicionada ao fragmento de DNA assim obtido com o uso de um kit A-Addition (QIAGEN). O DNA amplificado ao qual a adenina foi adicionada foi ligado a um vetor de clonagem TA pCR2.1 com o uso de um kit de clonagem TOPO TA Cloning kit (Invitrogen) e, então, transformado em células competentes (E. coli TOP 10) incluídas com o kit. Após a transformação, as células foram cultivadas em meio LB suplementado com 50 μΙ/ml de canamicina e, então, os transformantes foram selecionados. As colônias que apareceram foram submetidas à cultura líquida em meio LB suplementado com 50 μΙ/ml de canamicina. O DNA do plasmídio foi preparado a partir dos micro-organismos assim obtidos com o uso de um kit Plasmid Mini Kit (QIAGEN).

Um fragmento contendo a ORF do gene LRR-RLK (AT1G69990), um fragmento contendo a ORF do gene LRR-RLK (AT5G39390), um fragmento contendo a ORF do gene da proteína LRR (AT3G05650), um fragmento contendo a ORF do gene da proteína LRR (AT2G33080), e um fragmento contendo a ORF do gene da proteína CCNBS-LRR (AT1G58602) foram clonados separadamente nos vetores, seguido da determinação da sequência de nucleotídeo e análise das sequências. 1-2-6. Construção de vetores de expressão em planta

Fragmentos contendo ORFs do gene LRR-RLK (AT1G69990), do gene LRR-RLK (AT5G39390), do gene da proteína LRR (AT3G05650), do gene da proteína LRR (AT2G33080), e do gene da proteína CC-NBSLRR (AT1G58602) foram inseridos em um vetor de expressão de planta pBI121 contendo uma sequência ômega do vírus do mosaico do tabaco. Desta forma, foram preparados construtos.

Primeiro, o vetor pCR2.1, no qual um fragmento contendo a ORF do gene LRR-RLK (AT1G69990) havia sido clonado em 1-2-5, foi tratado

38/41 com as enzimas de restrição Sai1 e BsrG I.

A seguir, pBI121 similares contendo uma sequência ômega foi tratado com as enzimas de restrição Sa/1 e BsrG I. Os produtos digeridos com estas enzimas de restrição foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. Um fragmento de cerca de 1850 bp contendo a ORF do gene LRR-RLK (AT1G69990) e pBI121 contendo a sequência ômega foi fracionada e purificada do gel com o uso de um kit de purificação de banda de gel (Amersham) e de DNA de PCR GFX.

Para a introdução de um fragmento contendo a ORF do gene LRR-RLK (AT1G69990) com o uso de um fragmento de pBI121 contendo a sequência ômega como um vetor, o vetor e o inserto foram misturados a uma razão de 1 : 10, seguido de uma reação de ligação de um dia para o outro a 16°C com o uso de uma quantidade equivalente de um kit TaKaRa Ligation Kit ver. 2 (Takara Bio Inc.).

A quantidade total da solução de reação foi adicionada a 100 μΙ de células competentes (cepa DH5D de E. coli, TOYOBO), para que a transformação fosse realizada de acordo com os protocolos incluídos no kit. As células foram aplicadas a meio ágar LB suplementado com 50 pg/ml de canamicina e, então, cultivadas de um dia para o outro. As colônias que apareceram foram submetidas à cultura líquida em meio LB suplementado com 50 pg/ml de canamicina. O DNA do plasmídio foi preparado a partir dos microorganismos assim obtidos com o uso de um kit Plasmid Mini Kit (QIAGEN).

O fragmento assim obtido contendo a ORF do gene LRR-RLK (AT1G69990) foi subclonado em um vetor de expressão, seguido da determinação das sequências de nucleotídeo e análise das sequências.

O gene LRR-RLK (AT5G39390) e o gene da proteína LRR (AT2G33080) foram incorporados nos vetores de expressão da maneira acima descrita com a exceção de que os iniciadores listados na tabela 7 foram usados, seguido de determinação da sequência de nucleotídeo e análise de sequência. O gene da proteína LRR (AT3G05650) foi clonado em um vetor TA-Cloning pCR2.1, tratado com uma enzima de restrição EcoR I , e extremidade foi cortada com um kit DNA Blunting Kit (Takara Bio Inc.), se39/41 guido de tratamento com fenol clorofórmio e, então, com uma enzima de restrição Bs/G I. pBI121 contendo a sequência ômega foi tratado com uma enzima de restrição Sal I e a extremidade foi cortada com um kit DNA Blunting Kit (Takara Bio Inc.), seguido de tratamento com fenol clorofórmio e, então, com uma enzima de restrição BsrG I. Cada gene foi incorporado em um vetor de expressão da maneira acima descrita, seguido de determinação de sequência de nucleotídeo e análise de sequência. O gene da proteína CCNBS-LRR (AT1G58602) foi tratado com uma enzima de restrição Not I e a extremidade foi cortada com um kit DNA Blunting Kit (Takara Bio Inc.), seguido de tratamento com fenol clorofórmio e, então, com uma enzima de restrição Sal I. De modo similar, pB1121 contendo a sequência ômega foi tratado com uma enzima de restrição BsrG I e a extremidade foi cortada com um kit DNA Blunting Kit (Takara Bio Inc.), seguido de tratamento com fenol clorofórmio e, então, com uma enzima de restrição Sal I. Cada gene foi incorporado em um vetor de expressão da maneira acima descrita, seguido de determinação de sequência de nucleotídeo e análise de sequência.

-2-7. Introdução de gene em Arabidopsis thaliana com o uso de método de

Agrobacterium

Cada vetor de expressão de planta construído em 1-2-6 foi introduzido na cepa C58C1 de Agrobacterium tumefaciens por eletroporação (Plant Molecular Biology Manual, Segunda Edição, B. G. Stanton, A. S. Robbert, Kluwer Academic Publishers, 1994). Subsequentemente, o Agrobacterium tumefaciens no qual o vetor de expressão de planta foi introduzido foi introduzido em Arabidopsis thaliana selvagem (ecotipo Col-0) por um método de infiltração descrito por Clough et al. (Plant J., 16, 735-743, 1998)

Os transformantes foram selecionados com o uso de meio contendo canamicina. Plantas da geração T2 foram produzidas por autopolinização a partir dos transformantes.

1-2-8. Confirmação do fenótipo do transformante

Teste de resistência a condições salinas:

As sementes preparadas em 1-2-7 e as sementes de uma planta do tipo selvagem não recombinante {Arabidopsis thaliana) usadas como um

40/41 controle foram semeadas assepticamente em meio de ágar MS contendo 150 mM de NaCI. Elas foram cultivadas sob condições de 22°C e 16 horas na luz/8 horas no escuro, e com uma intensidade de luz na faixa de cerca de 30 to 45 μΕ/cm², por 10 dias, seguido pelo teste de resistência a condições salinas.

Determinação da quantidade de biomassa:

As sementes T2 produzidas em 1-2-7 foram semeadas assepticamente sobre meio de ágar MS suplementado com 50 mg/L de canamicina e 0,5% de sacarose e replantadas em um vaso com um diâmetro de 50 mm contendo solo misturado com vermiculita 2 semanas após a semeadura. Como um controle, as sementes de uma planta não recombinante (Arabidopsis thaliana) foram semeadas assepticamente sobre meio de ágar MS suplementado com 0,5% de sacarose e, então, foram replantadas da maneira supracitada. As plantas resultantes foram cultivadas sob condições de 23°C e 8 horas na luz/16 horas no escuro (condições de dia curto), e com uma intensidade de luz de aproximadamente 160 μΕ/cm² durante 6 semanas no total após o replantio. Após o cultivo, as partes aéreas das plantas foram colocadas em bolsas de papel e secas sob condições de 22°C e umidade de 60% por 2 semanas. A seguir, a quantidade total de biomassa foi determinada por uma escala eletrônica.

2. Resultados

A figura 2 é uma foto de uma placa para a planta do tipo selvagem e uma foto de uma placa para a planta transformada nas quais foi introduzido um fragmento contendo a ORF do gene da proteína CC-NBS-LRR (AT1G58602). As fotografias indicam os resultados do teste de resistência a condições salinas descritos em 1-2-8 acima. A figura 2 mostra que a planta transformada na qual introduzido um fragmento contendo a ORF do gene da proteína CC-NBS-LRR (AT1G58602) germinou e cresceu em um meio com uma alta concentração de sal. Os resultados revelaram que a planta transformada exibiu aprimoramento em relação à planta do tipo selvagem em termos de resistência a condições salinas.

Além disso, a figura 3 é uma foto mostrando as partes aéreas de

41/41 plantas do tipo selvagem e plantas transformadas nas quais foi introduzido um fragmento contendo a ORF do gene da proteína CC-NBS-LRR (AT1G58602). A fotografia indica os resultados da determinação da quantidade de biomassa obtida em 1-2-8 acima. Adicionalmente, a figura 4 mostra os resultados obtidos pela determinação da quantidade total de biomassa nas partes aéreas da planta do tipo selvagem, da planta transformada na qual o gene da proteína LRR-RLK (AT1G69990) foi introduzido, da planta transformada na qual o gene da proteína LRR-RLK (AT5G39390) foi introduzido, da planta transformada na qual o gene da proteína LRR (AT3G05650) foi introduzido, da planta transformada na qual o gene da proteína LRR (AT2G33080) foi introduzido, e da planta transformada na qual o gene da proteína CC-NBS-LRR (AT1G58602) foi introduzido.

As figuras 3 e 4 revelaram que, no caso de uma planta transformada na qual um fragmento contendo a ORF do gene da proteína CC-NBS15 LRR (AT1G58602) havia sido introduzido, a quantidade total de biomassa na parte aérea foi drasticamente aumentada (aproximadamente 1,5 vezes maior) em relação a uma planta do tipo selvagem. Por outro lado, no caso de uma planta transformada na qual foi introduzido o gene LRR-RLK (AT1G69990), o gene LRR-RLK (AT5G39390), o gene da proteína LRR (AT3G05650), ou o gene da proteína LRR (AT2G33080), a quantidade de biomassa encontrada foi substancialmente comparável àquela no caso de uma planta do tipo selvagem.

Os resultados acima revelaram que uma planta na qual o gene AT1G58602 foi introduzido tem resistência ao estresse salino e uma quanti25 dade significativamente aumentada de biomassa.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados na presente invenção estão aqui incorporados a título de referência em suas totalidades.

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Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para aumentar a produção de biomassa e conferir resistência ao estresse salino a uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir em uma planta um gene apresentando uma sequên5 cia de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4.
2. 2. Método de produção de planta, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: preparar uma planta transformada na qual foi introduzido um gene apresentando uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 e determinar a quantidade de biomassa e resistência ao estresse sali10 no de uma planta de progênie da planta transformada e selecionar uma linhagem que exibe uma quantidade significativamente aumentada de biomassa e resistência ao estresse salino.

   Petição 870180014925, de 23/02/2018, pág. 7/13

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