CN113061619B - 与烟气苯酚释放量相关的突变基因TyrA - Google Patents

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Abstract

本发明属于烟草生物技术领域，具体涉及若干与烟气苯酚释放量相关的突变基因序列。与烟气苯酚释放量相关的突变基因TyrA为烟草阿罗酸脱氢酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO.3所示。本申请中，发明人通过对烟草DHQ‑SDH1、TyrA基因的进一步研究，发现这两个基因与烟草酪氨酸和烟气苯酚释放量含量高度相关。基于此发现，进一步结合Tilling筛选技术，通过分析预测编码蛋白发生的有义突变，进行蛋白三级结构预测，同时结合实际大田实验验证，结果表明，这两个基因突变后，烟草中酪氨酸含量和烟气苯酚释放量发生了明显降低。基于这些研究结果，可为烟草低苯酚含量烟叶新品种培育奠定一定理论基础和技术基础。

Description

与烟气苯酚释放量相关的突变基因TyrA
技术领域
本发明属于烟草生物技术领域，具体涉及若干与烟气苯酚释放量相关的突变基因序列。
背景技术
苯酚作为烟气中主要有害成分之一，其随烟气吸入后会快速分布到所有组织中，具有显著的黏膜渗透性，会导致组织坏死和腐蚀脱落。因此从降低烟草吸食危害性角度而言，需要重点控制烟气中苯酚含量。
已有研究表明，烟叶蛋白质、游离酪氨酸（Tyr）和绿原酸（CGA）等是烟气苯酚的主要前体物。Tyr（酪氨酸）作为植物体内酚基的源头，在植物体内多以蛋白质形式储存在根、茎和叶中。现有研究表明，植物中Tyr前体物在阿罗酸脱氢酶(arogenate dehydrogenase,TyrA)的作用下可以生成游离Tyr。另一方面，Tyr作为芳香族氨基酸(AAA)一种，又与植物体内AAA的生物合成途径莽草酸途径紧密相关。在莽草酸途径中，脱氢奎尼酸脱氢酶（3-Dehydroquinate dehydratase，DHQ）和莽草酸脱氢酶（Shikimate dehydrogenase, SDH）可融合形成双功能酶（DHQ-SDH），进而参与催化莽草酸的生成。研究发现烟草DHQ-SDH1的一系列RNAi烟草株系表现出不同的表型；其沉默程度为40-60%的时候，下游芳香族代谢物稍微减少，烟草未表现出显著的表型；而其沉默程度为60-85%的时候，下游芳香族代谢物显著减少，烟草表现出略微的矮化表型（Ding L et al. Functional analysis of theessential bifunctional tobacco enzyme 3-dehydroquinate dehydratase/shikimatedehydrogenase in transgenic tobacco plants. Journal of Experimental Botany,2007）。进一步研究发现，玉米具有4个ZmTyrA基因成员，4个成员的表达模式各不相同，其中ZmTyrA1的突变造成芳香族氨基酸氨基酸含量下降（Holding DR et al. Identificationand characterization of the maize arogenate dehydrogenase gene family.Journal of experimental botany, 2010）。这表明，DHQ-SDH1和TyrA作为基因工程改造的靶标基因较为合适。因此，基于这些生物学研究，如果能通过相关生物技术对烟草相关前体物含量进行控制，则有可能有效地和较为根本性的降低烟气中苯酚释放量。
发明内容
基于TILLING（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes，定向诱导基因突变）技术，本申请目的在于提供若干与苯酚前体物相关的突变后基因序列，从而为相关低苯酚释放量烟草新品种培育奠定一定技术基础。
本申请所提供的技术方案详述如下。
与烟气苯酚释放量相关的突变基因DHQ-SDH1，所述突变基因DHQ-SDH1为烟草脱氢奎尼酸脱氢酶/莽草酸脱氢酶突变基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其中特异性核酸片段为24-1530位碱基；
所述烟草脱氢奎尼酸脱氢酶/莽草酸脱氢酶突变基因（DHQ-SDH1）所编码的烟草DHQ-SHD1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其由515个氨基酸残基组成，其中第8-510位氨基酸是保守的3-脱氢奎宁酸脱水酶/莽草酸脱氢酶结构域。
所述烟草脱氢奎尼酸脱氢酶/莽草酸脱氢酶突变基因DHQ-SDH1，相较于野生型，具体CDS序列及对应的氨基酸序列突变位点参考如下：
A262G→K88E，G286A→E96K，G295A→E99K，G298A→V100I，G307A→E103K，G317A→C106Y，G445A→G149R，C637T→P213S，C647T→P216L，A863G→D288G。
与烟气苯酚释放量相关的突变基因TyrA，所述突变基因TyrA为烟草阿罗酸脱氢酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO.3所示，其中特异性核酸片段为1-708位碱基；
所述烟草阿罗酸脱氢酶基因TyrA所编码的烟草TyrA蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，其由243个氨基酸残基组成，其中第1-236位氨基酸是NADB_Rossmann超家族保守结构域。
所述烟草阿罗酸脱氢酶基因TyrA，较于野生型，具体CDS序列及对应的氨基酸序列突变位点参考如下：G118A→E40K，G185A→C62Y，C217T→L73F，G229A→E77K，C404T→S135L，C485T→T162I。
所述烟草脱氢奎尼酸脱氢酶/莽草酸脱氢酶突变基因（DHQ-SDH1）或烟草DHQ-SHD1蛋白在烟草叶片酪氨酸物质含量或烟气苯酚释放量调控中的应用，烟草DHQ-SHD1蛋白与植物叶片中酪氨酸含量和烟气苯酚释放量相关，降低该蛋白表达量后，叶片中酪氨酸含量和烟气苯酚释放量明显降低；利用生物技术方法，通过调节烟草DHQ-SDH1基因表达量，进而调节烟草DHQ-SHD1蛋白表达量，可以调节和控制烟叶中酪氨酸物质含量和烟气苯酚释放量。
所述烟草阿罗酸脱氢酶突变基因或烟草TyrA在烟草叶片酪氨酸物质含量或烟气苯酚释放量调控中的应用，烟草TyrA蛋白与植物叶片中酪氨酸含量和烟气苯酚释放量相关，降低该蛋白表达量后，叶片中酪氨酸含量和烟气苯酚释放量明显降低；利用生物技术方法，通过调节烟草TyrA基因表达量，进而调节烟草TyrA蛋白表达量，可以调节和控制烟叶中酪氨酸物质含量和烟气苯酚释放量。
利用所述烟草脱氢奎尼酸脱氢酶/莽草酸脱氢酶突变基因（DHQ-SDH1）的烟草新品种培育方法，通过基因突变技术、转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有DHQ-SDH1基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得酪氨酸含量和烟气苯酚释放量降低的烟草新品种。
利用所述烟草阿罗酸脱氢酶突变基因（TyrA）的烟草新品种培育方法，通过基因突变技术、转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有TyrA基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得酪氨酸含量和烟气苯酚释放量降低的烟草新品种。
一种烟草tyra/dhq-sdh1双突变体的烟草新品种培育方法，以含有突变基因TyrA的烟草和含有突变基因DHQ-SDH1烟草为亲本，通过遗传杂交的方式，筛选获得烟草tyra/dhq-sdh1双突变体纯合体；
所述突变基因TyrA，相较于野生型，该突变体中TyrA基因的第217个碱基发生C→T突变，相应第73个氨基氨酸发生L→F突变；
所述突变基因DHQ-SDH1，相较于野生型，该突变体中DHQ-SDH1基因的第863个碱基发生A→G突变，相应第288个氨基氨酸发生D→G突变；
具体而言：
同时播种烟草tyra和dhq-sdh1突变体，并进行培育；
在开花期时进行遗传杂交，具体杂交时：以dhq-sdh1突变体为母本，去除多余的花苞，选取未开放的花苞，去除雄蕊，采集tyra突变体的花粉将其涂抹到dhq-sdh1突变体雌蕊的柱头上，然后套袋留种；待杂交后的种子成熟后，收种；
优选地，通过多代播种筛选方式以确保纯合性，具体而言：
播种F1代后约30天，提取烟草的DNA进行测序，同时含有TyrA和DHQ-SDH1突变的留种；
播种F2代后约30天，提取烟草的DNA进行测序，同时含有TyrA和DHQ-SDH1突变的留种；
播种F3代后约30天，提取烟草的DNA进行测序，确定F2后代留种的tyra/dhq-sdh1双突变，以此作为最终的tyra/dhq-sdh1双突变体纯合体。
已有研究表明，烟草DHQ-SDH1基因家族包含多个家族成员，在多个植物器官中均有表达，但不同成员的功能不同，部分基因表达量与植株表型变化有一定相关性（张林等,普通烟草DHD-SDH基因家族分析，烟草科技，2018；Ding L et al，Functional analysis ofthe essential bifunctional tobacco enzyme 3-dehydroquinate dehydratase/shikimate dehydrogenase in transgenic tobacco plants，Journal of ExperimentalBotany, 2007）。而不同物种中TyrA蛋白数量及表达模式均有所不同（Rippert P et.al，Purification and kinetic analysis of the two recombinant arogenatedehydrogenase isoforms of Arabidopsis thaliana，European journal ofbiochemistry，2002；Holding DR et.al， Identification and characterization ofthe maize arogenate dehydrogenase gene family，Journal of experimental botany，2010）。
基于已有研究，本申请中，发明人通过对烟草DHQ-SDH1、TyrA基因的进一步研究，发现这两个基因与烟草酪氨酸和烟气苯酚释放量含量高度相关。基于此发现，进一步结合Tilling 筛选技术，通过分析预测编码蛋白发生的有义突变，进行蛋白三级结构预测，同时结合实际大田实验验证，结果表明，这两个基因突变后，烟草中酪氨酸含量和烟气苯酚释放量发生了明显降低。基于这些研究结果，可为烟草低苯酚含量烟叶新品种培育奠定一定理论基础和技术基础。
附图说明
图1为突变体烟叶中Tyr含量结果；
图2为突变体烟叶中总蛋白含量结果；
图3为突变体烟叶最大光化学效率结果；
图4为突变体烟叶所制备烟支样品的烟气中酚类物质释放量结果；
图5为双突变体烟叶中Tyr含量结果；
图6为利用双突变体烟叶所制备烟支样品的烟气中酚类物质释放量结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请技术方案做进一步解释说明。
实施例1
需要说明的是，由于相关突变序列均是基于EMS突变体库利用Tilling技术筛选获得，因此，本实施例首先就相关突变库的构建和筛选过程简介如下。
（一）EMS突变体库构建
将普通烟草云烟87种子（云南省烟草农业科学研究院提供）参考常规操作进行EMS处理，处理后种子作为M1代突变体种子进行田间种植，套袋自交收获M2代种子。
最终，大田种植后收获约2200份M2代EMS突变体植株，对其采集叶片提取基因组DNA。测定时，将所有样品DNA浓度稀释至40 ng/μL，每8份DNA混样，构成8倍混合池，保存于96孔板，用于后续突变体筛选。最终建立了包含1842份M2代云烟87突变体DNA库。
（二）Tilling 筛选
基于现有研究，分别以与Tyr（酪氨酸）合成相关的DHQ-SDH1基因、TyrA基因为目标基因，对步骤（一）中所构建的EMS突变体库进行Tilling筛选。
（1）设计引物，并进行PCR扩增
针对DHQ-SDH1基因进行筛选时，由于该基因DNA序列太长，将其分段进行。基于现有DHQ-SDH1基因的GS1序列（823bp，含有第二和第三外显子）和GS2序列（947bp，含有第四外显子）设计特异引物。
DHQ-SDH1基因的GS1序列：
AAAATCTTACTGATTGGGAATTTGTTGACATTTTACTCCAATTACTGAAAATGGTTCTCTTCGATTTTGTGATCCAATCTGCCAAAAAGTGAGGCGAATTGACCAAAAGCTTGAACCTTTGCGAAATCTTGCTGATTGAGAATTTGGGGTTTGTTTTCTCAGGCCAAATTCGCCGAGATATTCTTGCAGAGAAAACTGGAAGAAAACATGCTTGCAAGTTCTGAAATTGGCTGTTGAATTGGACGTCGAGTTCGTTGAAGTTGACCGCGAGGTTAGTCCAACTGATTTTCTCAAATTACTCTCTAATTGATACAGTTTTATTGAAGCTAAATAAATCAAAATAATCAAAAAAGAATCTTGCTTAAGAGAGTAAATCATTGTACAAGTTTCCTCTTTTATGTTTATATGATGATTTAACAATGATAGCAGGTTTACTATCATTTTTATCAGGTTATATATTTTTTACATAATCAGCTTATAGAAATTAAACTCTTTGCAACTTTATAGGTTGCTTGCGATGAGGTCATCTGTGAATTAATGACCAAACGATCGAACTGCAAGATAATTGCCTCCAGTCATGTGAATGGTGGAAATCCTACAAAAGAGAGACTTTGTAATTTAATTGCAAACCTGCAGTCAACAGGAGCAGATATCATCAAATTAGTGATTGATGTAGCTTATATTACAGATGTTGCACCAGTTTTTCATATGCTTACACATTGTCAGGTATTTCTTTTCTTGCTTTAACTTGCACTTTTTCCTTGCAAAAACACACCCTCAACTTGCTTTTAGCTTTACACCTATTGATAAATTTGAGGTGTTC
DHQ-SDH1基因的GS2序列：
TAGCTTTACACCTATTGATAAATTTGAGGTGTTCAGTATTTATATTCTCACTACTGCGTTCGTTGCAATTTTAGTGATCATTCACATATATAGTTATCATCCGTGTAAAAGATACTGGGTTTTCTTGAACCCGTGGAAACTACATTGCATCCCCTCTGATGGTATACTTGCTCAATTCAACTTACCGACAAGAAGAGAGAAAAGGGGTCTGCTTTAAAATCTTTCTACGCGAACTGCTGTTGATATACTTAATTTTTCTGCGATGAAGTGTTCATTAGAAAATACTCTCATATTTTCTTCCATATATATGGCCTCTTATTTGTATCTGCAGCCATCTCTTGGGCTTATATGGTTGTAAAGAAAATCTTTTAATGCTAGTTTCCTTGTGAGTAGTGATAAGTTTGTTGAACTTCTCTTTTTAAAACTGAGAATGAGGTACTTTTTTGCCTCATTATAAGGTCTCTATGCAGGTGCCTCTAATTGCCAGGGCAGCAGGAGATAGAGGTCTTATAAGCCAACTATTGGGTCCAAAATATGGTGCTTTCTTTGTTTGTGGATCTTTAGGAGGCAAATCCAACCCTGGCTTGCCAGCTTTGACTAGCATTAAAGACGTTTATAAACTGGAATATGTGAACCAAGATACTAGAGTTTTTGGCGTAATCTCTAATCCTGTTGGCCATAGCAAGGGCCCTCTTCTGCACAACCCTGCCTTTAGACATACAGGATACAATGGAATATATGTGCCTCTACTAGTTGATAATATCAAGGAATTTTTTCGGGTCTTCTCATGCAATGACTATGCTGGTTTTAGGTATGCTCCTTATGTACAAGCTAAAATTGTTCTGTGCCGCATACTGATGAATAACTGCCAGATTGTATTAGGAATATCTAAAGATTCCTACTCGTCAAGCATAAATGTATGCCATATATAAGCAACACTCATCTTA
具体引物设计如下：
正向引物：
DHQ1_Tilling_F：5′- AAAATCTTACTGATTGGGAATTTGTTG-3′，
DHQ2_Tilling_F：5′- TAGCTTTACACCTATTGATAAATTTGAGG-3′；
反向引物：
DHQ1_Tilling_R：5′- GAACACCTCAAATTTATCAATAGGTGT-3′，
DHQ2_Tilling_R：5′- TAAGATGAGTGTTGCTTATATATGGC-3′。
针对TyrA基因进行筛选时，基于TyrA的部分DNA序列GS1，（976bp，含有第二和第三外显子）设计特异引物；
TyrA基因的GS1序列：
GAATGAACAACTTTTCCAGCTAATGACTGCTTATGTTCATTTATTCACTTGCAGGGATATGGGTGCATTTCTTGAATCAGACAATGAGGTTATTATAATTAGCACGTCGATACTGTCTCTATCACGAGTTGTAGAGTCCATACCATTCCATTGTCTCAAGCGGCCTACACTTTTCGTTGATGTACTCTCAGTTAAAGAACACCCAAAAGATGTCCTTTTGCGAGTATGCAATTCACACCAACATTATTAATTTCAAGACTTTTGACTTCTGCAGCTTCACATACGTTTGTATGTTGAACAGTAATATGTCTAACAACGGTTGCATACTATGTGTTCGAAAGATATTGCCCGAGGAGTGCGACTTGCTGTGTACTCACCCAATGTTTGGACCACAAAGTGGAAAAGATGGATGGACTGATTTGACTTTTATGTACGACATGATTCGAATTAGAGATAAATCTCTGTGTTCCAGTTTTCTGCAAATATTCTCAAGTGAGGTAAGAAGTTCAAATATGCCCAAAGTTGTGTTCGTCAATGTTATTACTTTCTCATTGATTTTGGCTAGCTAGACTAGCATGGTTCATTCTATTACTAGCTCCTTGAGCTGAAATTCTCCTGTATTGACTGGAAAACTGAGGAAAGAGAACCCCATATCTGAGTATTGCACGAATCTTCTGTTGCAGGGGTGCAAAATGCTGGAAATGACTTGTGAAGAGCATGACAAATTGGCTGCTCGAAGTCAATTTCTGACTCACACAATTGGCAGGTAACTTGTGTCACCTACAACTGTAGAAAGAGGTCATCACAATTACCAACTACTATTAATCTTCTTCACCTAACAGGATCTTATCCGAAATGGAGGTTGAACCCACCCCCATAGACACGAAGGGATTTCAGAAACTTGTTCAAGTGGTAAATACAACATTGACTTGTACCTTTTCAAGATTATACTTGTAGCAAATTAAGCGTGTTTTTC
正向引物为
TyrA_Tilling_F：5′- GAATGAACAACTTTTCCAGCTAATGAC-3′，
反向引物为
TyrA_Tilling_R：5′-GAAAAACACGCTTAATTTGCTACAAGTA-3′。
PCR扩增时，以步骤（一）中突变体库样品所提取DNA为模板，利用上述引物对分别进行PCR扩增。
PCR扩增时，10µL扩增体系设计如下：
DNA模板，0.5µL（约20ng）；
2MM dNTPs，2µL；
KOD FX聚合酶（TOYOBO公司），0.5µL；
正向引物，1µL；
反向引物，1µL；
2× KOD FX buffer，5μL。
扩增条件：95℃ 2min；98℃、10s，64℃、30s，68℃延伸1min，4个循环，退火温度每个循环依次降低1℃；98℃、10s，60℃、30s，68℃、1min，45个循环；68℃、5min；4℃保持。
（2）CELI酶切，并电泳分析
随后，对PCR扩增产物分别进行CELI酶切，6μL酶切体系设计如下：
CEL I（Takara公司），0.2μL；
10× CEL1 buffer，1.2 μL；
PCR 产物，2 μL；
无菌水，2.6 μL。
对酶切产物分别进行毛细管（AdvanCE FS96 (Advanced AnalyticalTechnologies, USA)）电泳分析。
（3）突变位点测序验证及蛋白功能预测
基于步骤（2）中酶切分析结果，筛选确定目标EMS突变个体。
针对初步筛选确定的目标EMS突变个体，使用DNA 提取试剂盒（上海生工）提取目标烟草突变株叶片基因组DNA；以所提取基因组DNA为模板，分别使用DHQ1_Tilling_F/R、DHQ2_Tilling_F/R、TyrA_Tilling_F/R引物对进行扩增，并将PCR产物回收后进行测序分析（相关操作参考现有技术常规操作即可）。
进一步地，利用在线工具 PROVEAN Protein（http://provean.jcvi.org/seq_submit.php）对测序所得的突变序列进行的基因功能进行预测分析。分析时，得分小于-2.5表明该位点突变会影响其蛋白功能，相反则表明该突变影响不大。
基于Tilling技术筛选时，在云烟87突变体库中初步筛选获得了10个DHQ-SDH1基因突变类型。具体突变位点及功能预测、得分等情况如下表1所示。其中，突变株M330发生E99K和G149R突变，M283发生P213S突变。
表1，基于Tilling技术筛选获得的DHQ-SDH1基因突变株的突变情况
Figure 96565DEST_PATH_IMAGE001
。
基于Tilling技术筛选时，在云烟87突变体库中筛选获得了6个TyrA基因突变类型。具体突变位点及功能预测、得分等情况如下表2所示。其中，突变株M837发生E40K突变。
表2，基于Tilling技术筛选获得的TyrA基因突变株的突变情况
Figure 797674DEST_PATH_IMAGE002
。
测序结果表明，M330突变株DHQ-SDH1基因的GS1序列，带下划线（257位点、642位点）的是发生突变的碱基，包括823个碱基，具体如下：
AAAATCTTACTGATTGGGAATTTGTTGACATTTTACTCCAATTACTGAAAATGGTTCTCTTCGATTTTGTGATCCAATCTGCCAAAAAGTGAGGCGAATTGACCAAAAGCTTGAACCTTTGCGAAATCTTGCTGATTGAGAATTTGGGGTTTGTTTTCTCAGGCCAAATTCGCCGAGATATTCTTGCAGAGAAAACTGGAAGAAAACATGCTTGCAAGTTCTGAAATTGGCTGTTGAATTGGACGTCGAGTTCGTTAAAGTTGACCGCGAGGTTAGTCCAACTGATTTTCTCAAATTACTCTCTAATTGATACAGTTTTATTGAAGCTAAATAAATCAAAATAATCAAAAAAGAATCTTGCTTAAGAGAGTAAATCATTGTACAAGTTTCCTCTTTTATGTTTATATGATGATTTAACAATGATAGCAGGTTTACTATCATTTTTATCAGGTTATATATTTTTTACATAATCAGCTTATAGAAATTAAACTCTTTGCAACTTTATAGGTTGCTTGCGATGAGGTCATCTGTGAATTAATGACCAAACGATCGAACTGCAAGATAATTGCCTCCAGTCATGTGAATGGTGGAAATCCTACAAAAGAGAGACTTTGTAATTTAATTGCAAACCTGCAGTCAACAAGAGCAGATATCATCAAATTAGTGATTGATGTAGCTTATATTACAGATGTTGCACCAGTTTTTCATATGCTTACACATTGTCAGGTATTTCTTTTCTTGCTTTAACTTGCACTTTTTCCTTGCAAAAACACACCCTCAACTTGCTTTTAGCTTTACACCTATTGATAAATTTGAGGTGTT。
测序结果表明，M283突变株DHQ-SDH1基因的GS2序列，包括947个碱基，带下划线（579位点）的是发生突变的碱基，具体如下：
TAGCTTTACACCTATTGATAAATTTGAGGTGTTCAGTATTTATATTCTCACTACTGCGTTCGTTGCAATTTTAGTGATCATTCACATATATAGTTATCATCCGTGTAAAAGATACTGGGTTTTCTTGAACCCGTGGAAACTACATTGCATCCCCTCTGATGGTATACTTGCTCAATTCAACTTACCGACAAGAAGAGAGAAAAGGGGTCTGCTTTAAAATCTTTCTACGCGAACTGCTGTTGATATACTTAATTTTTCTGCGATGAAGTGTTCATTAGAAAATACTCTCATATTTTCTTCCATATATATGGCCTCTTATTTGTATCTGCAGCCATCTCTTGGGCTTATATGGTTGTAAAGAAAATCTTTTAATGCTAGTTTCCTTGTGAGTAGTGATAAGTTTGTTGAACTTCTCTTTTTAAAACTGAGAATGAGGTACTTTTTTGCCTCATTATAAGGTCTCTATGCAGGTGCCTCTAATTGCCAGGGCAGCAGGAGATAGAGGTCTTATAAGCCAACTATTGGGTCCAAAATATGGTGCTTTCTTTGTTTGTGGATCTTTAGGAGGCAAATCCAACTCTGGCTTGCCAGCTTTGACTAGCATTAAAGACGTTTATAAACTGGAATATGTGAACCAAGATACTAGAGTTTTTGGCGTAATCTCTAATCCTGTTGGCCATAGCAAGGGCCCTCTTCTGCACAACCCTGCCTTTAGACATACAGGATACAATGGAATATATGTGCCTCTACTAGTTGATAATATCAAGGAATTTTTTCGGGTCTTCTCATGCAATGACTATGCTGGTTTTAGGTATGCTCCTTATGTACAAGCTAAAATTGTTCTGTGCCGCATACTGATGAATAACTGCCAGATTGTATTAGGAATATCTAAAGATTCCTACTCGTCAAGCATAAATGTATGCCATATATAAGCAACACTCATCTTA。
测序结果表明，M837突变株TyrA基因的GS1序列，包括976个碱基，带下划线（86位点）的是发生突变的碱基，具体如下：
GAATGAACAACTTTTCCAGCTAATGACTGCTTATGTTCATTTATTCACTTGCAGGGATATGGGTGCATTTCTTGAATCAGACAATAAGGTTATTATAATTAGCACGTCGATACTGTCTCTATCACGAGTTGTAGAGTCCATACCATTCCATTGTCTCAAGCGGCCTACACTTTTCGTTGATGTACTCTCAGTTAAAGAACACCCAAAAGATGTCCTTTTGCGAGTATGCAATTCACACCAACATTATTAATTTCAAGACTTTTGACTTCTGCAGCTTCACATACGTTTGTATGTTGAACAGTAATATGTCTAACAACGGTTGCATACTATGTGTTCGAAAGATATTGCCCGAGGAGTGCGACTTGCTGTGTACTCACCCAATGTTTGGACCACAAAGTGGAAAAGATGGATGGACTGATTTGACTTTTATGTACGACATGATTCGAATTAGAGATAAATCTCTGTGTTCCAGTTTTCTGCAAATATTCTCAAGTGAGGTAAGAAGTTCAAATATGCCCAAAGTTGTGTTCGTCAATGTTATTACTTTCTCATTGATTTTGGCTAGCTAGACTAGCATGGTTCATTCTATTACTAGCTCCTTGAGCTGAAATTCTCCTGTATTGACTGGAAAACTGAGGAAAGAGAACCCCATATCTGAGTATTGCACGAATCTTCTGTTGCAGGGGTGCAAAATGCTGGAAATGACTTGTGAAGAGCATGACAAATTGGCTGCTCGAAGTCAATTTCTGACTCACACAATTGGCAGGTAACTTGTGTCACCTACAACTGTAGAAAGAGGTCATCACAATTACCAACTACTATTAATCTTCTTCACCTAACAGGATCTTATCCGAAATGGAGGTTGAACCCACCCCCATAGACACGAAGGGATTTCAGAAACTTGTTCAAGTGGTAAATACAACATTGACTTGTACCTTTTCAAGATTATACTTGTAGCAAATTAAGCGTGTTTTTC。
基于上述有义突变信息的测序结果及已知基因序列信息，最终获得如SEQ IDNo.1~4所示的DHQ-SDH1基因、TyrA基因及其对应的编码氨基酸序列。具体编码序列（即CDS）序列信息，亦可参考如下。
突变基因DHQ-SDH1的编码序列（SEQ ID NO.1，1548bp）：
ATGGGTTTCAAACAAGACCTTTTAGTGTACACAACATTAGAATGTGAAAGCTTGTCTGAAATGGCAGCTTGTATGCAGAAAGCAAAAGAAGAAGGAGCAGATCTAGTGGAACTTTGCATTGACTCTTTAACTTTCACACACATTTCAGAAGTTGAACACCTTCTCAAACAGAGGACTTTACCCTCCATCGTTTCTTTCAGGCCAAATTCGCCGAGATATTCTTGCAGAGAAAACTGGAAGAAAACATGCTTGCAAGTTCTGGAATTGGCTGTTGAATTGGACGTCAAGTTTGTTAAAATTGACCGCAAGGTTGCTTATGATGAGGTCATCTGTGAATTAATGACCAAACGATCGAACTGCAAGATAATTGCCTCTAGTCATGTGAATGGTGGAAATCCTACAAAAGAGAGACTTTGTAATTTAATTGCAAACCTGCAATCAACAAGAGCAGATATCATCAAATTAGTGATTGATGTAGCTTATATTACAGATGTTGCACCAGTTTTTCATATGCTTACACATTGTCAGGTGCCTCTAATTGCCAGGGCAGCAGGAGATAAAGGTCTTATAAGCCAACTATTAGGTCCAAAATATGGTGCTTTCTTTGTTTGTGGATCTTTAGGAGGCAAATCCAACTCTGGCTTGCTAGCTTTGACTAGCATTAAAGACGTTTATAAACTGGAATATGTGAACCAAGATACTAGAGTTTTTGGCGTAATCTCTAATCCTATTGGCCATAGCAAGGGCCCTCTACTGCACAACCCTGCCTTTAGACATACAGGATACAATGGAATATATGTGCCTCTACTAGTTGATAATATCAAGGAATTTTTTCGGGTCTTCTCATGCAATGACTATGCTGGTTTTAGTGTTGGACTCCCACATAAGGAAGCAGCAGTACGGTGCTGTGATGAAGTAGATCCACTTGCTAAGTCTATAGGAGCTGTTAACACAATTATAAGGAGACCTTCTGATGGCAAGCTCATTGGTTACAATACAGATTGTGAGGCTTGTGCGACGGCAATTGAGGATGCACTTAGAGAGAGACAAAAGACCAATGGCCATGCATCAAATGTTTCTCCAATTGCTGGAAAATTGTTCGTATTAGTTGGAGCAGGTGGTGCTGGGAGAGCTATTGCTTTTGGTGTCAAAAGTAGAGGGGCAAGGGTTGTAATATTTAACCGCAAATACGAGAGAGCAAAAGCTCTGGCCGCAGCAGTATCTGGTGAAGCCTTGCCATATGAACAACTAAACGATTTCTGCCCTGAGAAGGGAATGATTCTTGCAAATGCTTCTGCTGTAGGCATGCAGCCAAGGACAGATCAAACTCCTATTTCCAAGGAGGCCTTGAGATCATATGAGCTAGTATTTGATGCAGTTTACACACCTAGAAACACGCGGCTATTGCAGGAGGCTACAGAGGTTGGAGCTGCAGTGGTGGGTGGGGTTGAGATGTTCGTCAGGCAGGCAATTGGACAGTTCAAATTGTTCACCAATGGATTAGCACCAGAAGACTTTATGCGGAGGATTGTATATGAGCAATTTTGA。
突变DHQ-SHD1蛋白（SEQ ID NO.2，515个氨基酸）
MGFKQDLLVYTTLECESLSEMAACMQKAKEEGADLVELCIDSLTFTHISEVEHLLKQRTLPSIVSFRPNSPRYSCRENWKKTCLQVLELAVELDVKFVKIDRKVAYDEVICELMTKRSNCKIIASSHVNGGNPTKERLCNLIANLQSTRADIIKLVIDVAYITDVAPVFHMLTHCQVPLIARAAGDKGLISQLLGPKYGAFFVCGSLGGKSNSGLLALTSIKDVYKLEYVNQDTRVFGVISNPIGHSKGPLLHNPAFRHTGYNGIYVPLLVDNIKEFFRVFSCNDYAGFSVGLPHKEAAVRCCDEVDPLAKSIGAVNTIIRRPSDGKLIGYNTDCEACATAIEDALRERQKTNGHASNVSPIAGKLFVLVGAGGAGRAIAFGVKSRGARVVIFNRKYERAKALAAAVSGEALPYEQLNDFCPEKGMILANASAVGMQPRTDQTPISKEALRSYELVFDAVYTPRNTRLLQEATEVGAAVVGGVEMFVRQAIGQFKLFTNGLAPEDFMRRIVYEQF。
突变基因TyrA的编码序列（SEQ ID NO.3，732bp）：
ATGATAAAACAAGGCCATATAATCAGGGCTACTTCTAGATCAGATTATTCAGACTTGTGCGCAAATTTGGGTATCCTATTCTTCAGGGATATGGGTGCATTTCTTGAATCAGACAATAAGATTATTATAATTAGCACGTCGATACTGTCTCTATCACGAGTTGTAGAGTCCATACCATTCCATTATCTCAAGCGGCCTACACTTTTCATTGATGTATTCTCAGTTAAAAAACATCCAAAAGATGTCCTTTTGCGAATATTGCCTGAGGAATGCGACTTGCTGTGTACTCACCCAATGTTTGGACCACAAAGTGGAAAAGATGGATGGACTGATTTGACTTTTATGTACGACATGATTCGAATTAGAAATAAATCTCTGTGTTCCAGTTTTCTGCAAATATTTTTAAGTGAGGGGTGCAAAATGCTGGAAATGACTTGTGAAGAGCATGATAAATTGGCTGCTCGAAGTCAATTTCTGACTCACATAATTGGCAGGATCTTATCCGAAATGGAGGTTGAACCCACCCCCATAGACACGAAGGGATTTCAGAAACTTGTTCAAGTGAAGGAGAGCTCAGTTAGAGATAGTTTTGATCTATTCAGCGGGCTATTCATACACAATAGGTTTGCCAGGCAACAGATGAAAAATTTAGAAGTAGCAGTGGAGAAAACTAAACAGAAGCTTGAAGAGAGGTCGAAGGAGCTGCAGGATCCTATCATATCTAAGTTCTAG。
突变TyrA蛋白（SEQ ID NO.4，243个氨基酸）：
MIKQGHIIRATSRSDYSDLCANLGILFFRDMGAFLESDNKIIIISTSILSLSRVVESIPFHYLKRPTLFIDVFSVKKHPKDVLLRILPEECDLLCTHPMFGPQSGKDGWTDLTFMYDMIRIRNKSLCSSFLQIFLSEGCKMLEMTCEEHDKLAARSQFLTHIIGRILSEMEVEPTPIDTKGFQKLVQVKESSVRDSFDLFSGLFIHNRFARQQMKNLEVAVEKTKQKLEERSKELQDPIISKF。
实施例2
在实施例1筛选、分析基础上，为进一步确定相关突变株具体表型变化情况。将突变体纯合株进一步进行了温室种植和大田种植，并对其烟叶酪氨酸含量和烟气苯酚释放量情况进行了测定，具体实验过程简介如下。
（一）酪氨酸含量检测
在国家烟草基因研究中心培养间（温度25±2°C，16 h光照/8 h黑暗）种植M4代纯合突变株系突变体M837（LH2）、M330（LH5）、M283（LH10）和对照材料云烟87（LH1）。
等第5片真叶长出后，取下第三片真叶进行冷冻干燥。准确称取50mg的冻干烟叶粉末，放入1.5ml EP管中，精确值至0.0001g，准确加入1.6mg/ml亮氨酸脑酚酞甲醇溶液1ml，放于摇床中30℃、200rpm振荡30min；14000rpm离心10min后，小心取上清液600μL，使用LC-MS（美国Agilent，1290-6490 QQQ）进行检测。检测条件：
色谱柱：Waters BEH Amide, 2.1*100mm,1.7μm；
流动相A：含0.1%甲酸的乙腈溶液；流动相B：含0.1%甲酸的水溶液；
柱温：30℃；流速：0.3 mL/min；进样体积：10μL；
梯度：
0min，流动相A 5%，流动相B 95%；
5min，流动相A 25%，流动相B 75%；
6min，流动相A 30%，流动相B 70%；
7min，流动相A 25%，流动相B 75%；
8min，流动相A 20%，流动相B 80%；
10min，流动相A 5%，流动相B 95%。
对突变体烟叶酪氨酸含量检测的结果（图1）显示，与对照云烟87相比，突变株LH2、LH5和LH10体内的游离酪氨酸含量都大幅下降，分别下降了61.37%、76.78%和81.71%。结果表明，云烟87的 DHQ-SDH1基因或TyrA基因的突变可以显著降低Tyr的含量。
（二）蛋白质含量检测
在温室中，等第5片真叶长出后，取下第三片真叶使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（赛文创新生物科技有限公司）检测蛋白质含量，按照试剂盒说明书进行。
对突变体株系的叶片蛋白质含量检测的结果显示，LH2、LH5和LH10体内的蛋白质含量分别下降约7.39%、8.699%和21.74%（图2）。这表明，云烟87 DHQ-SDH1基因和TyrA基因的突变可以有效降低叶片蛋白质的含量，可能是通过抑制游离Tyr 的合成来影响蛋白质含量的合成，因为Tyr是蛋白质合成的不可缺少的氨基酸组分之一。
（三）光合生理分析
在温室中，等第5片真叶长出后，使用德国WALZ公司Imaging-PAM——全叶片荧光成像系统检测纯合突变体在太阳下暴晒处理4h后光合生理指数的变化。
对突变体株系的叶片光合生理进行检测的结果显示，无论是正常生长还是强光处理前后，植株的光合系统II最大光化学效率（Fv/Fm）基本都与对照保持一致（图3）。这表明虽然叶片蛋白质和Tyr含量明显下降，但是叶片的光合效率并未受到显著干扰，说明基因的定点突变并未显著干扰植株的正常生长发育。
（四）烟气酚类物质释放量检测
在位于河南省襄县王洛镇的实验田内，种植突变体M330、M283、M837对应的M4代纯合株系LH5、LH10、LH2和对照材料云烟87（LH1），每个材料3个重复小区，每个小区栽烟20株。株距50 cm，行距120 cm。烟株第一朵中心花开放50%时进行打顶，每株留叶数为22片左右。田间管理措施和烘烤按当地优质烟叶栽培和烘烤技术规程进行。
云烟87和突变体材料中部叶成熟采摘后，按照当地优质烟烘烤工艺进行烘烤，将烘烤后的烟叶平衡后切丝，使用打烟器将烟丝样品填入空筒烟支中制成样品卷烟。
进一步将样品卷烟放入恒温恒湿间（温度22℃，湿度60%RH）中平衡48小时后，筛选重量偏差±20 mg 范围内的烟支为试验烟支。
使用自动吸烟机（英国CERULEAN公司，SM450）抽吸卷烟，每个样品抽4支，将捕集有主流烟气总粒相物的玻璃纤维滤片折叠放入200ml具塞锥形瓶中，准确加入50mL 1%乙酸溶液（体积分数），室温下超声萃取20min，静止5min。取2ml萃取液，用0.45μm水相滤膜过滤。使用高效液相色谱仪（美国WATERS公司，E2695）进行检测。检测条件：
流动相A：1%乙酸溶液；流动相B：乙酸-乙腈-水（1:30:69）；
柱温：30℃；流速：1 mL/min；进样体积：10μL；
梯度：
0min，流动相A 80%，流动相B 20%；
40min，流动相A 0%，流动相B 100%。
对DHQ-SDH1突变体烟气苯酚释放量测定结果（图4）显示，与对照卷烟样品相比，各突变体卷烟样品的苯酚释放量都明显下降。其中，LH10下降幅度最大，降低率为48.99%；LH5和LH2下降幅度分别为24.09%和11.89%。
突变体材料烟气中其他5种酚类物质释放量的检测结果如图4所示，与野生型相比，突变体试验烟支烟气中酚类除了对-苯二酚的释放量有所增加，其他酚类的释放量如间-苯二酚、邻-苯二酚、对-甲酚和邻-甲酚的释放量均呈现不同程度的下降。这5种酚类中邻-苯二酚是含量最高的，降低的幅度比对-苯二酚增加幅度大，因此突变体材料烟气酚类物质释放量是下降的，而且LH10下降幅度最大。
实施例3
在实施例1、实施例2基础上，基于筛选所确定的单突变体，为进一步降低烟气中苯酚含量，通过遗传杂交的方式，发明人进一步构建了烟草tyra/dhq-sdh1双突变体，具体构建过程简介如下。
需要解释的是，为避免突变累加后导致烟草品质变化过大甚至致死情况发生，因此在构建双突变体过程中，发明人采用了其他突变材料以进行进一步研究和探讨。具体而言：
父本：以筛选到的纯合突变体烟草tyra（M846）材料为父本，该突变体中TyrA基因的第217个碱基发生C→T突变，相应第73个氨基氨酸发生L→F突变；
母本：以筛选到的纯合突变体烟草DHQ-SDH1（M398）材料为母本，该突变体中DHQ- SDH1基因的第863个碱基发生A→G突变，相应第288个氨基氨酸发生D→G突变。
同时播种烟草M846和M398突变体，播种大约90天后，在开花期时进行遗传杂交。以M398突变体为母本，去除多余的花苞，选取未开放的花苞，去除雄蕊，采集M846突变体的花粉将其涂抹到M398突变体雌蕊的柱头上，然后套袋留种。待杂交后的种子成熟后，收种。
播种F1代后约30天，提取烟草的DNA进行测序，同时含有TyrA和DHQ-SDH1两个基因突变的留种；
播种F2代后约30天，提取烟草的DNA进行测序，同时含有TyrA和DHQ-SDH1两个基因突变的留种；
播种F3代后约30天，提取烟草的DNA进行测序，确定F2后代留种的TyrA和DHQ-SDH1两个基因的突变，并收种。
基于PCR扩增产物进行测序鉴定时，分别以引物DHQ2_Tilling_F/R和TyrA_Tilling_F/R进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收，连接到T载体后送至华大基因公司测序。
进一步地，参考实施例2中相关种植过程，种植F4代双突变体，并对其烟叶中酪氨酸含量和苯酚释放量情况进行测定。
对双突变体烟叶酪氨酸含量检测的结果（图5）显示，与对照云烟87相比，突变株LH14体内的游离酪氨酸含量大幅下降，分别下降了85.4%。
对双突变体酚类物质释放量测定结果（图6）显示，与对照卷烟样品相比,突变体LH14卷烟样品的酚类物质释放量都明显下降，其中苯酚释放量降低率为49.8%。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院
<120> 与烟气苯酚释放量相关的突变基因TyrA
<130> none
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1548
<212> DNA
<213> Nicotiana tabacum
<400> 1
atgggtttca aacaagacct tttagtgtac acaacattag aatgtgaaag cttgtctgaa 60
atggcagctt gtatgcagaa agcaaaagaa gaaggagcag atctagtgga actttgcatt 120
gactctttaa ctttcacaca catttcagaa gttgaacacc ttctcaaaca gaggacttta 180
ccctccatcg tttctttcag gccaaattcg ccgagatatt cttgcagaga aaactggaag 240
aaaacatgct tgcaagttct ggaattggct gttgaattgg acgtcaagtt tgttaaaatt 300
gaccgcaagg ttgcttatga tgaggtcatc tgtgaattaa tgaccaaacg atcgaactgc 360
aagataattg cctctagtca tgtgaatggt ggaaatccta caaaagagag actttgtaat 420
ttaattgcaa acctgcaatc aacaagagca gatatcatca aattagtgat tgatgtagct 480
tatattacag atgttgcacc agtttttcat atgcttacac attgtcaggt gcctctaatt 540
gccagggcag caggagataa aggtcttata agccaactat taggtccaaa atatggtgct 600
ttctttgttt gtggatcttt aggaggcaaa tccaactctg gcttgctagc tttgactagc 660
attaaagacg tttataaact ggaatatgtg aaccaagata ctagagtttt tggcgtaatc 720
tctaatccta ttggccatag caagggccct ctactgcaca accctgcctt tagacataca 780
ggatacaatg gaatatatgt gcctctacta gttgataata tcaaggaatt ttttcgggtc 840
ttctcatgca atgactatgc tggttttagt gttggactcc cacataagga agcagcagta 900
cggtgctgtg atgaagtaga tccacttgct aagtctatag gagctgttaa cacaattata 960
aggagacctt ctgatggcaa gctcattggt tacaatacag attgtgaggc ttgtgcgacg 1020
gcaattgagg atgcacttag agagagacaa aagaccaatg gccatgcatc aaatgtttct 1080
ccaattgctg gaaaattgtt cgtattagtt ggagcaggtg gtgctgggag agctattgct 1140
tttggtgtca aaagtagagg ggcaagggtt gtaatattta accgcaaata cgagagagca 1200
aaagctctgg ccgcagcagt atctggtgaa gccttgccat atgaacaact aaacgatttc 1260
tgccctgaga agggaatgat tcttgcaaat gcttctgctg taggcatgca gccaaggaca 1320
gatcaaactc ctatttccaa ggaggccttg agatcatatg agctagtatt tgatgcagtt 1380
tacacaccta gaaacacgcg gctattgcag gaggctacag aggttggagc tgcagtggtg 1440
ggtggggttg agatgttcgt caggcaggca attggacagt tcaaattgtt caccaatgga 1500
ttagcaccag aagactttat gcggaggatt gtatatgagc aattttga 1548
<210> 2
<211> 515
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<400> 2
Met Gly Phe Lys Gln Asp Leu Leu Val Tyr Thr Thr Leu Glu Cys Glu
1 5 10 15
Ser Leu Ser Glu Met Ala Ala Cys Met Gln Lys Ala Lys Glu Glu Gly
20 25 30
Ala Asp Leu Val Glu Leu Cys Ile Asp Ser Leu Thr Phe Thr His Ile
35 40 45
Ser Glu Val Glu His Leu Leu Lys Gln Arg Thr Leu Pro Ser Ile Val
50 55 60
Ser Phe Arg Pro Asn Ser Pro Arg Tyr Ser Cys Arg Glu Asn Trp Lys
65 70 75 80
Lys Thr Cys Leu Gln Val Leu Glu Leu Ala Val Glu Leu Asp Val Lys
85 90 95
Phe Val Lys Ile Asp Arg Lys Val Ala Tyr Asp Glu Val Ile Cys Glu
100 105 110
Leu Met Thr Lys Arg Ser Asn Cys Lys Ile Ile Ala Ser Ser His Val
115 120 125
Asn Gly Gly Asn Pro Thr Lys Glu Arg Leu Cys Asn Leu Ile Ala Asn
130 135 140
Leu Gln Ser Thr Arg Ala Asp Ile Ile Lys Leu Val Ile Asp Val Ala
145 150 155 160
Tyr Ile Thr Asp Val Ala Pro Val Phe His Met Leu Thr His Cys Gln
165 170 175
Val Pro Leu Ile Ala Arg Ala Ala Gly Asp Lys Gly Leu Ile Ser Gln
180 185 190
Leu Leu Gly Pro Lys Tyr Gly Ala Phe Phe Val Cys Gly Ser Leu Gly
195 200 205
Gly Lys Ser Asn Ser Gly Leu Leu Ala Leu Thr Ser Ile Lys Asp Val
210 215 220
Tyr Lys Leu Glu Tyr Val Asn Gln Asp Thr Arg Val Phe Gly Val Ile
225 230 235 240
Ser Asn Pro Ile Gly His Ser Lys Gly Pro Leu Leu His Asn Pro Ala
245 250 255
Phe Arg His Thr Gly Tyr Asn Gly Ile Tyr Val Pro Leu Leu Val Asp
260 265 270
Asn Ile Lys Glu Phe Phe Arg Val Phe Ser Cys Asn Asp Tyr Ala Gly
275 280 285
Phe Ser Val Gly Leu Pro His Lys Glu Ala Ala Val Arg Cys Cys Asp
290 295 300
Glu Val Asp Pro Leu Ala Lys Ser Ile Gly Ala Val Asn Thr Ile Ile
305 310 315 320
Arg Arg Pro Ser Asp Gly Lys Leu Ile Gly Tyr Asn Thr Asp Cys Glu
325 330 335
Ala Cys Ala Thr Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Glu Arg Gln Lys Thr
340 345 350
Asn Gly His Ala Ser Asn Val Ser Pro Ile Ala Gly Lys Leu Phe Val
355 360 365
Leu Val Gly Ala Gly Gly Ala Gly Arg Ala Ile Ala Phe Gly Val Lys
370 375 380
Ser Arg Gly Ala Arg Val Val Ile Phe Asn Arg Lys Tyr Glu Arg Ala
385 390 395 400
Lys Ala Leu Ala Ala Ala Val Ser Gly Glu Ala Leu Pro Tyr Glu Gln
405 410 415
Leu Asn Asp Phe Cys Pro Glu Lys Gly Met Ile Leu Ala Asn Ala Ser
420 425 430
Ala Val Gly Met Gln Pro Arg Thr Asp Gln Thr Pro Ile Ser Lys Glu
435 440 445
Ala Leu Arg Ser Tyr Glu Leu Val Phe Asp Ala Val Tyr Thr Pro Arg
450 455 460
Asn Thr Arg Leu Leu Gln Glu Ala Thr Glu Val Gly Ala Ala Val Val
465 470 475 480
Gly Gly Val Glu Met Phe Val Arg Gln Ala Ile Gly Gln Phe Lys Leu
485 490 495
Phe Thr Asn Gly Leu Ala Pro Glu Asp Phe Met Arg Arg Ile Val Tyr
500 505 510
Glu Gln Phe
515
<210> 3
<211> 732
<212> DNA
<213> Nicotiana tabacum
<400> 3
atgataaaac aaggccatat aatcagggct acttctagat cagattattc agacttgtgc 60
gcaaatttgg gtatcctatt cttcagggat atgggtgcat ttcttgaatc agacaataag 120
attattataa ttagcacgtc gatactgtct ctatcacgag ttgtagagtc cataccattc 180
cattatctca agcggcctac acttttcatt gatgtattct cagttaaaaa acatccaaaa 240
gatgtccttt tgcgaatatt gcctgaggaa tgcgacttgc tgtgtactca cccaatgttt 300
ggaccacaaa gtggaaaaga tggatggact gatttgactt ttatgtacga catgattcga 360
attagaaata aatctctgtg ttccagtttt ctgcaaatat ttttaagtga ggggtgcaaa 420
atgctggaaa tgacttgtga agagcatgat aaattggctg ctcgaagtca atttctgact 480
cacataattg gcaggatctt atccgaaatg gaggttgaac ccacccccat agacacgaag 540
ggatttcaga aacttgttca agtgaaggag agctcagtta gagatagttt tgatctattc 600
agcgggctat tcatacacaa taggtttgcc aggcaacaga tgaaaaattt agaagtagca 660
gtggagaaaa ctaaacagaa gcttgaagag aggtcgaagg agctgcagga tcctatcata 720
tctaagttct ag 732
<210> 4
<211> 243
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<400> 4
Met Ile Lys Gln Gly His Ile Ile Arg Ala Thr Ser Arg Ser Asp Tyr
1 5 10 15
Ser Asp Leu Cys Ala Asn Leu Gly Ile Leu Phe Phe Arg Asp Met Gly
20 25 30
Ala Phe Leu Glu Ser Asp Asn Lys Ile Ile Ile Ile Ser Thr Ser Ile
35 40 45
Leu Ser Leu Ser Arg Val Val Glu Ser Ile Pro Phe His Tyr Leu Lys
50 55 60
Arg Pro Thr Leu Phe Ile Asp Val Phe Ser Val Lys Lys His Pro Lys
65 70 75 80
Asp Val Leu Leu Arg Ile Leu Pro Glu Glu Cys Asp Leu Leu Cys Thr
85 90 95
His Pro Met Phe Gly Pro Gln Ser Gly Lys Asp Gly Trp Thr Asp Leu
100 105 110
Thr Phe Met Tyr Asp Met Ile Arg Ile Arg Asn Lys Ser Leu Cys Ser
115 120 125
Ser Phe Leu Gln Ile Phe Leu Ser Glu Gly Cys Lys Met Leu Glu Met
130 135 140
Thr Cys Glu Glu His Asp Lys Leu Ala Ala Arg Ser Gln Phe Leu Thr
145 150 155 160
His Ile Ile Gly Arg Ile Leu Ser Glu Met Glu Val Glu Pro Thr Pro
165 170 175
Ile Asp Thr Lys Gly Phe Gln Lys Leu Val Gln Val Lys Glu Ser Ser
180 185 190
Val Arg Asp Ser Phe Asp Leu Phe Ser Gly Leu Phe Ile His Asn Arg
195 200 205
Phe Ala Arg Gln Gln Met Lys Asn Leu Glu Val Ala Val Glu Lys Thr
210 215 220
Lys Gln Lys Leu Glu Glu Arg Ser Lys Glu Leu Gln Asp Pro Ile Ile
225 230 235 240
Ser Lys Phe

Claims (4)

1.与烟气苯酚释放量相关的突变基因TyrA，其特征在于，所述突变基因TyrA为烟草阿罗酸脱氢酶基因，相较于TyrA基因野生型CDS，有义突变位点及突变类型为：G118A→E40K；
所述野生型TyrA基因的CDS序列如下：
ATGATAAAACAAGGCCATATAATCAGGGCTACTTCTAGATCAGATTATTCAGACTTGTGCGCAAATTTGGGTATCCTATTCTTCAGGGATATGGGTGCATTTCTTGAATCAGACAATGAGATTATTATAATTAGCACGTCGATACTGTCTCTATCACGAGTTGTAGAGTCCATACCATTCCATTGTCTCAAGCGGCCTACACTTTTCATTGATGTACTCTCAGTTAAAGAACATCCAAAAGATGTCCTTTTGCGAATATTGCCTGAGGAATGCGACTTGCTGTGTACTCACCCAATGTTTGGACCACAAAGTGGAAAAGATGGATGGACTGATTTGACTTTTATGTACGACATGATTCGAATTAGAAATAAATCTCTGTGTTCCAGTTTTCTGCAAATATTTTCAAGTGAGGGGTGCAAAATGCTGGAAATGACTTGTGAAGAGCATGATAAATTGGCTGCTCGAAGTCAATTTCTGACTCACACAATTGGCAGGATCTTATCCGAAATGGAGGTTGAACCCACCCCCATAGACACGAAGGGATTTCAGAAACTTGTTCAAGTGAAGGAGAGCTCAGTTAGAGATAGTTTTGATCTATTCAGCGGGCTATTCATACACAATAGGTTTGCCAGGCAACAGATGAAAAATTTAGAAGTAGCAGTGGAGAAAACTAAACAGAAGCTTGAAGAGAGGTCGAAGGAGCTGCAGGATCCTATCATATCTAAGTTCTAG。
2.权利要求1所述突变基因TyrA所编码的烟草TyrA突变蛋白，其特征在于，相较于野生型TyrA蛋白，有义突变位点及突变类型为：G118A→E40K；
所述野生型TyrA蛋白的氨基酸序列如下：
MIKQGHIIRATSRSDYSDLCANLGILFFRDMGAFLESDNEIIIISTSILSLSRVVESIPFHCLKRPTLFIDVLSVKEHPKDVLLRILPEECDLLCTHPMFGPQSGKDGWTDLTFMYDMIRIRNKSLCSSFLQIFSSEGCKMLEMTCEEHDKLAARSQFLTHTIGRILSEMEVEPTPIDTKGFQKLVQVKESSVRDSFDLFSGLFIHNRFARQQMKNLEVAVEKTKQKLEERSKELQDPIISKF。
3.权利要求1所述突变基因TyrA在烟草叶片酪氨酸物质含量或烟气苯酚释放量调控中的应用，其特征在于，所述调控是对野生型TyrA基因的CDS所对应有义突变位点进行突变，用于下调烟叶中酪氨酸物质含量和下调烟气中苯酚释放量。
4.权利要求2所述烟草TyrA突变蛋白在烟草叶片酪氨酸物质含量或烟气苯酚释放量调控中的应用，其特征在于，所述调控是对野生型TyrA蛋白所对应有义突变位点进行突变，用于下调烟叶中酪氨酸物质含量和下调烟气中苯酚释放量。
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