CN116536283A - 秋葵类胡萝卜素生物合成和抗逆性相关蛋白AePSY及其编码基因和应用 - Google Patents

秋葵类胡萝卜素生物合成和抗逆性相关蛋白AePSY及其编码基因和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116536283A
CN116536283A CN202211738375.9A CN202211738375A CN116536283A CN 116536283 A CN116536283 A CN 116536283A CN 202211738375 A CN202211738375 A CN 202211738375A CN 116536283 A CN116536283 A CN 116536283A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
plants
plant
transgenic
transgenic plant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211738375.9A
Other languages
English (en)
Inventor
王飞兵
陈嘉敏
李佳男
徐海亮
叶玉秀
王尊欣
万陈中
张妍宁
李扬
张雨柔
程小萌
李纯
胡来宝
陈新红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huaiyin Institute of Technology
Original Assignee
Huaiyin Institute of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huaiyin Institute of Technology filed Critical Huaiyin Institute of Technology
Priority to CN202211738375.9A priority Critical patent/CN116536283A/zh
Publication of CN116536283A publication Critical patent/CN116536283A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01032—15-Cis-phytoene synthase (2.5.1.32)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种秋葵类胡萝卜素生物合成和抗逆性相关蛋白AePSY及其编码基因和应用。本发明的实验证明，将所述蛋白的编码基因导入拟南芥中，转基因拟南芥中类胡萝卜素含量显著提高，同时提高转基因拟南芥植株的抗逆性。因此，类胡萝卜素生物合成和抗逆性相关蛋白AePSY及其编码基因在调控植物类胡萝卜素生物合成以及抗逆性中具有重要的理论意义和实用价值；本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

秋葵类胡萝卜素生物合成和抗逆性相关蛋白AePSY及其编码 基因和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种秋葵类胡萝卜素生物合成和抗逆性相关蛋白AePSY及其编码基因和在提高植物类胡萝卜素含量和抗逆性中的应用。
背景技术
秋葵含有丰富的蛋白质、游离氨基酸、类胡萝卜素、各类维生素和磷、铁、钾、钙等矿质元素及由果胶和多糖等组成的粘性物质，具有多种保健功能，深受广大消费者欢迎。在动物中，类胡萝卜素物质也起着尤为重要的作用，但动物自身不能合成类胡萝卜素，只能从日常饮食中摄取。研究表明，类胡萝卜素与人类的身体健康有着密切的关联，是人类饮食结构中不可缺少的营养物质，在猝灭自由基、增加人体免疫力、预防心脑血管疾病和预防癌症、眼睛保护等方面具有非常重要的作用。
高等植物中类胡萝卜素的合成起始于异戊二烯焦磷酸（IPP）途径。三个IPP分子和一个二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）分子在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）合酶（GGPS）催化下缩合形成C20GGPP。GGPP 是多种物质生物合成的共同前体，是形成植物类胡萝卜素最直接的前体。八氢番茄红素合成酶（PSY）是类胡萝卜素生物合成途径上的第一个合成酶，2个GGPP分子在PSY作用下缩合形成一个C40八氢番茄红素；大量研究表明，PSY是类胡萝卜代谢途径的限速酶。八氢番茄红素在八氢番茄红素脱氢酶（PDS）、ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）和类胡萝卜素异构酶（CRTISO）3个酶共同催化下形成番茄红素。番茄红素经过两次番茄红素β-环化酶（LCYB）环化作用生成β-胡萝卜素；番茄红素在LCYB和番茄红素ε-环化酶（LCYE）环化形成a-胡萝卜素。a-胡萝卜素经过一步β-胡萝卜素羟化酶（BCH）羟化反应生成β-隐黄质，再经过一步BCH羟化反应形成玉米黄质。a-胡萝卜素经过BCH和ε-胡萝卜素羟化酶（ECH）两步羟化反应生成叶黄素。
世界上存在大面积的盐渍化的土地。一般来说，盐浓度在0.2%-0.5%会影响作物的生长，但是盐碱地的盐分大都在0.6%-10%。大面积的盐渍化土地的存在严重影响了粮食生产，成为限制农业生产的主要因素。
因此，克隆秋葵类胡萝卜素生物合成关键基因AePSY，利用基因工程技术提高植物类胡萝卜素含量，同时改良植物抗逆性，培育高类胡萝卜素含量的秋葵新品种是改良秋葵营养保健功效的重要途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为如何有效提高植物品质，尤其是提高植物类胡萝卜素积累，并提高植物的抗旱性与耐盐性。
解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质，名称为AePSY蛋白或蛋白质AePSY，来源于秋葵（Abelmoschus esculentusL.），为如下（a）或（b）或（c）任一所示：
（a）氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
（b）SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；
（c）将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与（a）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。
其中，SEQ ID NO.2由384个氨基酸残基组成。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，蛋白标签（protein-tag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（％）。
上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述蛋白质AePSY的相关生物材料也在本发明的保护范围之内，该相关生物材料为如下（c1）~（c10）中任一所示：
（c1）编码上述蛋白质AePSY的核酸分子；
（c2）含有（c1）所述核酸分子的表达盒；
（c3）含有（c1）所述核酸分子的重组载体、或含有（c2）所述表达盒的重组载体；
（c4）含有（c1）所述核酸分子的重组微生物、或含有（c2）所述表达盒的重组微生物、或含有（c3）所述重组载体的重组微生物；
（c5）含有（c1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有（c2）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有（c3）所述重组载体的转基因植物细胞系；
（c6）含有（c1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有（c2）所述表达盒的转基因植物组织、或含有（c3）所述重组载体的转基因植物组织；
（c7）含有（c1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有（c2）所述表达盒的转基因植物器官、或含有（c3）所述重组载体的转基因植物器官；
（c8）含有（c1）所述核酸分子的转基因植株、或含有（c2）所述表达盒的转基因植株、或含有（c3）所述重组载体的转基因植株；
（c9）由（c8）所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物；
（c10）由（c9）所述组织培养物产生的原生质体。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
作为一种优选技术方案：编码上述蛋白质的核酸分子（即编码上述蛋白质的基因）是如下（a1）-（a3）中至少一种的DNA分子；
（a1）如SEQ ID NO 1所示的DNA分子；
（a2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码植物类胡萝卜素积累和抗逆性相关蛋白的DNA分子；
（a3）与（1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或者至少具有99%同源性且编码植物类胡萝卜素积累和抗逆性相关蛋白的DNA分子。
其中，SEQ ID NO.1由1155个核苷酸组成，其开放阅读框（ORF）为自5′末端起第1位-1155位，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述相关生物材料中，（c2）所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达蛋白质AePSY的DNA，该DNA不但可包括启动AePSY基因转录的启动子，还可包括终止AePSY基因转录的终止子。
上述相关生物材料中，（c3）所述重组载体可含有SEQ ID NO.2所示的用于编码蛋白质AePSY的DNA分子。
可用植物表达载体构建含有所述AePSY编码基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1300、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb等。使用AePSY构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子（pUbi）等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
在本发明具体的实施方式中，所述重组表达载体是在载体pCBGUS的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组表达载体；
所述载体pCBGUS是通过包括如下步骤的方法得到的：
（1）将pCAMBIA1301载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收载体大片段；
（2）将pBI121载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收包含gusA基因的片段；
（3）将步骤（1）中回收的载体大片段与步骤（2）中回收的包含gusA基因的片段连接，得到重组载体pCBGUS。
所述pCAMBIA1301载体购自CAMBIA公司；所述pBI121载体购自Clontech公司。
上述相关生物材料中，（c4）所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌。
上述相关生物材料中，（c7）所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。
上述相关生物材料中，（c9）所述组织培养物可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。
上述相关生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
含有所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因或编码上述蛋白质的核酸分子的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
上述的蛋白质，上述蛋白质AePSY的相关生物材料或，上述的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在以下（b1）或（b2）或（b3）或（b4）中的应用：
（b1）在调控植物中类胡萝卜素含量中的应用；优选为，在提高植物中类胡萝卜素含量中的应用；
（b2）在培育类胡萝卜素含量改变的转基因植物中的应用；优选为，在培育类胡萝卜素含量提高的转基因植物中的应用；
（b3）在调控植物抗逆性中的应用；优选为，在提高植物抗逆性中的应用；
（b4）在培育抗逆性改变的转基因植物中的应用；优选为，在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用。
上述的抗逆性为耐盐性和抗旱性中的至少一种。上述的类胡萝卜素含量为叶黄素（lutein）、玉米黄质（zeaxanthin）、β-隐黄质（β-cryptoxanthin）、α-胡萝卜素（α-carotene）、β-胡萝卜素（β-carotene）和总类胡萝卜素（total carotenoids）中至少一种的含量。
详细的，上述蛋白质AePSY，或上述蛋白质AePSY的相关生物材料的下述任意一种中的应用也在本发明的保护范围之内：
（b1）提高植物叶黄素含量；
（b2）制备提高植物叶黄素含量的产品；
（b3）提高植物玉米黄质含量；
（b4）制备提高植物玉米黄质含量的产品；
（b5）提高植物β-隐黄质含量；
（b6）制备提高植物β-隐黄质含量的产品；
（b7）提高植物α-胡萝卜素含量；
（b8）制备提高植物α-胡萝卜素含量的产品；
（b9）提高植物β-胡萝卜素含量；
（b10）制备提高植物β-胡萝卜素含量的产品；
（b11）提高植物总类胡萝卜素含量；
（b12）制备提高植物总类胡萝卜素含量的产品；
（b13）提高植物耐盐性；
（b14）制备提高植物耐盐性的产品；
（b15）提高植物抗旱性；
（b16）制备提高植物抗旱性的产品；
（b17）提高干旱和/或盐胁迫条件下植物的生根情况；
（b18）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物的生根情况的产品；
（b19）提高干旱和/或盐胁迫条件下植物的长势；
（b20）制备干旱和/或盐胁迫条件下植物的长势的产品；
（b21）制备干旱和/或盐胁迫条件下植物的存活率；
（b22）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物的存活率的产品；
（b23）提高干旱和/或盐胁迫条件下植物脱落酸含量；
（b24）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物脱落酸含量的产品；
（b25）提高干旱和/或盐胁迫条件下植物脯氨酸含量；
（b26）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物脯氨酸含量的产品；
（b27）降低干旱和/或盐胁迫条件下植物H2O2含量；
（b28）制备降低干旱和/或盐胁迫条件下植物H2O2含量的产品
（b29）降低干旱和/或盐胁迫条件下植物丙二醛含量；
（b30）制备降低干旱和/或盐胁迫条件下植物丙二醛含量的产品；
（b31）提高干旱和/或盐胁迫条件下植物SOD活性；
（b32）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物SOD活性的产品；
（b33）提高干旱和/或盐胁迫条件下植物POD活性；
（b34）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物POD活性的产品。
上述蛋白质AePSY或其相关生物材料在植物育种中的应用也在本发明的保护范围之内。
上述的应用具体可为将含有所述蛋白质AePSY或所述相关生物材料（如蛋白质AePSY编码基因AePSY）的植物与其它植物进行杂交以进行植物育种。
本发明进一步提供了提供一种培育高类胡萝卜素含量、耐盐性与抗旱性高的转基因植物的方法。
本发明培育高类胡萝卜素含量、抗旱性与耐盐性高的转基因植物的方法，包括提高目的植物中蛋白质AePSY的编码基因的表达量和/或所述蛋白质AePSY的含量和/或所述蛋白质AePSY的活性，得到转基因植物；所述转基因植物的类胡萝卜素含量、抗旱性与耐盐性高于所述目的植物。
上述方法中，所述提高目的植物中蛋白质AePSY的编码基因的表达量和/或所述蛋白质AePSY的含量和/或所述蛋白质AePSY的活性的方法为在目的植物中表达或过表达蛋白质AePSY。
上述方法中，所述表达或过表达的方法为将蛋白质AePSY的编码基因导入目的植物。
上述方法中，将蛋白质AePSY的编码基因导入目的植物可通过携带有本发明AePSY基因的植物表达载体导入目的植物中。携带有本发明基因AePSY的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。
上述方法中，所述蛋白质AePSY的编码基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
在本发明具体的实施方式中，所述携带有本发明基因AePSY的植物表达载体可为pCAMBIA1301-AePSY。具体的，pCAMBIA1301-AePSY利用限制性内切酶HindIII和EcoRI将SEQID NO.1所示的DNA分子插入至pCAMBIA1301载体得到的。
上述方法中，所述改良植物品质主要体现在提高植物的叶黄素含量、提高玉米黄质含量、提高β-隐黄质含量、提高α-胡萝卜素含量、提高β-胡萝卜素含量和提高总类胡萝卜素含量中的至少一种。
上述方法中，所述抗旱性与耐盐性高主要体现在提高植物的存活率、提高ABA含量、提高脯氨酸含量、提高SOD活性、提高POD活性、降低H2O2含量和降低丙二醛含量中的至少一种。
本发明中，所述植物是如下（e1）至（e4）中的任一种：
（e1）双子叶植物；
（e2）单子叶植物；
（e3）十字花科植物；
（e4）拟南芥。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明所提供的AePSY基因所编码的蛋白可以提高植物总类胡萝卜素积累和抗逆性：过表达AePSY基因可提高植物总类胡萝卜素积累和抗旱性与耐盐性。测定转基因植株中类胡萝卜素含量，结果显示，转基因拟南芥植株的叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、总类胡萝卜素含量与野生型拟南芥植株相比显著提高；叶黄素含量分别是野生型植株的1.35倍和1.20倍；玉米黄素含量分别是野生型植株的1.21倍和1.25倍；β-隐黄质含量分别是野生型植株的1.43倍和1.33倍；α-胡萝卜素含量分别是野生型植株的1.29倍和1.34倍；β-胡萝卜素含量分别是野生型植株的1.79倍和1.73倍；总类胡萝卜素含量分别是野生型植株1.49倍和1.42倍。在NaCl胁迫下，转基因植物表现出很好的生长状态，过表达转基因拟南芥材料的根长和鲜重分别比野生型WT材料提高了148～164%和65～76%；在PEG6000胁迫下，过表达转基因拟南芥材料的根长和鲜重分别比野生型WT材料提高了161～173%和73～79%；过表达转基因拟南芥的存活率显著高于野生型植株，较野生型植株相比分别提高了3563～3937%和1895～2120%，表达出很强的耐盐性和抗旱性；具体体现在过表达转基因拟南芥材料增加了ABA含量、脯氨酸含量、SOD活性、POD活性、降低了H2O2含量和丙二醛含量。结果表明，AePSY基因及其所编码的蛋白在植物提高类胡萝卜素含量以及对抗高盐、干旱过程中起着重要的作用。本发明所提供的AePSY蛋白及其编码基因在提高植物类胡萝卜素含量以及抗逆性研究中具有重要的应用价值。本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
附图说明
图1 本发明秋葵AePSY基因植物表达载体简图。
图2 本发明AePSY转基因拟南芥植株的PCR检测结果图。
图3 本发明AePSY基因在过表达拟南芥株系和野生型拟南芥植株中的表达。
图4本发明中叶黄素（lutein）、玉米黄质（zeaxanthin）、β-隐黄质（β-cryptoxanthin）、α-胡萝卜素（α-carotene）和β-胡萝卜素（β-carotene）的标准曲线图。
图5 本发明AePSY转基因拟南芥植株在200 mM NaCl和25% PEG6000的MS培养基上的生长和生根情况，WT为野生型拟南芥植株，L3和L7为转基因拟南芥植株。
图6 本发明AePSY转基因拟南芥植株耐盐性和抗旱性盆栽鉴定，WT为野生型拟南芥植株，L3和L7为转基因拟南芥植株。
图7 本发明AePSY转基因拟南芥植株抗逆生理生化指标测定，WT为野生型拟南芥植株，L3和L7为转基因拟南芥植株。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：
秋葵（Abelmoschus esculentus）品种中国台湾五福，由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。克隆载体PMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNAmarker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。
本发明中常规的分子生物学操作具体参见《分子克隆》【MolecularCloning. 2nded. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989】。
下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行【Sambook J, Frets EF,Mannsdes T et al. In: Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring HarborLaboratoryPress, 1989】。
实施例1 秋葵AePSY蛋白及其编码基因的获得
1.实验材料
参照王旭等（2014）【王旭，韩春乐，周亚楠，王春国，宋文芹，陈成彬. 黄秋葵查尔酮合成酶基因AeCHS的克隆与表达分析.植物遗传资源学报，2014，15(3)：561-567】的方法，将秋葵品种中国台湾五福植物叶片材料取下，液氮速冻，-80℃保存。
2.叶片总RNA提取和纯化
取中国台湾五福叶片约2.0 g，在液氮中研磨成粉状，加入10 mL离心管，用Applygen植物RNA提取试剂盒（Applygen Technologies Inc，Beijing）提取叶片总RNA，试剂盒中包括：Plant RNA Reagent，植物组织裂解、分离RNA、去除植物多糖和多酚；ExtractionReagent，有机抽提去除蛋白质、DNA、多糖和多酚；Plant RNA Aid，去除植物多糖多酚和次生代谢产物。利用QIAGEN OligotexMini mRNA Kit（QIAGEN，GmbH，Germany）从总RNA中纯化mRNA。最后，取1 μL于1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2 μL稀释至500 μL，用紫外分光光度计检测其质量（OD260）和纯度（OD260/OD280），提取中国台湾五福叶片总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5～2︰1，表明总RNA没有降解，纯化所得mRNA符合实验要求，可用于秋葵AePSY蛋白cDNA全长的克隆。
3.秋葵AePSY蛋白cDNA的全长克隆
以AePSY基因cDNA序列设计引物进行AePSY蛋白cDNA的全长克隆。
引物序列如下：
AePSY-GC-F：5’-TACTGTTATCATCTTTCACTTATCT-3’
AePSY-GC-R：5’-TTTATATATGTGTTAAAGAAAAAGA-3’
以中国台湾五福叶片总RNA经Oligo（dT）反转录为模板，用高保真的FastPfu酶，进行PCR扩增，PCR条件为95℃ 1min，随后95℃ 20 s，53℃ 20s和72℃ 1min，进行40个循环，最后72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得1155bp长度的扩增片段。
综合上述步骤的结果，获得了目的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列SEQID NO 1所示。序列表中序列SEQ ID NO 1由1155个碱基组成，自5’端第1位-第1155位碱基为其开放阅读框，编码具有序列表中序列SEQ ID NO 2所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列SEQ ID NO 2由384个氨基酸残基组成。将该基因命名为AePSY，将其编码的蛋白命名为AePSY。
实施例2 AePSY基因过表达载体的构建
将实施例1中测序鉴定正确的含有序列表SEQ ID NO 1所示核苷酸的DNA片段用BamH I和SacI进行双酶切，用1%琼脂糖凝胶回收DNA片段，通过T4DNA连接酶将回收的AePSY基因片段与含有双35S启动子pYPx245质粒连接，酶切鉴定和序列分析测定获得了含有葡萄AePSY基因的重组质粒AH128。该表达载体还包含gusA报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因，载体如图1所示。
实施例3 AePSY基因转化拟南芥
将实施例2构建的秋葵AePSY基因的植物表达载体pCAMBIA1301-AePSY用蘸花法转化拟南芥，具体方法如下：
1.农杆菌的准备
（1）将pCAMBIA1301-AePSY用电击法转化根癌农杆菌EHA105菌株（Biovector Co.,LTD）菌株，得到含有pCAMBIA1301-AePSY的重组农杆菌，并涂布于含有卡那霉素抗性的平板筛选转化子。
（2）挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基（利福平50 μg/mL，氯霉素100μg/mL）中，28℃，250rpm培养20h。
（3）取1 mL菌液转接入20-30 mL LB液体培养基（利福平50 μg/mL，氯霉素100μg/mL）中，28℃，250rpm培养约12h，测OD 600≈1.5。
（4）8000rpm，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液（5%（g/100ml）蔗糖，0.05%（v/v）Silwet L-77）并稀释至OD 600≈0.8。
2.拟南芥蘸花法转化
（1）将拟南芥的花薹浸入上述侵染液中，轻轻搅动约10s后取出，全部转化完毕后，用保鲜袋罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置，22℃避光培养，24h后去掉保鲜袋直立培养。
（2）初次转化4 d后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以对花序上发育的不同时期的花蕾进行转化，提高转化效率。
（3）生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱储存待用。
经过蘸花法转化的拟南芥生长约两个月后，正常开花结子。
实施例4 AePSY基因转基因拟南芥植株分子检测
1.转基因拟南芥种子的筛选
（1）称25-30 mg种子放入1.5 mL离心管。
（2）1 mL 75%乙醇消毒1 min（不停摇晃振荡），8000rpm离心5s，去上清。
（3）加入1 mL 过滤后的漂白粉（2.5%）消毒15 min （不停摇晃振荡，充分消毒），8000rpm离心5s，去上清。
（4）无菌水洗涤3-4次。
（5）将种子均匀的播撒到1/2 MS平板（潮霉素50μg/mL）上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置两天，22℃，16h光照培养10天。
（6）将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株（T1）培养至开花结实，收集T1植株上所结T2种子，进一步筛选得到T3种子。
2.转基因拟南芥植株PCR检测
（1）试验方法
用CTAB 法提取T3拟南芥转基因植株和野生型植株的基因组DNA。用常规方法进行PCR 检测，所使用的AePSY基因引物为：Primer 1：5’-ACAGCGTCTCCGACCTGATGCA-3’和Primer2：5’-AGTCAATGACCGCTGTTATGCG-3’。
（2）试验结果
电泳检测扩增结果见图2（图2中，泳道M为Maker；泳道W：水；泳道P：阳性对照（重组质粒pCAMBIA1301-AePSY）；泳道WT：野生型拟南芥植株；泳道L1-L10：为转化pCAMBIA1301-AePSY的拟南芥转基因植株）。从图中可见，转化pCAMBIA1301-AePSY的拟南芥拟转基因植株和阳性对照扩增出591 bp的目标条带，表明AePSY基因已经整合到拟南芥的基因组中，并证明这些再生植株为转基因植株；野生型拟南芥植株没有扩增出591bp的目标条带。转基因植株为后续功能分析。
3.转基因拟南芥植株qRT-PCR检测
（1）试验方法
将阳性T3代转AePSY拟南芥株系提取RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR，以未转化的野生型为对照。AtActin基因为内参：AtActin-F：5’-GCACCCTGTTCTTCTTACCGA-3’和AtActin-R：5’-AGTAAGGTCACGTCCAGCAAGG-3’；AePSY引物序列为：AePSY-F：5’-ACTGGCACGGTTTGGACTATCA -3’和AePSY-R：5’-TCAGCTCGGAAACACCCTTTT-3’。
（2）试验结果
结果如图3所示，WT为野生型拟南芥植株，L1-L10均为阳性T3代转AePSY拟南芥，表明AePSY在转基因拟南芥植株中有不同程度的表达。
实施例5高效液相色谱法测定AePSY基因转基因拟南芥植株叶片类胡萝卜素含量
1.标样的准备
（a）β-胡萝卜素（β-carotene）、玉米黄素（zeaxanthin）和叶黄素（lutein）标样购自sigma公司，商品号分别为 C4582-10MG、14681-1、95507；β-隐黄质（β-cryptoxanthin）标样购自北京华美互利生化公司，商品号为0317S。
（b）α-胡萝卜素（α-carotene）标样：由于α-carotene标样极易降解，没有进行商业化标样，必须自行提取。具体方法如下：
（1）将胡萝卜丁放入食物料理机中打碎。
（2）将打碎的胡萝卜浆状物导入盛有5g硅藻土的大研钵中，混匀。
（3）加入适量的预冷丙酮用力研磨，将胡萝卜中的胡萝卜素萃取到丙酮中。
（4）将研磨液倒入磨砂漏斗中进行抽真空，黄色液体会被抽到三角瓶中，磨砂漏斗中的干燥物质用勺取出，再放入到大研钵中，加适量预冷丙酮再次用力研磨。重复5-6次，直到研磨液的颜色变为无色。
（5）将三角瓶中的金黄色液体（胡萝卜素萃取液）分若干次倒入分液漏斗中，每倒入一次胡萝卜素萃取液后，均倒入300mL的ddH2O，静置稍许，将下层透明液层排出到废液瓶中。
（6）胡萝卜素萃取液经过若干次ddH2O洗涤后，最后一次用饱和食盐水洗涤，以彻底除去所形成的乳状物层，同样排出下层的透明废液。
（7）用吸水纸擦干分液漏斗的出水孔。将金黄色的石油醚层（高纯度胡萝卜素萃取液）排出倒入一个干燥的锥形瓶中；加入适量无水硫酸钠（Na2SO4）干燥（至无水Na2SO4结晶呈分散状态），摇晃，吸取萃取液中的残留水分。
（8）将处理后的金黄色液体倒入一干燥的球形瓶中，再加入100 mL 10%（g/100ml）KOH的甲醇溶液皂化和0.1%（g/100ml）二丁基羟基甲苯。
（9）将球形瓶接入旋转蒸发仪，旋转蒸发仪的另一接口接真空泵，真空蒸干液相石油醚，将有机相浓缩至大约5mL，之后用胶头滴管吸取石油醚（<5mL）以洗净球形瓶壁上的橙色固态物质，胶头滴管反复吹打橙色液相，使固态物质充分溶解，以获得更高纯度的胡萝卜素萃取液，工作时间约50 min。
（10）柱填料硅藻土和氧化镁（1︰1，w:w）于110℃活化4 h，在干燥器里冷却、干燥。准备一个铁架台，将玻璃层析柱放置在铁架台上并固定。在玻璃层析柱下方接好一个带口三角瓶，三角瓶通过皮管连接真空泵。
（11）填柱：将高温激活的硅藻土氧化镁混合物小心倒入玻璃层析柱内，不时用柱塞棒小心压实，填柱约20cm左右，确保柱面水平；再在柱面上方加入细化无水硫酸钠层1cm，之后塞入一层1.5cm左右的脱脂棉层，保证硫酸钠层和脱脂棉层的相平。再次压实后，打开真空泵，抽真空1 h。
（12）石油醚过柱：抽真空1小时后，不要关闭真空泵，沿柱壁加入石油醚润柱，调整真空泵，使流速为每秒2-3滴，并用柱塞棒保持固态面的水平，最终使石油醚润洗整个层析柱。
（13）用滴管将浓缩后的提取物小心转入层析柱中，至样品层进入到接近无水Na2SO4层时，再把冲洗圆底烧瓶的石油醚相转入层析柱中，过柱过程中要保证石油醚相始终高于无水Na2SO4层。
（14）层析工作过程中，一定要保证固相上方的石油醚液相的存在，石油醚一旦不足必须立即补充（层析柱需要避光，可以使用锡箔纸包裹）。
（15）α-胡萝卜素是第一个流出层析柱的物质，所以当分层的α-胡萝卜素层即将流出层析柱时，暂时关闭真空泵，更换新的带口三角瓶，以盛接α-胡萝卜素，连接好后，打开真空泵，金黄色的α-胡萝卜素会流出进入到三角瓶内（三角瓶同样需要避光）。
（16）将获得的金黄色液体倒入玻璃螺口离心管中保存，详细注明标样提取时间，parafilm严格密封，锡箔纸避光，-80℃冰箱直立保存。
（17）取出少量用N2气吹干（剩余的大量提取物密封、避光保存于-70℃，备用），用1mL V 乙腈︰V 甲醇︰V 二氯甲烷=45︰20︰35的溶剂溶解。
（18）用1mL一次性注射器使溶质完全溶解后，通过0.22μL的过滤器转移至2mL棕色进样小瓶中，50μL进样检测提取样品的纯度。
2.标准品的配置以及标准曲线的绘制
将提取并检测的α-胡萝卜素（α-carotene）直接用于混合标样的制备；叶黄素（Lutein）标样用无水乙醇和乙醚溶解；玉米黄素（Zeaxanthin）用丙酮溶解；β-隐黄质（β-cryptoxanthin）标样用乙醚和石油醚溶解；β-胡萝卜素（β-catotene）标样则用石油醚进行溶解。将标准样品溶解后各取100 μl 至小容量瓶（5 mL）定容，用紫外-可见光分光光度计在各成分特定波长下测定其吸光值。根据公式（1）计算浓度，公式（2）校对公式（1）计算所得浓度，用公式（3）配置成50 mL混合标样。混合标样需经氮气浓缩后，用石油醚定容。分别取1mL、2mL、3mL和5mL混合标样并分别重复3次共45mL建立标准曲线，标样测定值满足表1所列各成分所在的浓度范围内即可进行标准曲线的绘制。混合标样中叶黄素（lutein）、玉米黄素（zeaxanthin）、β-隐黄质（β-cryptoxanthin）、α-胡萝卜素（α-carotene）和β-胡萝卜素（β-carotene）的标准曲线如图4所示。
浓度c（μg/mL）=（OD × 104）/（A1% cm × 稀释倍数） （1）
式中OD 为吸光值；A1% cm为吸光系数；
校对浓度（μg/mL）=浓度c×纯度（%） （2）
纯度（%）= 标样HPLC峰面积/HPLC峰总面积×100
a =（50 × b）/c （3）
式中50为混合标样总体积50 mL；a 为加入标样量（μg/mL）
b 为浓度范围中值（μg/mL）；c为校对浓度（μg/mL）
表1 标准溶液吸光系数和浓度范围
成分 吸光系数（A1% cm） 测定波长（mm） 浓度范围（μg/mL）
叶黄素（lutein） 2550 445 0.116-150.000
玉米黄素（zeaxanthin） 2340 452 0.069-90.000
β-隐黄质（β-cryptoxanthin） 2386 449 0.022-14.000
α-胡萝卜素（α-catotene） 2800 444 0.013-8.000
β-胡萝卜素（β-catotene） 2592 450 0.016-10.000
3.转基因拟南芥植株类胡萝卜素提取
拟南芥叶片：取移栽至营养土中2 w的阳性T3代转AePSY拟南芥植株和野生型拟南芥植株的叶片，液氮速冻，然后磨成粉末状，各称取0.6g左右磨好的样品进行类胡萝卜素的提取。方法如下：
（1）对阳性T3代转AePSY拟南芥和野生型拟南芥植株样品进行磨样；
（2）称取0.6g磨好样品于25mL螺口玻璃离心管中，加入6mL 0.1％（g/100ml）BHT无水乙醇，涡旋20s；
（3）取出加120μL 80％（g/100ml）氢氧化钾溶液；
（4）涡旋20s，再放入85℃水浴5min；
（5）取出，再涡旋20s，再放入85℃水浴5min；
（6）取出后立即置于冰上，立即加3mL预冷ddH2O；
（7）加3mL正己烷，涡旋20s；
（8）2700rpm离心5min，用移液枪吸取上清至另一新的螺口玻璃离心管中；
（9）重复7,8步3次，将上清至另一新的螺口玻璃离心管中，终体积达到约12mL；
（10）在有上清液的新的螺口玻璃离心管中加3mL预冷ddH2O，涡旋，2700rpm离心5min；
（11）用移液枪吸取上层溶液（正己烷层）至新的尖底玻璃离心管中；
（12）再在水相的螺口管中加入3mL正己烷，涡旋，离心5min，再吸取上层正己烷层至新的尖底玻璃管中，重复2次；
（13）真空离心干燥总的正己烷；
（14）在干燥后的尖底玻璃离心管中加入1mL流动相，吸打混匀后通过0.22μm过滤器小心将液体加入棕色样品瓶中，用高效液相色谱法（HPLC）进行测定。
4.转基因拟南芥植株类胡萝卜素测定
（1）试验方法
利用高效液相色谱法测定（高效液相色谱仪为美国Agilent公司1200型），方法如下：
（1）将上述得到的待测类胡萝卜素溶液在旋转蒸发器中集中收集，并用N2干燥。
（2）立即使类胡萝卜素溶解于1 mL 乙腈︰甲醇︰二氯甲烷（V︰V︰V）=45︰20︰35的的溶剂中。
（3）将待测样品通过0.22 μL注射器过虑后，直接将10 μL样品到加入到色谱柱中。
（4）采用YMC C30色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 nm），以乙腈︰甲醇︰二氯甲烷（V︰V︰V）=75︰20︰5 为流动相，流速1.8 mL/min检测波长450 nm处的吸收峰的变化。
（5）每个待测样品，重复测定3次。
（2）试验结果
根据上述建立的叶黄素（lutein）、玉米黄素（zeaxanthin）、β-隐黄质（β-cryptoxanthin）、α-胡萝卜素（α-carotene）和β-胡萝卜素（β-carotene）的标准曲线（图4），分别测定转基因拟南芥叶片、转空载体对照拟南芥叶片和野生型对照拟南芥叶片的类胡萝卜素含量。其中总类胡萝卜素含量是五种类胡萝卜素含量之和。结果如表2所示，表2中L3和L7分别表示2个转基因拟南芥植株叶片的待测样品；CK代表转空载体对照拟南芥植株叶片；WT代表野生型拟南芥植株叶片。转空载体对照拟南芥植株叶片（CK）和野生型对照拟南芥植株叶片（WT）中的类胡萝卜素含量无显著差异；转基因拟南芥植株的叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、总类胡萝卜素含量与野生型拟南芥植株相比显著提高；叶黄素含量分别是野生型植株的1.35倍和1.20倍；玉米黄素含量分别是野生型植株的1.21倍和1.25倍；β-隐黄质含量分别是野生型植株的1.43倍和1.33倍；α-胡萝卜素含量分别是野生型植株的1.29倍和1.34倍；β-胡萝卜素含量分别是野生型植株的1.79倍和1.73倍；总类胡萝卜素含量分别是野生型植株1.49倍和1.42倍。
类胡萝卜素含量结果表明，过表达AePSY基因显著提高植物类胡萝卜素积累，AePSY基因在改良植物品质中具有重要作用。
表2AePSY转基因拟南芥植株叶片中类胡萝卜素含量
实施例6 AePSY基因转基因拟南芥植株耐盐性和抗旱性鉴定
1.转基因植株耐盐性和抗旱性离体鉴定
（1）试验方法
将转基因拟南芥和野生型种子，消毒灭菌后播种继代培养于200 mM NaCl和25%（g/100ml）PEG6000的1/2 MS培养基上，胁迫培养2周后，观察拟南芥植株的生长状态和生根情况。
（2）试验结果
结果显示，在盐胁迫、PEG6000处理条件下，结果见图5，过表达拟南芥材料和野生型材料均因为盐胁迫、PEG6000胁迫条件的存在，植株变小；但是过表达拟南芥材料和野生型WT相比，生长状态相对较好，生长势数据统计显示，在盐胁迫下，过表达拟南芥材料的根长和鲜重分别比野生型WT材料提高了148～164%和65～76%；在PEG6000胁迫下，过表达拟南芥材料的根长和鲜重分别比野生型WT材料提高了161～173%和73～79%；表明过表达AePSY基因显著提高转基因拟南芥植株的耐盐性和抗旱性。
2.转基因植株耐盐性和抗旱性盆栽鉴定
（1）试验方法
将转基因拟南芥和野生型种子在1/2 MS培养基上培养2周后，将植株移栽到盆中培养2周后，进行盐、干旱胁迫处理。用含有300 mM NaCl的1/2霍格兰营养液每个2天灌溉1次，每次200 mL，处理4周，观察植株生长情况并统计存活率；干旱处理6周后，观察植株生长情况，进行照相并调查其存活率。以下涉及存活率提高的计算方式是：
（过表达植株存活率-野生型植株存活率）*100%/野生型植株存活率。
（2）试验结果
结果显示，通过耐盐性和抗旱性盆栽鉴定，结果见图6，盐处理4周或干旱处理6周后，转基因植株的生长状态显著优于野生型植株，转基因植株的存活率显著高于野生性植株，较野生型植株相比分别提高了3563～3937%和1895～2120%；表明过表达AePSY基因显著提高转基因拟南芥植株的耐盐性和抗旱性。
实施例7 AePSY基因转基因拟南芥植株抗性生理生化指标的测定
1. ABA含量测定
（1）试验方法
ABA在植物逆境胁迫反应中具有重要作用。ABA可以提高植物的耐盐性，缓解盐分过多造成的渗透胁迫和离子胁迫，维持水分平衡，诱导植物渗透调剂物质脯氨酸大量积累，维持细胞膜结构的稳定性，提高保护性酶的活性。旱害胁迫时，ABA能明显减少叶片水分蒸发，降低叶片细胞膜透性，增加叶片细胞可溶性蛋白质含量，诱导生物膜系统保护酶形成，降低膜脂过氧化程度，增强抗氧化能力，提高植物的抗旱性。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao.AtMYB12regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenicArabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测拟南芥植株的ABA含量。拟南芥植株为上述盆栽鉴定中无胁迫处理2周的拟南芥植株、上述盆栽鉴定中盐处理1周的拟南芥植株和上述盆栽鉴定中干旱处理2周的拟南芥植株。实验需重复三次，结果取平均值。
（2）试验结果
实验结果见图7中A（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫）。结果表明，转基因拟南芥L3植株和L7植株的ABA含量显著高于野生型拟南芥植株。
2.脯氨酸含量测定
（1）试验方法
植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到盐、干旱等胁迫时，游离的氨基酸便会大量积累，并且积累指数和植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可以作为植物抗逆性的一项生化指标。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao.AtMYB12regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenicArabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测拟南芥植株的脯氨酸含量。拟南芥植株为上述盆栽鉴定中无胁迫处理2周的拟南芥植株、上述盆栽鉴定中盐处理1周的拟南芥植株和上述盆栽鉴定中干旱处理2周的拟南芥植株。实验需重复三次，结果取平均值。
（2）试验结果
实验结果见图7中B（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫）。结果表明，转基因拟南芥L3植株和L7植株的脯氨酸含量显著高于野生型拟南芥植株。
3. H2O2含量测定
（1）试验方法
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。因此，H2O2的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao.AtMYB12regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenicArabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测拟南芥植株的MDA含量。拟南芥植株为上述盆栽鉴定中无胁迫处理2周的拟南芥植株、上述盆栽鉴定中盐处理1周的拟南芥植株和上述盆栽鉴定中干旱处理2周的拟南芥植株。实验需重复三次，结果取平均值。
（2）试验结果
实验结果见图7中C（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫）。结果表明，转基因拟南芥L3植株和L7植株的H2O2含量显著低于野生型拟南芥植株。
4. MDA含量测定
（1）试验方法
植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度，即MDA的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao.AtMYB12regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenicArabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测拟南芥植株的MDA含量。拟南芥植株为上述盆栽鉴定中无胁迫处理2周的拟南芥植株、上述盆栽鉴定中盐处理1周的拟南芥植株和上述盆栽鉴定中干旱处理2周的拟南芥植株。实验需重复三次，结果取平均值。
（2）试验结果
实验结果见图7中D（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫）。结果表明，转基因拟南芥L3植株和L7植株的MDA含量显著低于野生型拟南芥植株
5. SOD活性测定
（1）试验方法
超氧化物歧化酶（SOD）活性可以作为植物抗逆性的一项生理生化指标。SOD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao.AtMYB12regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenicArabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测拟南芥植株的SOD活性。拟南芥植株为上述盆栽鉴定中无胁迫处理2周的拟南芥植株、上述盆栽鉴定中盐处理1周的拟南芥植株和上述盆栽鉴定中干旱处理2周的拟南芥植株。实验需重复三次，结果取平均值。
（2）试验结果
实验结果见图7中E（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫）。结果表明，转基因拟南芥L3植株和L7植株的SOD活性显著高于野生型拟南芥植株。
6. POD活性测定
（1）试验方法
过氧化物酶（POD）活性可以作为植物抗逆性的一项生理生化指标。POD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao.AtMYB12regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenicArabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测拟南芥植株的POD活性。拟南芥植株为上述盆栽鉴定中无胁迫处理2周的拟南芥植株、上述盆栽鉴定中盐处理1周的拟南芥植株和上述盆栽鉴定中干旱处理2周的拟南芥植株。实验需重复三次，结果取平均值。
（2）试验结果
实验结果见图7中F（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫）。结果表明，转基因拟南芥L3植株和L7植株的POD活性显著高于野生型拟南芥植株。
生理生化指标的测定结果表明，过表达AePSY基因显著提高转基因拟南芥植株的耐盐性和抗旱性。

Claims (10)

1.一种蛋白，是如下（a）或（b）或（c）：
（a）氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
（b）SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；
（c）将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与（a）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的相关生物材料，其特征在于：该相关生物材料为如下（c1）~（c10）中任一所示：
（c1）编码权利要求1中所述蛋白的核酸分子；
（c2）含有（c1）所述核酸分子的表达盒；
（c3）含有（c1）所述核酸分子的重组载体、或含有（c2）所述表达盒的重组载体；
（c4）含有（c1）所述核酸分子的重组微生物、或含有（c2）所述表达盒的重组微生物、或含有（c3）所述重组载体的重组微生物；
（c5）含有（c1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有（c2）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有（c3）所述重组载体的转基因植物细胞系；
（c6）含有（c1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有（c2）所述表达盒的转基因植物组织、或含有（c3）所述重组载体的转基因植物组织；
（c7）含有（c1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有（c2）所述表达盒的转基因植物器官、或含有（c3）所述重组载体的转基因植物器官；
（c8）含有（c1）所述核酸分子的转基因植株、或含有（c2）所述表达盒的转基因植株、或含有（c3）所述重组载体的转基因植株；
（c9）由（c8）所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物；
（c10）由（c9）所述组织培养物产生的原生质体。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子是如下（a1）-（a3）中任何一种的DNA分子；
（a1）如SEQ ID NO 1所示的DNA分子；
（a2）在严格条件下与（a1）限定的DNA序列杂交且编码植物类胡萝卜素含量和抗逆性相关蛋白的DNA分子；
（a3）与（a1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或者至少具有99%同源性且编码植物类胡萝卜素积累和抗逆性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求3中所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
5.权利要求1中所述的蛋白质，权利要求2或3中所述的相关生物材料，或权利要求4中所述的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在以下（b1）~（b4）至少一种中的应用：
（b1）在调控植物中类胡萝卜素含量中的应用；
（b2）在培育类胡萝卜素含量改变的转基因植物中的应用；
（b3）在调控植物抗逆性中的应用；
（b4）在培育抗逆性改变的转基因植物中的应用。
6.一种培育类胡萝卜素含量或/和抗逆性高的转基因植物的方法，其特征在于，该方法为提高目的植物中权利要求1所述蛋白的含量或活性，或者提高目的植物中编码权利要求1所述蛋白的核酸分子的表达量得到转基因植物；所述转基因植物的类胡萝卜素含量和抗逆性中的至少一种高于所述目的植物。
7.一种培育类胡萝卜素含量或/和抗逆性高的植物的方法，为培育权利要求6所述方法得到的转基因植物。
8.如权利要求1中所述的蛋白，或，权利要求2或3中所述的相关生物材料，或，权利要求5中所述的应用，或，权利要求6或7中所述的方法，其特征在于：其中所述的抗逆性为耐盐性和抗旱性中的至少一种。
9.如权利要求1中所述的蛋白，或，权利要求2或3中所述的相关生物材料，或，权利要求5中所述的应用，或，权利要求6或7中所述的方法，其特征在于：其中所述的类胡萝卜素含量为叶黄素（lutein）、玉米黄质（zeaxanthin）、β-隐黄质（β-cryptoxanthin）、α-胡萝卜素（α-carotene）、β-胡萝卜素（β-carotene）和总类胡萝卜素（total carotenoids）中至少一种的含量。
10.如权利要求1中所述的蛋白，或，权利要求2或3中所述的相关生物材料，或，权利要求5中所述的应用，或，权利要求6或7中所述的方法，其特征在于：其中所述的植物是如下（c1）至（c4）中的任一种：
（c1）双子叶植物；
（c2）单子叶植物；
（c3）十字花科植物；
（c4）拟南芥。
CN202211738375.9A 2022-12-31 2022-12-31 秋葵类胡萝卜素生物合成和抗逆性相关蛋白AePSY及其编码基因和应用 Pending CN116536283A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211738375.9A CN116536283A (zh) 2022-12-31 2022-12-31 秋葵类胡萝卜素生物合成和抗逆性相关蛋白AePSY及其编码基因和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211738375.9A CN116536283A (zh) 2022-12-31 2022-12-31 秋葵类胡萝卜素生物合成和抗逆性相关蛋白AePSY及其编码基因和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116536283A true CN116536283A (zh) 2023-08-04

Family

ID=87454821

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211738375.9A Pending CN116536283A (zh) 2022-12-31 2022-12-31 秋葵类胡萝卜素生物合成和抗逆性相关蛋白AePSY及其编码基因和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116536283A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1900112A (zh) * 2006-07-24 2007-01-24 中国科学院植物研究所 一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用
CN109593738A (zh) * 2019-01-16 2019-04-09 淮阴工学院 秋葵类胡萝卜素生物合成和抗逆性相关蛋白AePDS及其编码基因与应用
CN109678943A (zh) * 2019-01-16 2019-04-26 淮阴工学院 蛋白AeZDS及其编码基因在提高植物类胡萝卜素积累和抗逆性中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1900112A (zh) * 2006-07-24 2007-01-24 中国科学院植物研究所 一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用
CN109593738A (zh) * 2019-01-16 2019-04-09 淮阴工学院 秋葵类胡萝卜素生物合成和抗逆性相关蛋白AePDS及其编码基因与应用
CN109678943A (zh) * 2019-01-16 2019-04-26 淮阴工学院 蛋白AeZDS及其编码基因在提高植物类胡萝卜素积累和抗逆性中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI Y等: "Abelmoschus esculentus phytoene synthase mRNA, complete cds", GENBANK, 29 September 2018 (2018-09-29), pages 372369 *
LUCIANA C. CIDADE等: "Ectopic expression of a fruit phytoene synthase from Citrus paradisi Macf. promotes abiotic stress tolerance in transgenic tobacco", MOL BIOL REP, vol. 39, no. 12, 26 September 2012 (2012-09-26) *
丁旭等: "胡萝卜DcPSY2基因克隆及其在非生物胁迫相应中的表达分析", 农业生物技术学报, vol. 27, no. 12, 12 December 2019 (2019-12-12) *
李永平等: "黄秋葵八氢番茄红素合成酶PSY基因的克隆与分析", 中国细胞生物学学报, vol. 41, no. 10, 12 November 2019 (2019-11-12), pages 1939 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108864267B (zh) 甘薯类胡萝卜素合成和耐盐抗旱相关蛋白IbARF5及其编码基因与应用
US11512322B2 (en) Transgenic plant and the method for producing the same
CN107475263B (zh) 参与植株形态建成和花发育的白桦spl2基因及其蛋白
CN108047320A (zh) 蛋白GmMYB12及编码基因在提高大豆异黄酮积累和耐盐性中的应用
CN109111514A (zh) 兼抗纹枯病和根腐病的转基因小麦的培育方法及其相关生物材料
CN111218470B (zh) 一种调控植物抗逆性的方法
CN109837296A (zh) 玉米基因ZmNAC77的一个耐盐耐旱新功能及其应用
KR100896487B1 (ko) 식물 스트레스 저항성을 증가시키는 ＯｓＲＤＣＰ１유전자및 상기 유전자가 도입된 형질전환 식물체
CN109678943B (zh) 蛋白AeZDS及其编码基因与应用
CN116478259A (zh) 植物类胡萝卜素生物强化和抗逆性相关蛋白AeLCYB及其编码基因和应用
CN113621040B (zh) 杜梨耐盐基因PbHSF3A及其在植物耐盐遗传改良中的应用
CN111218455A (zh) 来源于甘薯的IbAITR5基因及其编码的蛋白质和应用
CN116445464A (zh) 一种提高植物类胡萝卜素积累和耐盐性相关蛋白AeLCYE及其编码基因与应用
CN109593738B (zh) 秋葵类胡萝卜素生物合成和抗逆性相关蛋白AePDS及其编码基因与应用
CN106591324B (zh) 谷子SiASR4基因及应用
CN107663232B (zh) 植物抗逆相关蛋白OsIAA18及其编码基因与应用
CN115851660A (zh) 蛋白OsPIS及编码基因在提高植物抗逆性中的应用
CN114480414B (zh) 一种增强植物耐寒性或培育高耐寒性植物的方法
CN115948456A (zh) 一种可提升广藿香醇合成量的融合基因及方法
CN116536283A (zh) 秋葵类胡萝卜素生物合成和抗逆性相关蛋白AePSY及其编码基因和应用
CN111171124B (zh) 一种植物抗逆性相关蛋白VvIAA18及编码基因与应用
KR102000465B1 (ko) 식물의 키다리병 저항성을 증진시키는 방법
CN112391406A (zh) 促进草莓生长的方法及其所用生物材料
WO2007003346A2 (en) Fungicidal agents
CN113881689B (zh) 一种苹果离子转运体MdCAX2L-1的转基因植株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination