CN116445464A - 一种提高植物类胡萝卜素积累和耐盐性相关蛋白AeLCYE及其编码基因与应用 - Google Patents

一种提高植物类胡萝卜素积累和耐盐性相关蛋白AeLCYE及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高植物类胡萝卜素积累和耐盐性相关蛋白AeLCYE及其编码基因与应用。本发明提供一种蛋白，是(a)或(b)：(a)由序列表中序列SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列SEQ ID NO 2所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由序列SEQ ID NO 2衍生的蛋白质。本发明将蛋白的编码基因导入拟南芥中，转基因拟南芥中类胡萝卜素含量显著提高，同时提高转基因拟南芥植株的耐盐性。类胡萝卜素生物合成和抗逆性相关蛋白AeLCYE及其编码基因在调控植物类胡萝卜素生物合成以及耐盐性中具有重要价值。

Description

一种提高植物类胡萝卜素积累和耐盐性相关蛋白AeLCYE及其 编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种提高植物类胡萝卜素积累和耐盐性相关蛋白AeLCYE及其编码基因与应用。
背景技术
秋葵含有丰富的蛋白质、游离氨基酸、类胡萝卜素、各类维生素和磷、铁、钾、钙等矿质元素及由果胶和多糖等组成的粘性物质，具有多种保健功能，深受广大消费者欢迎。在动物中，类胡萝卜素物质也起着尤为重要的作用，但动物自身不能合成类胡萝卜素，只能从日常饮食中摄取。研究表明，类胡萝卜素与人类的身体健康有着密切的关联，是人类饮食结构中不可缺少的营养物质，在猝灭自由基、增加人体免疫力、预防心脑血管疾病和预防癌症、眼睛保护等方面具有非常重要的作用。
高等植物中类胡萝卜素的合成起始于异戊二烯焦磷酸(IPP)途径。三个IPP分子和一个二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)分子在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)合酶(GGPS)催化下缩合形成C20 GGPP。GGPP是多种物质生物合成的共同前体，是形成植物β-胡萝卜素最直接的前体。2个GGPP分子在八氢番茄红素合成酶(PSY)作用下缩合形成一个C40八氢番茄红素。八氢番茄红素在八氢番茄红素脱氢酶(PDS)、ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)和β-胡萝卜素异构酶(CRTISO)3个酶共同催化下形成番茄红素。番茄红素经过两次番茄红素β-环化酶(LCYB)环化作用生成β-胡萝卜素；番茄红素在LCYB和番茄红素ε-环化酶(LCYE)环化形成α-胡萝卜素。α-胡萝卜素经过一步β-胡萝卜素羟化酶(BCH)羟化反应生成β-隐黄质，再经过一步BCH羟化反应形成玉米黄质。α-胡萝卜素经过BCH和ε-胡萝卜素羟化酶(ECH)两步羟化反应生成叶黄素。
世界上存在大面积的盐渍化的土地。据统计，全世界共有8亿hm2盐碱地，在灌溉地区还有占耕地面积33％的次生盐渍化土地，土壤的盐溃化严重影响现代农业的发展。一般来说，盐浓度在0.2％-0.5％会影响作物的生长，但是盐碱地的盐分大都在0.6％-10％。大面积的盐渍化土地的存在严重影响了粮食生产，成为限制农业生产的主要因素。
因此，克隆秋葵类胡萝卜素生物合成关键基因AeLCYE，利用基因工程技术提高植物类胡萝卜素含量，同时改良植物抗逆性，培育高类胡萝卜素含量的秋葵新品种是改良秋葵营养保健功效的重要途径。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供一种提高植物类胡萝卜素积累和耐盐性相关蛋白AeLCYE及其编码基因与应用。
技术方案：本发明首先提供了一种蛋白质，名称为AeLCYE蛋白或蛋白质AeLCYE，来源于秋葵(Abelmoschus esculentus L.)，为如下(a1)或(a2)或(a3)任一所示：
(a1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
(a2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；
(a3)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。
其中，SEQ ID NO.2由534个氨基酸残基组成。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
本发明还提供蛋白质AeLCYE的下述任一中的应用：
(b1)提高植物叶黄素含量；
(b2)制备提高植物叶黄素含量的产品；
(b3)提高植物玉米黄质含量；
(b4)制备提高植物玉米黄质含量的产品；
(b5)提高植物β-隐黄质含量；
(b6)制备提高植物β-隐黄质含量的产品；
(b7)提高植物α-胡萝卜素含量；
(b8)制备提高植物α-胡萝卜素含量的产品；
(b9)提高植物β-胡萝卜素含量；
(b10)制备提高植物β-胡萝卜素含量的产品；
(b11)提高植物总类胡萝卜素含量；
(b12)制备提高植物总类胡萝卜素含量的产品；
(b13)提高植物耐盐性；
(b14)制备提高植物耐盐性的产品；
(b15)提高盐胁迫条件下植物的生根情况；
(b16)制备提高盐胁迫条件下植物的生根情况的产品；
(b17)提高盐胁迫条件下植物的长势；
(b18)制备盐胁迫条件下植物的长势的产品；
(b19)制备盐胁迫条件下植物的存活率；
(b20)制备提高盐胁迫条件下植物的存活率的产品；
(b21)提高盐胁迫条件下植物可溶性糖含量；
(b22)制备提高盐胁迫条件下植物可溶性糖含量的产品；
(b23)提高盐胁迫条件下植物相对含水量；
(b24)制备提高盐胁迫条件下植物相对含水量的产品；
(b25)降低干盐胁迫条件下植物H2O2含量；
(b26)制备降低盐胁迫条件下植物H2O2含量的产品
(b27)降低盐胁迫条件下植物丙二醛含量；
(b28)制备降低盐胁迫条件下植物丙二醛含量的产品；
(b29)提高盐胁迫条件下植物SOD活性；
(b30)制备提高盐胁迫条件下植物SOD活性的产品；
(b31)提高盐胁迫条件下植物CAT活性；
(b32)制备提高盐胁迫条件下植物CAT活性的产品；
(b33)提高盐胁迫条件下植物APX活性；
(b34)制备提高盐胁迫条件下植物APX活性的产品；
(b35)提高盐胁迫条件下植物POD活性；
(b36)制备提高盐胁迫条件下植物POD活性的产品；
上述蛋白质AeLCYE相关生物材料也属于本发明的保护范围，本发明还提供了蛋白质AeLCYE相关生物材料的新用途。
本发明蛋白质AeLCYE相关生物材料的下述任一种中的应用也在本发明的保护范围之内：
(b1)提高植物叶黄素含量；
(b2)制备提高植物叶黄素含量的产品；
(b3)提高植物玉米黄质含量；
(b4)制备提高植物玉米黄质含量的产品；
(b5)提高植物β-隐黄质含量；
(b6)制备提高植物β-隐黄质含量的产品；
(b7)提高植物α-胡萝卜素含量；
(b8)制备提高植物α-胡萝卜素含量的产品；
(b9)提高植物β-胡萝卜素含量；
(b10)制备提高植物β-胡萝卜素含量的产品；
(b11)提高植物总类胡萝卜素含量；
(b12)制备提高植物总类胡萝卜素含量的产品；
(b13)提高植物耐盐性；
(b14)制备提高植物耐盐性的产品；
(b15)提高盐胁迫条件下植物的生根情况；
(b16)制备提高盐胁迫条件下植物的生根情况的产品；
(b17)提高盐胁迫条件下植物的长势；
(b18)制备盐胁迫条件下植物的长势的产品；
(b19)制备盐胁迫条件下植物的存活率；
(b20)制备提高盐胁迫条件下植物的存活率的产品；
(b21)提高盐胁迫条件下植物可溶性糖含量；
(b22)制备提高盐胁迫条件下植物可溶性糖含量的产品；
(b23)提高盐胁迫条件下植物相对含水量；
(b24)制备提高盐胁迫条件下植物相对含水量的产品；
(b25)降低干盐胁迫条件下植物H2O2含量；
(b26)制备降低盐胁迫条件下植物H2O2含量的产品
(b27)降低盐胁迫条件下植物丙二醛含量；
(b28)制备降低盐胁迫条件下植物丙二醛含量的产品；
(b29)提高盐胁迫条件下植物SOD活性；
(b30)制备提高盐胁迫条件下植物SOD活性的产品；
(b31)提高盐胁迫条件下植物CAT活性；
(b32)制备提高盐胁迫条件下植物CAT活性的产品；
(b33)提高盐胁迫条件下植物APX活性；
(b34)制备提高盐胁迫条件下植物APX活性的产品；
(b35)提高盐胁迫条件下植物POD活性；
(b36)制备提高盐胁迫条件下植物POD活性的产品；
上述应用中，所述相关生物材料为下述(c1)-(c10)中的任一种：
(c1)编码蛋白质AeLCYE的核酸分子；
(c2)含有(c1)所述核酸分子的表达盒；
(c3)含有(c1)所述核酸分子的重组载体、或含有(c2)所述表达盒的重组载体；
(c4)含有(c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有(c2)所述表达盒的重组微生物、或含有(c3)所述重组载体的重组微生物；
(c5)含有(c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有(c2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有(c3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
(c6)含有(c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有(c2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有(c3)所述重组载体的转基因植物组织；
(c7)含有(c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有(c2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有(c3)所述重组载体的转基因植物器官；
(c8)含有(c1)所述核酸分子的转基因植株、或含有(c2)所述表达盒的转基因植株、或含有(c3)所述重组载体的转基因植株；
(c9)由(c8)所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物；
(c10)由(c9)所述组织培养物产生的原生质体。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述相关生物材料中，(c1)编码蛋白质AeLCYE的核酸分子具体可为如下(d1)或(d2)或(d3)中任一所示
(d1)SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
(d2)编码序列为SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
(d3)在严格条件下与(d1)或(d2)限定的DNA分子杂交，且编码蛋白质AeLCYE的DNA分子。
其中，SEQ ID NO.1由1605个核苷酸组成，其开放阅读框(ORF)为自5′末端起第1位-1605位，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
含有所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
上述相关生物材料中，(c2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达蛋白质AeLCYE的DNA，该DNA不但可包括启动AeLCYE基因转录的启动子，还可包括终止AeLCYE基因转录的终止子。
上述相关生物材料中，(c3)所述重组载体可含有SEQ ID NO.2所示的用于编码蛋白质AeLCYE的DNA分子。
可用植物表达载体构建含有所述AeLCYE编码基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1300、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pBl121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb等。使用AeLCYE构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
在本发明具体的实施方式中，所述重组表达载体是在载体pCBGUS的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组表达载体；
所述载体pCBGUS是通过包括如下步骤的方法得到的：
(1)将pCAMBIA1301载体经过HindIII和EcoR I双酶切，回收载体大片段；
(2)将pBI121载体经过HindIII和EcoR I双酶切，回收包含gusA基因的片段；
(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含gusA基因的片段连接，得到重组载体pCBGUS。
所述pCAMBIA1301载体购自CAMBIA公司；所述pBI121载体购自Clontech公司。
上述相关生物材料中，(c4)所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌。
上述相关生物材料中，(c7)所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。
上述相关生物材料中，(c9)所述组织培养物可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。
上述相关生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
上述蛋白质AeLCYE或其相关生物材料在植物育种中的应用也在本发明的保护范围之内。
上述应用中，植物育种中的应用具体可为将含有所述蛋白质AeLCYE或所述相关生物材料(如蛋白质AeLCYE编码基因AeLCYE)的植物与其它植物进行杂交以进行植物育种。
本发明进一步提供了提供一种培育高类胡萝卜素含量与耐盐性高的转基因植物的方法。
本发明培育高类胡萝卜素含量与耐盐性高的转基因植物的方法，包括提高目的植物中蛋白质AeLCYE的基因的表达量和/或所述蛋白质AeLCYE的含量和/或所述蛋白质AeLCYE的活性，得到转基因植物；所述转基因植物的类胡萝卜素含量与耐盐性高于所述目的植物。
上述方法中，所述提高目的植物中蛋白质AeLCYE的基因的表达量和/或所述蛋白质AeLCYE的含量和/或所述蛋白质AeLCYE的活性的方法为在目的植物中表达或过表达蛋白质AeLCYE。
上述方法中，所述表达或过表达的方法为将蛋白质AeLCYE的编码基因导入目的植物。
上述方法中，将蛋白质AeLCYE的编码基因导入目的植物可通过携带有本发明AeLCYE基因的植物表达载体导入目的植物中。携带有本发明基因AeLCYE的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。
上述方法中，所述蛋白质AeLCYE的编码基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
在本发明具体的实施方式中，所述携带有本发明基因AeLCYE的植物表达载体可为pCAMBIA1301-AeLCYE。具体的，pCAMBIA1301-AeLCYE利用限制性内切酶Hind III和EcoR I将SEQ ID NO.1所示的DNA分子插入至pCAMBIA1301载体得到的。
上述方法中，所述改良植物品质主要体现在提高植物的叶黄素含量、提高玉米黄质含量、提高β-隐黄质含量、提高α-胡萝卜素含量、提高β-胡萝卜素含量和提高总类胡萝卜素含量。
上述方法中，所述耐盐性高主要体现在提高植物的存活率、提高可溶性糖含量、提高相对含水量、提高SOD活性、提高CAT活性、提高APX活性、提高POD活性、降低H2O2含量和降低丙二醛含量。
本发明中，所述植物是如下(e1)至(e4)中的任一种：
(e1)双子叶植物；
(e2)单子叶植物；
(e3)十字花科植物；
(e4)拟南芥。
本发明所提供的AeLCYE基因所编码的蛋白可以提高植物类胡萝卜素积累和抗逆性：过表达AeLCYE基因可提高植物总类胡萝卜素积累和耐盐性。测定转基因植株中类胡萝卜素含量，结果显示，转基因拟南芥植株的叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、总类胡萝卜素含量与野生型拟南芥植株相比显著提高；叶黄素含量分别是野生型植株的1.08～1.28倍；玉米黄素含量分别是野生型植株的1.03～1.11倍；β-隐黄质含量分别是野生型植株的1.15～1.29倍；α-胡萝卜素含量分别是野生型植株的1.54～1.84倍；β-胡萝卜素含量分别是野生型植株的1.23～1.39倍；总类胡萝卜素含量分别是野生型植株1.13～1.32倍。在NaCl胁迫下，转基因植物表现出很好的生长状态，过表达转基因拟南芥材料的根长和鲜重分别比野生型WT材料提高了78～172％和19～38％；过表达转基因拟南芥的存活率和鲜重显著高于野生型植株，较野生型植株相比分别提高了14731～17008％和153～188％，表达出很强的耐盐性；具体体现在过表达转基因拟南芥材料增加了可溶性糖含量、相对含水量、SOD活性、CAT活性、APX活性、提POD活性、降低了H202含量和丙二醛含量。结果表明，AeLCYE基因及其所编码的蛋白在植物提高类类胡萝卜素含量以及对抗高盐过程中起着重要的作用。
有益效果：与现有技术相比，具有如下优势：本发明所提供的AeLCYE蛋白及其编码基因在提高植物类胡萝卜素含量以及抗逆性研究中具有重要的应用价值。本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
附图说明
图1本发明秋葵AeLCYE基因植物表达载体简图；
图2本发明AeLCYE转基因拟南芥植株的PCR检测结果图；
图3本发明AeLCYE基因在过表达拟南芥株系和野生型拟南芥植株中的表达；
图4本发明中叶黄素(lutein)、玉米黄质(zeaxanthin)、β-隐黄质(β-cryptoxanthin)、α-胡萝卜素(α-carotene)和β-胡萝卜素(β-carotene)的标准曲线图；
图5本发明AeLCYE转基因拟南芥植株在200mM NaCl和25％PEG6000的MS培养基上的生长和生根情况(A)与盆栽鉴定(B)，WT为野生型拟南芥植株，L1、L2、L3和L4为转基因拟南芥植株；
图6本发明AeLCYE转基因拟南芥植株抗逆生理生化指标测定，WT为野生型拟南芥植株，L1、L2、L3和L4为转基因拟南芥植株。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：
秋葵(Abelmoschus esculentus)品种中国台湾五福，由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。
大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。克隆载体PMD-18-Simp1e T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCRbuffer和DNAmarker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。
本发明中常规的分子生物学操作具体参见《分子克隆》【Molecular Cloning.2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989】。
下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行【Sambook J，Frets EF,Mannsdes T et al.In：Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989】。
实施例1 秋葵AeLCYE蛋白及其编码基因的获得
1.实验材料
参照王旭等(2014)【王旭，韩春乐，周亚楠，王春国，宋文芹，陈成彬.黄秋葵查尔酮合成酶基因AeCHS的克隆与表达分析.植物遗传资源学报，2014，15(3)：561-567】的方法，将秋葵品种中国台湾五福植物叶片材料取下，液氮速冻，-80°C保存。
2.叶片总RNA提取和纯化
取中国台湾五福叶片约2.0g，在液氮中研磨成粉状，加入10mL离心管，用Applygen植物RNA提取试剂盒(Applygen Technologies Inc，Beijing)提取叶片总RNA，试剂盒中包括：Plant RNA Reagent，植物组织裂解、分离RNA、去除植物多糖和多酚；ExtractionReagent，有机抽提去除蛋白质、DNA、多糖和多酚；Plant RNAAid，去除植物多糖多酚和次生代谢产物。利用QIAGEN Oligotex Mini mRNAKit(QIAGEN，GmbH，Germany)从总RNA中纯化mRNA。最后，取1μL于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2μL稀释至500μL，用紫外分光光度计检测其质量(OD260)和纯度(OD260/OD280)，提取中国台湾五福叶片总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5～2∶1，表明总RNA没有降解，纯化所得mRNA符合实验要求，可用于秋葵AeLCYE蛋白cDNA全长的克隆。
3.秋葵AeLCYE蛋白cDNA的全长克隆
以AeLCYE基因cDNA序列设计引物进行AeLCYE蛋白cDNA的全长克隆。
引物序列如下：
AeLCYE-GC-F：5’-ATGTTTTTGTTAGCTCCGAAGG-3’
AeLCYE-GC-R：5’-CTAGATTGTG AGATATGTTCT-3’
以中国台湾五福叶片总RNA经Oligo(dT)反转录为模板，用高保真的FastPfu酶，进行PCR扩增，PCR条件为95℃ 1min，随后95℃20s，53℃20s和72℃ 1min，进行40个循环，最后72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得1605bp长度的扩增片段。
综合上述步骤的结果，获得了目的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列SEQID NO 1所示。序列表中序列SEQ ID NO 1由1605个碱基组成，自5’端第1位-第1605位碱基为其开放阅读框，编码具有序列表中序列SEQ ID NO 2所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列SEQ ID NO 2由534个氨基酸残基组成。将该基因命名为AeLCYE，将其编码的蛋白命名为AeLCYE。
实施例2 AeLCYE基因过表达载体的构建
将实施例1中测序鉴定正确的含有序列表SEQ ID NO 1所示核苷酸的DNA片段用BamH I和Sac I进行双酶切，用1％琼脂糖凝胶回收DNA片段，通过T4 DNA连接酶将回收的AeLCYE基因片段与含有双35S启动子pYPx245质粒连接，酶切鉴定和序列分析测定获得了含有葡萄AeLCYE基因的重组质粒AH128。该表达载体还包含gusA报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因，载体如图1所示。
实施例3 AeLCYE基因转化拟南芥
将实施例2构建的秋葵AeLCYE基因的植物表达载体pCAMBIA1301-AeLCYE用蘸花法转化拟南芥，具体方法如下：
1.农杆菌的准备
(1)将pCAMBIA1301-AeLCYE用电击法转化根癌农杆菌EHA105菌株(BiovectorCo.，LTD)菌株，得到含有pCAMBIA1301-AeLCYE的重组农杆菌，并涂布于含有卡那霉素抗性的平板筛选转化子。
(2)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培养20h。
(3)取1mL菌液转接入20-30mLLB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培养约12h，测OD 600≈1.5。
(4)8000rpm，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)并稀释至OD 600≈0.8。
2.拟南芥蘸花法转化
(1)将拟南芥的花薹浸入上述侵染液中，轻轻搅动约10s后取出，全部转化完毕后，用保鲜袋罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置，22℃避光培养，24h后去掉保鲜袋直立培养。
(2)初次转化4d后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以对花序上发育的不同时期的花蕾进行转化，提高转化效率。
(3)生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱储存待用。
经过蘸花法转化的拟南芥生长约两个月后，正常开花结子。
实施例4 AeLCYE基因转基因拟南芥植株分子检测
1.转基因拟南芥种子的筛选
(1)称25-30mg种子放入1.5mL离心管。
(2)1mL75％乙醇消毒1min(不停摇晃振荡)，8000rpm离心5s，去上清。
(3)加入1mL过滤后的漂白粉(2.5％)消毒15min(不停摇晃振荡，充分消毒)，8000rpm离心5s，去上清。
(4)无菌水洗涤3-4次。
(5)将种子均匀的播撒到1/2MS平板(潮霉素50μg/mL)上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置两天，22℃，16h光照培养10天。
(6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株(T1)培养至开花结实，收集T1植株上所结T2种子，进一步筛选得到T3种子。
2.转基因拟南芥植株PCR检测
(1)试验方法
用CTAB法提取T3拟南芥转基因植株和野生型植株的基因组DNA。用常规方法进行PCR检测，所使用的AeLCYE基因引物为：Primer 1：5’-ACAGCGTCTCCGACCTGATGCA-3’和Primer 2：5’-AGTCAATGACCGCTGTTATGCG-3’。
(2)试验结果
电泳检测扩增结果见图2(图2中，泳道M为Maker；泳道w：水；泳道P：阳性对照(重组质粒pCAMBIA1301-AeLCYE)；泳道WT：野生型拟南芥植株；泳道L1-L10：为转化pCAMBIA1301-AeLCYE的拟南芥转基因植株)。从图中可见，转化pCAMBIA1301-AeLCYE的拟南芥拟转基因植株和阳性对照扩增出591bp的目标条带，表明AeLCYE基因已经整合到拟南芥的基因组中，并证明这些再生植株为转基因植株；野生型拟南芥植株没有扩增出591bp的目标条带。转基因植株为后续功能分析。
3.转基因拟南芥植株qRT-PCR检测
(1)试验方法
将阳性T3代转AeLCYE拟南芥株系提取RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR，以未转化的野生型为对照。AtActin基因为内参：AtActin-F：5’-GCACCCTGTTCTTCTTACCGA-3’和AtActin-R：5’-AGTAAGGTCACGTCCAGCAAGG-3’；AeLCYE引物序列为：AeLCYE-F：5’-TGGTTCATCCTGCTACTGG-3’和AeLCYE-R：5’-CACATCCAACTCGGCAAA-3’。
(2)试验结果
结果如图3所示，WT为野生型拟南芥植株，L1-L7均为阳性T3代转AeLCYE拟南芥，表明AeLCYE在转基因拟南芥植株中有不同程度的表达。
实施例5 高效液相色谱法测定AeLCYE基因转基因拟南芥植株叶片类胡萝卜素含量
1.标样的准备
(a)β-胡萝卜素(β-carotene)、玉米黄素(zeaxanthin)和叶黄素(1utein)标样购自sigma公司，商品号分别为C4582-10MG、14681-1、95507；β-隐黄质(β-cryptoxanthin)标样购自北京华美互利生化公司，商品号为0317S。
(b)α-胡萝卜素(a-carotene)标样：由于a-carotene标样极易降解，没有进行商业化标样，必须自行提取。具体方法如下：
(1)将胡萝卜丁放入食物料理机中打碎。
(2)将打碎的胡萝卜浆状物导入盛有5g硅藻土的大研钵中，混匀。
(3)加入适量的预冷丙酮用力研磨，将胡萝卜中的胡萝卜素萃取到丙酮中。
(4)将研磨液倒入磨砂漏斗中进行抽真空，黄色液体会被抽到三角瓶中，磨砂漏斗中的干燥物质用勺取出，再放入到大研钵中，加适量预冷丙酮再次用力研磨。重复5-6次，直到研磨液的颜色变为无色。
(5)将三角瓶中的金黄色液体(胡萝卜素萃取液)分若干次倒入分液漏斗中，每倒入一次胡萝卜素萃取液后，均倒入300mL的ddH2O，静置稍许，将下层透明液层排出到废液瓶中。
(6)胡萝卜素萃取液经过若干次ddH2O洗涤后，最后一次用饱和食盐水洗涤，以彻底除去所形成的乳状物层，同样排出下层的透明废液。
(7)用吸水纸擦干分液漏斗的出水孔。将金黄色的石油醚层(高纯度胡萝卜素萃取液)排出倒入一个干燥的锥形瓶中；加入适量无水硫酸钠(Na2SO4)干燥(至无水Na2SO4结晶呈分散状态)，摇晃，吸取萃取液中的残留水分。
(8)将处理后的金黄色液体倒入一干燥的球形瓶中，再加入100mL 10％KOH的甲醇溶液皂化和0.1％二丁基羟基甲苯。
(9)将球形瓶接入旋转蒸发仪，旋转蒸发仪的另一接口接真空泵，真空蒸干液相石油醚，将有机相浓缩至大约5mL，之后用胶头滴管吸取石油醚(＜5mL)以洗净球形瓶壁上的橙色固态物质，胶头滴管反复吹打橙色液相，使固态物质充分溶解，以获得更高纯度的胡萝卜素萃取液，工作时间约50min。
(10)柱填料硅藻土和氧化镁(1：1)于110℃活化4h，在干燥器里冷却、干燥。准备一个铁架台，将玻璃层析柱放置在铁架台上并固定。在玻璃层析柱下方接好一个带口三角瓶，三角瓶通过皮管连接真空泵。
(11)填柱：将高温激活的硅藻土氧化镁混合物小心倒入玻璃层析柱内，不时用柱塞棒小心压实，填柱约20cm左右，确保柱面水平；再在柱面上方加入细化无水硫酸钠层1cm，之后塞入一层1.5cm左右的脱脂棉层，保证硫酸钠层和脱脂棉层的相平。再次压实后，打开真空泵，抽真空1h。
(12)石油醚过柱：抽真空1小时后，不要关闭真空泵，沿柱壁加入石油醚润柱，调整真空泵，使流速为每秒2-3滴，并用柱塞棒保持固态面的水平，最终使石油醚润洗整个层析柱。
(13)用滴管将浓缩后的提取物小心转入层析柱中，至样品层进入到接近无水Na2SO4层时，再把冲洗圆底烧瓶的石油醚相转入层析柱中，过柱过程中要保证石油醚相始终高于无水Na2SO4层。
(14)层析工作过程中，一定要保证固相上方的石油醚液相的存在，石油醚一旦不足必须立即补充(层析柱需要避光，可以使用锡箔纸包裹)。
(15)α-胡萝卜素是第一个流出层析柱的物质，所以当分层的α-胡萝卜素层即将流出层析柱时，暂时关闭真空泵，更换新的带口三角瓶，以盛接α-胡萝卜素，连接好后，打开真空泵，金黄色的α-胡萝卜素会流出进入到三角瓶内(三角瓶同样需要避光)。
(16)将获得的金黄色液体倒入玻璃螺口离心管中保存，详细注明标样提取时间，parafilm严格密封，锡箔纸避光，-80℃冰箱直立保存。
(17)取出少量用N2气吹干(剩余的大量提取物密封、避光保存于-70℃，备用)，用1mLV乙腈：V甲醇：V二氯甲烷＝45：20：35的溶剂溶解。
(18)用1mL一次性注射器使溶质完全溶解后，通过0.22μL的过滤器转移至2mL棕色进样小瓶中，50μL进样检测提取样品的纯度。
2.标准品的配置以及标准曲线的绘制
将提取并检测的α-胡萝卜素(a-carotene)直接用于混合标样的制备；叶黄素(Lutein)标样用无水乙醇和乙醚溶解；玉米黄素(Zeaxanthin)用丙酮溶解；β-隐黄质(β-cryptoxanthin)标样用乙醚和石油醚溶解；β-胡萝卜素(β-catotene)标样则用石油醚进行溶解。将标准样品溶解后各取100μl至小容量瓶(5mL)定容，用紫外-可见光分光光度计在各成分特定波长下测定其吸光值。根据公式(1)计算浓度，公式(2)校对公式(1)计算所得浓度，用公式(3)配置成50mL混合标样。混合标样需经氮气浓缩后，用石油醚定容。分别取1mL、2mL、3mL和5mL混合标样并分别重复3次共45mL建立标准曲线，标样测定值满足表1所列各成分所在的浓度范围内即可进行标准曲线的绘制。混合标样中叶黄素(1utein)、玉米黄素(zeaxanthin)、β-隐黄质(β-cryptoxanthin)、α-胡萝卜素(α-carotene)和β-胡萝卜素(β-carotene)的标准曲线如图4所示。
式中OD为吸光值；为吸光系数；
校对浓度(μg/mL)＝浓度c×纯度(％)(2)
纯度(％)＝标样HPLC峰面积/HPLC峰总面积×100
a＝(50×b)/c (3)
式中50为混合标样总体积50mL；a为加入标样量(μg/mL)
b为浓度范围中值(μg/mL)；c为校对浓度(μg/mL)
表1 标准溶液吸光系数和浓度范围
3.转基因拟南芥植株类胡萝卜素提取
拟南芥叶片：取移栽至营养土中2w的阳性T3代转AeLCYE拟南芥植株和野生型拟南芥植株的叶片，液氮速冻，然后磨成粉末状，各称取0.6g左右磨好的样品进行β-胡萝卜素的提取。方法如下：
(1)对阳性T3代转AeLCYE拟南芥和野生型拟南芥植株样品进行磨样；
(2)称取0.6g磨好样品于25mL螺口玻璃离心管中，加入6mL 0.1％BHT无水乙醇，涡旋20s；
(3)取出加120μL 80％氢氧化钾溶液；
(4)涡旋20s，再放入85℃水浴5min；
(5)取出，再涡旋20s，再放入85℃水浴5min；
(6)取出后立即置于冰上，立即加3mL预冷ddH2O；
(7)加3mL正己烷，涡旋20s；
(8)2700rpm离心5min，用移液枪吸取上清至另一新的螺口玻璃离心管中；
(9)重复7,8步3次，将上清至另一新的螺口玻璃离心管中，终体积达到约12mE；
(10)在有上清液的新的螺口玻璃离心管中加3mL预冷ddH20，涡旋，2700rpm离心5min；
(11)用移液枪吸取上层溶液(正己烷层)至新的尖底玻璃离心管中；
(12)再在水相的螺口管中加入3mL正己烷，涡旋，离心5min，再吸取上层正己烷层至新的尖底玻璃管中，重复2次；
(13)真空离心干燥总的正己烷；
(14)在干燥后的尖底玻璃离心管中加入1mL流动相，吸打混匀后通过0.22μm过滤器小心将液体加入棕色样品瓶中，用高效液相色谱法(HPLC)进行测定。
4.转基因拟南芥植株类胡萝卜素测定
(1)试验方法
利用高效液相色谱法测定(高效液相色谱仪为美国Agilent公司1200型)，方法如下：
(1)将上述得到的待测类胡萝卜素溶液在旋转蒸发器中集中收集，并用N2干燥。
(2)立即使类胡萝卜素溶解于1mL乙腈：甲醇：二氯甲烷(V：V：V)＝45：20：35的的溶剂中。
(3)将待测样品通过0.22μL注射器过虑后，直接将10μL样品到加入到色谱柱中。
(4)采用YMC C30色谱柱(250mm×4.6mm，5nm)，以乙腈：甲醇：二氯甲烷(V：V：V)＝75：20：5为流动相，流速1.8mL/min检测波长450nm处的吸收峰的变化。
(5)每个待测样品，重复测定3次。
(2)试验结果
根据上述建立的叶黄素(1utein)、玉米黄素(zeaxanthin)、β-隐黄质(β-cryptoxanthin)、α-胡萝卜素(α-carotene)和β-胡萝卜素(β-carotene)的标准曲线(图4)，分别测定转基因拟南芥叶片、转空载体对照拟南芥叶片和野生型对照拟南芥叶片的类胡萝卜素含量。其中总β-胡萝卜素含量是五种类胡萝卜素含量之和。结果如表2所示，表2中L3和L4分别表示2个转基因拟南芥植株叶片的待测样品；CK代表转空载体对照拟南芥植株叶片；WT代表野生型拟南芥植株叶片。转空载体对照拟南芥植株叶片(CK)和野生型对照拟南芥植株叶片(WT)中的β-胡萝卜素含量无显著差异；转基因拟南芥植株的叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、总类胡萝卜素含量与野生型拟南芥植株相比显著提高；叶黄素含量分别是野生型植株的1.08～1.28倍；玉米黄素含量分别是野生型植株的1.03～1.11倍；β-隐黄质含量分别是野生型植株的1.15～1.29倍；α-胡萝卜素含量分别是野生型植株的1.54～1.84倍；β-胡萝卜素含量分别是野生型植株的1.23～1.39倍；总类胡萝卜素含量分别是野生型植株1.13～1.32倍。
类胡萝卜素含量结果表明，过表达AeLCYE基因显著提高植物类胡萝卜素积累，AeLCYE基因在改良植物品质中具有重要作用。
表2AeLCYE转基因拟南芥植株叶片中类胡萝卜素含量
实施例6AeLCYE基因转基因拟南芥植株耐盐性鉴定
1.转基因植株耐盐性离体鉴定
(1)试验方法
将转基因拟南芥和野生型种子，消毒灭菌后播种继代培养于200mM NaCl 1/2MS培养基上，胁迫培养2周后，观察拟南芥植株的生长状态和生根情况。
(2)试验结果
结果显示，在盐胁迫处理条件下，结果见图5A，过表达拟南芥材料和野生型材料均因为盐胁迫条件的存在，植株变小；但是过表达拟南芥材料和野生型WT相比，生长状态相对较好，生长势数据统计显示，在盐胁迫下，过表达拟南芥材料的根长和鲜重分别比野生型WT材料提高了78～172％和19～38％；表明过表达AeLCYE基因显著提高转基因拟南芥植株的耐盐性。
2.转基因植株耐盐性盆栽鉴定
(1)试验方法
将转基因拟南芥和野生型种子在1/2MS培养基上培养2周后，将植株移栽到盆中培养2周后，进行盐胁迫处理。用含有300mM NaC1的1/2霍格兰营养液每个2天灌溉1次，每次200mL，处理4周，观察植株生长情况并统计存活率。以下涉及存活率提高的计算方式是：(过表达植株存活率-野生型植株存活率)*100％/野生型植株存活率。
(2)试验结果
结果显示，通过耐盐性盆栽鉴定，结果见图5B，盐处理4周后，转基因植株的生长状态显著优于野生型植株，转基因植株的存活率显著高于野生型植株，较野生型植株相比提高了14731～17008％；转基因植株的鲜重显著高于野生型植株，较野生型植株相比提高了153～188％；表明过表达AeLCYE基因显著提高转基因拟南芥植株的耐盐性。
实施例7 AeLCYE基因转基因拟南芥植株抗性生理生化指标的测定
1.可溶性糖含量测定
(1)试验方法
可溶性糖是植物响应盐碱胁迫的一种有机渗透调节剂，如葡萄糖和蔗糖等，在细胞内起类似于保护酶的作用，同时其作为碳水化合物为有机物的合成提供充足的物质和能量供应。在逆境胁迫下，植物体内可溶性糖含量越高，植物在逆境下植物细胞失水的可能性越小，成活的可能性越大，植物抗性提高。
测定方法参考文献【Hong Zhai，Feibing Wang，Zengzhi Si，Jinxi Huo，LeiXing，Yanyan An，Shaozhen He，Qingchang Liu.A myo-inositol-1-phosphate synthasegene，IbMIPS1，enhances salt and drought tolerance and stem nematode resistancein transgenic sweetpotato.Plant Biotechnology Journal，2016，14：592-602】，检测拟南芥植株的可溶性糖含量。拟南芥植株为上述盆栽鉴定中无胁迫处理2周的拟南芥植株和上述盆栽鉴定中盐处理1周的拟南芥植株。实验需重复三次，结果取平均值。
(2)试验结果
实验结果见图6中A(Norma1为空白对照，Salt stress为盐胁迫)。结果表明，转基因拟南芥L1植株、L2植株、L3植株和L4植株的可溶性糖含量显著高于野生型拟南芥植株。
2.相对含水量测定
(1)试验方法
相对含水量是反映植物水分状况的重要指标，植物组织的相对含水量与植物抗逆性呈正相关，细胞的相对含水量反映了细胞受逆境胁迫的程度。
测定方法参考文献【Yufeng Yang，Shikai Guan，Hong Zhai，Shaozhen He，Qingchang Liu.Development and evaluation of a storage root-bearingsweetpotato somatic hybrid betweenIpomoea batatas(L.)Lam.and I.triloba L.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2009，99：83-89】，检测拟南芥植株的相对含水量。拟南芥植株为上述盆栽鉴定中无胁迫处理2周的拟南芥植株和上述盆栽鉴定中盐处理1周的拟南芥植株。实验需重复三次，结果取平均值。
(2)试验结果
实验结果见图6中B(Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫)。结果表明，转基因拟南芥L1植株、L2植株、L3植株和L4植株的相对含水量显著高于野生型拟南芥植株。
3.H2O2含量测定
(1)试验方法
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H202发生累积。H202可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。因此，H2O2的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang，Weili Kong，Gary Wong，Lifeng Fu，RihePeng，Zhe njun Li，Quanhong Yao.AtMYB12 regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.MolecularGenetics and Genomics，2016，291：1545-1559】，检测拟南芥植株的MDA含量。拟南芥植株为上述盆栽鉴定中无胁迫处理2周的拟南芥植株和上述盆栽鉴定中盐处理1周的拟南芥植株。实验需重复三次，结果取平均值。
(2)试验结果
实验结果见图6中C(Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫)。结果表明，转基因拟南芥L1植株、L2植株、L3植株和L4植株的H2O2含量显著低于野生型拟南芥植株。
4.MDA含量测定
(1)试验方法
植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度，即MDA的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang，Weili Kong，Gary Wong，Lifeng Fu，RihePeng，Zhe njun Li，Quanhong Yao.AtMYB12 regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.MolecularGenetics and Genomics，2016，291：1545-1559】，检测拟南芥植株的MDA含量。拟南芥植株为上述盆栽鉴定中无胁迫处理2周的拟南芥植株和上述盆栽鉴定中盐处理1周的拟南芥植株。实验需重复三次，结果取平均值。
(2)试验结果
实验结果见图6中D(Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫)。结果表明，转基因拟南芥L1植株、L2植株、L3植株和L4植株的MDA含量显著低于野生型拟南芥植株
5.SOD活性测定
(1)试验方法
超氧化物歧化酶(SOD)活性可以作为植物抗逆性的一项生理生化指标。SOD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang，Weili Kong，Gary Wong，Lifeng Fu，RihePeng，Zhenjun Li，Quanhong Yao.AtMYB12 regulates fiavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.MolecularGenetics and Genomics，2016，291：1545-1559】，检测拟南芥植株的SOD活性。拟南芥植株为上述盆栽鉴定中无胁迫处理2周的拟南芥植株和上述盆栽鉴定中盐处理1周的拟南芥植株。实验需重复三次，结果取平均值。
(2)试验结果
实验结果见图6中E(Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫)。结果表明，转基因拟南芥L1植株、L2植株、L3植株和L4植株的SOD活性显著高于野生型拟南芥植株。
6.CAT活性测定
(1)试验方法
过氧化氢酶(CAT)普遍存在于植物组织中，是重要的保护酶之一，其作用是清除代谢中产生的H2O2，以避免H2O2积累对细胞的氧化破坏作用，因而其活性的高低与植物的抗逆性有关。
测定方法参考文献【Yufeng Yang，Shikai Guan，Hong Zhai，Shaozhen He，Qingchang Liu.Development and evaluation of a storage root-bearingsweetpotato somatic hybrid between Ipomoea batatas(L.)Lam.and I.triloba L.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2009，99：83-89】，检测拟南芥植株的CAT活性。拟南芥植株为上述盆栽鉴定中无胁迫处理2周的拟南芥植株和上述盆栽鉴定中盐处理1周的拟南芥植株。实验需重复三次，结果取平均值。
(2)试验结果
实验结果见图6中F(Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫)。结果表明，转基因拟南芥L1植株、L2植株、L3植株和L4植株的CAT活性显著高于野生型拟南芥植株。
7.APX活性测定
(1)试验方法
抗坏血酸过氧化物酶(APX)是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶之一，尤其是叶绿体中清除H2O2的关键酶，又是维生素C代谢的主要酶类。APX活性可以作为植物抗逆性的一项生理生化指标，其活性的高低与植物的抗逆性有关。
测定方法参考文献【Hong Zhai，Feibing Wang，Zengzhi Si，Jinxi Huo，LeiXing，Yanyan An，Shaozhen He，Qingchang Liu.A myo-inositol-1-phosphate synthasegene，IbMIPS1，enhances salt anddrought tolerance and stem nematode resistancein transgenic sweetpotato.Plant Biotechnology Journal，2016，14：592-602】，检测拟南芥植株的APX活性。拟南芥植株为上述盆栽鉴定中无胁迫处理2周的拟南芥植株和上述盆栽鉴定中盐处理1周的拟南芥植株。实验需重复三次，结果取平均值。
(2)试验结果
实验结果见图6中G(Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫)。结果表明，转基因拟南芥L1植株、L2植株、L3植株和L4植株的APX活性显著高于野生型拟南芥植株。
8.POD活性测定
(1)试验方法
过氧化物酶(POD)活性可以作为植物抗逆性的一项生理生化指标。POD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang，Weili Kong，Gary Wong，Lifeng Fu，RihePeng，Zhe njun Li，Quanhong Yao.AtMYB12 regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.MolecularGenetics and Genomics，2016，291：1545-1559】，检测拟南芥植株的POD活性。拟南芥植株为上述盆栽鉴定中无胁迫处理2周的拟南芥植株和上述盆栽鉴定中盐处理1周的拟南芥植株。实验需重复三次，结果取平均值。
(2)试验结果
实验结果见图6中H(Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫)。结果表明，转基因拟南芥L1植株、L2植株、L3植株和L4植株的POD活性显著高于野生型拟南芥植株。
生理生化指标的测定结果表明，过表达AeLCYE基因显著提高转基因拟南芥植株的耐盐性。附：本发明所涉及到的核苷酸序列表：
＜110＞淮阴工学院
＜120＞植物类胡萝卜素生物强化和抗逆性相关蛋白AeLCYE及其编码基因与应用
＜160＞2
＜210＞SEQ IDNO 1
＜211＞1605
＜212＞DNA
＜21 3＞秋葵(Abelmoschus esculentusL.)
＜400＞1
/>
＜210＞SEQ ID NO 2
＜211＞534
＜212＞PRT
＜213＞秋葵(Abelmoschus esculentus L.)
＜400＞2
/>

Claims (10)

1.一种提高植物类胡萝卜素积累和耐盐性相关蛋白AeLCYE，如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列SEQ ID NO 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物类胡萝卜素积累和抗逆性相关的由SEQ ID NO 2衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白AeLCYE的基因，序列SEQ ID NO 1所示。
3.编码利要求1所述SEQ ID NO 2氨基酸序列的基因，其特征在于：所述基因是如下(a1)-(a3)中任何一种的DNA分子；
(a1)编码序列为序列表中序列SEQ ID NO 1所示的DNA分子；
(a2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码植物类胡萝卜素积累和抗逆性相关蛋白的DNA分子；
(a3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或者至少具有99％同源性且编码植物类胡萝卜素积累和抗逆性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
5.权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述基因或含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系的应用：
在调控植物中类胡萝卜素含量中的应用；
在培育类胡萝卜素含量改变的转基因植物中的应用；
在调控植物抗逆性中的应用；
在培育抗逆性改变的转基因植物中的应用。
6.一种提高类胡萝卜素含量和/或抗逆性高转基因植物的方法，其特征在于：通过提高目的植物中权利要求1所述蛋白AeLCYE的含量或活性，得到转基因植物。
7.一种权利要求6所述方法得到的转基因植物。
8.如权利要求1所述蛋白AeLCYE或权利要求5所述的应用或权利要求6所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为耐盐性。
9.如权利要求1所述的蛋白AeLCYE，其特征在于：所述类胡萝卜素含量为叶黄素(1utein)、玉米黄质(zeaxanthin)、β-隐黄质(β-cryptoxanthin)、α-胡萝卜素(α-carotene)、β-胡萝卜素(β-carotene)和/或总类胡萝卜素(total carotenoids)含量。
10.如权利要求1所述蛋白AeLCYE，其特征在于：所述植物是如下(c1)至(c4)中的任一种：(c1)双子叶植物；(c2)单子叶植物；(c3)十字花科植物；(c4)拟南芥。
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