CN1900112A

CN1900112A - 一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN1900112A
Application number: CN 200610088889
Authority: CN
Inventors: 李银心; 韩和平
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2006-07-24
Filing date: 2006-07-24
Publication date: 2007-01-24
Anticipated expiration: 2026-07-24
Also published as: CN100562524C

Abstract

本发明公开了一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用。该植物抗逆性相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。将本发明的植物抗逆性相关蛋白的编码基因转入植物中，可增强植物的抗逆性，特别是增强对盐、氧化的抗性。

Description

一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

植物对盐分的抗性是一个多基因控制的复杂性状。盐分对植物的影响涉及到植物体内的各个方面和代谢过程，包括离子毒害，渗透胁迫和氧化胁迫以及光合作用。

在胡萝卜素的合成途径中，除了八氢番茄红素合成酶(PSY)以外，还有一个重要的酶即：番茄红素环化酶。植物光合系统中的类胡萝卜素是一个双环复合物。在类胡萝卜素的合成过程中有一个分支点，分别由(番茄红素ε-环化酶)LCYE和(番茄红素β-环化酶)LCYB催化形成含有ε-环和β-环的6-胡萝卜素和γ-胡萝卜素。然后再经过一次β-环化反应分别形成α-胡萝卜素和β-胡萝卜素。β-胡萝卜素是植物体内最重要的单线氧淬灭剂，同时它是叶黄素循环色素和ABA的前体物质。Rosati等将番茄β-番茄红素环化酶基因转入番茄，结果果实中β-胡萝卜素的含量增加了3.8倍。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的植物抗逆相关蛋白，名称为SeLCY，来源于盐角草(Salicornia europaea L.)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。

其中，序列表中的序列1由498个氨基酸残基组成。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述植物抗逆性相关蛋白编码基因(SeLCY)也属于本发明的保护范围。

上述植物抗逆性相关蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的DNA；

3)与序列表中SEQ ID №：1的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中的SEQ ID №：1由1937个脱氧核苷酸组成，自5′端第295-1788位脱氧核苷酸为编码序列。

含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及工程菌均属于本发明的保护范围。

本发明的SeLCY基因可用现有的方法构建到现有的植物表达载体中，可在其转录超始核苷酸前加上包括组成型启动子、增强启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、发育阶段特异性启动子在内的任何一种启动子。为了便于对转SeLCY基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(Bar基因、GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。携带有本发明的SeLCY基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株，获得抗逆性提高的植株。

实验证明，在逆境条件下，转SeLCY拟南芥比野生型拟南芥具有较强的抗逆性，特别是具有较强的抗盐性和抗氧化性。转基因拟南芥的光合效率和气孔导度得到了提高，促进了转基因株系的生长。

将本发明的植物抗逆性相关蛋白的编码基因按常规方法转入其他植物中，可增强植物的抗逆性，特别是增强对盐、氧化的抗性。

附图说明

图1为SeLCY中间片段的获得

图2为SeLCY基因全长PCR扩增产物

图3为SeLCY与其他生物八氢番茄红素合成酶氨基酸序列比较图

图4为SeLCY蛋白的二级结构分析

图5为SeLCY跨膜预测

图6为不同生物LCY蛋白的二级结构比较

图7为SeLCY全长的PCR扩增

图8为植物表达载体p35S-1301-SeLCY构建过程

图9为转基因拟南芥的GUS染色

图10为转基因拟南芥的PCR鉴定

图11为转基因拟南芥的Southern和Northern分析

图12为100mM NaCl对SeLCY转基因拟南芥幼苗生长的影响

图13为百草枯和NaCl处理野生和SeLCY转基因拟南芥离体叶片产生的斑点

图14为NaCl胁迫下SeLCY转基因拟南芥和野生植株中的丙二醛含量

图15为NaCl胁迫下SeLCY转基因拟南芥和野生植株中的H₂O₂含量

图16为NaCl处理下野生和转基因拟南芥叶片的POD，SOD，CAT活性

图17为SeLCY超表达拟南芥植株在100mM NaCl胁迫下光合速率的变化

图18为SeLCY超表达拟南芥植株在100mM NaCl胁迫下气孔导度的变化

图19为SeLCY超表达拟南芥植株在100mM NaCl胁迫下Fv/Fm的变化

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、SeLCY蛋白及其编码基因的获得

拟南芥(Arabidopsis thaliana)，生态型为Columbia，22℃，16hr光照培养。

菌株：大肠杆菌：TOP10，购自北京天根公司。

质粒：pUCm-T载体购自上海生物工程公司，氨卞青霉素(Amp)抗性，用于T/A克隆。

一、SeLCY基因中间片段的获得

盐角草RNA的提取(Trizol法)：

将盐角草幼苗在液氮冷冻条件下充分研磨，保证材料没有融化，将样品转入预冷的离心管，并称重，保证样品在150-200mg之间，迅速加入1ml Trizol，在涡旋器上迅速混匀(小心防止离心管盖胀开)，在15-30℃放置5min，裂解蛋白复合体。然后加入0.2ml氯仿，上下摇动15sec，在15-30℃放置2-3min，再在4℃，12000rpm离心15min，将水相转入新管后，加入0.5ml异丙醇，充分混匀，在15-30℃放置10min。弃去上清，加入75％乙醇1ml，清洗沉淀。在4℃，7500rpm离心5min。室温干燥5-10min。加入20μl Rnase-free的无菌水溶解沉淀，在55-60℃溶解10min。电泳检测结果表明盐角草幼苗的总RNA没有降解。

通过对GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中拟南芥，水稻，番茄，烟草，万寿菊等11种植物的番茄红素β-环化酶基因核苷酸序列进行多重序列比较，在保守序列处设计简并引物。

根据NCBI上登录的不同植物LCY基因的序列，设计简并引物。

LCY-1：5’-TGTTTGGGT(G/T)GATGA(A/G)TT(T/C)G-3’

LCY-2：5’-AA(C/A)CCATGCCAATAA(T/C)G(T/A)GG-3’

将盐角草幼苗的总RNA进行反转录合成cDNA。以此cDNA为模板，以LCY-1和LCY-2为引物，退火温度为46℃进行PCR扩增，扩增反应体系为：cDNA 2.0μl(2.0ug)，H₂O 13.3μl，dNTP 0.5μl(10mM)，10×PCR buffer 2.0μl，ExTaq DNA polymerase 0.2μl(5U/μl)，引物(LCY-1)1.0μl(10μM)，引物(LCY-2)1.0μl(10μM)。

按以下程序进行扩增反应：先94℃5min；然后94℃ 30sec，46℃ 30sec，72℃ 1min，共40个循环；最后72℃ 10min。电泳检测PCR产物，结果如图1所示，得到一条978bp的SeLCY的cDNA中间片段，图1中泳道M为DL2000分子量标准，泳道7为PCR扩增获得的978bp的cDNA中间片段(箭头示)。将该cDNA中间片段连接到pUCm-T载体上，转化大肠杆菌Top10，经测序后在GenBank中进行Blastn比较，结果与多种植物LCY基因有较高的同源性。

二、SeLCY基因全序列的获得

1、3’-RACE扩增

根据步骤一得到的978bp的SeLCY的cDNA中间片段核苷酸序列，设计3’-RACE引物。

LCY-3：5’-GTATTTGGGTTCAGGAGGCAG-3’

以LCY-3和AUAP为引物，以步骤一获得的第一链cDNA为模板，设计退火温度为50℃进行PCR扩增，扩增体系：

第一链cDNA 2.0μl(2.0ug)，水13.3μl，dNTP 0.5μl(10mM)，10×PCR buffer 2.0μl，ExTaq DNA聚合酶0.2μl(5U/μl)，AUAP引物1.0μl(10μM)，引物(LCY-3)1.0μl(10μM)。

按以下程序进行扩增反应：先94℃ 5min；然后94℃ 30sec，50℃30sec，72℃ 1min，40个循环；最后72℃ 10min。

2、3’-RACE巢式扩增：

由于第一次扩增效果不好，故设计巢式引物LCY-4重新扩增。

LCY-4：5’-GAGGCAGGCAGGATGGAAGTG-3’

以LCY-4和AUAP为引物，以上述LCY-3和AUAP扩增得到的3’-RACE扩增产物为模板，退火温度为55℃进行PCR扩增。

扩增体系：PCR产物2.0μl(2.0ug)，H₂O 37.6μl，dNTP 1.0μl(10mM)，10×PCR buffer 5.0μl，ExTaq DNA聚合酶0.4μl(5U/μl)，AUAP 2.0μl(10μM)，Primer(PSY-4)2.0μl(10μM)。

按以下程序进行扩增反应：先94℃ 5min；再94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min，共40个循环；最后72℃ 10min。电泳检测结果表明经两次PCR扩增获得537bp的基因片段。

3、5’-RACE扩增

根据步骤1得到的978bp的SeLCY的cDNA中间片段的核苷酸序列，设计5’-RACE引物LCY-5进行反转录。

1)反转录

LCY-5：5’-CGAGGCAATCAAGCAAATCC-3’。

按照以下成分调和第一链反应液：LCY-5 1.0μl(10μM)，按照步骤1的方法提取的总RNA 6.0μl(5μg)，dNTP 1.0μl，DEPC-H₂O 5.0μl。

将该第一链反应液在65℃反应5min，然后冰上冷却，瞬时离心。然后加入5×buffer 4.0μl，0.1M DTT 1.0μl，Rnaseout 1.0μl，SuperscriptIII 1.0μl，混匀离心，50℃，50min，70℃，15min。迅速冰浴，瞬时离心，加入RnaseH1.0μl，轻轻混匀，37℃，20min。保存于-20℃。

2)5’-RACE第一链cDNA纯化(使用Gibco回收试剂盒)

向第一链反应物中加入120μl Binding solution。将该溶液转入Glassmaxspin carridge中，13000rpm离心20min。将离心柱从离心管中取出，将离心管中溶液转移到另一个新管中保存，直到确定cDNA已经成功回收。并将柱子放回到离心管中。在柱子中加入0.4ml 4℃预冷的1×washing buffer，13000rpm离心20min。倒掉离心管中溶液，并重复3次。用400μl 4℃预冷的70％乙醇洗涤2次。13000rpm离心1min。以去掉70％乙醇。将柱子转移到另外一个新管中，加入50μl 65℃预热的灭菌蒸馏水，13000g离心20sec，回收cDNA。

3)第一链cDNA的加尾反应

将纯化回收的第一链cDNA 9.5μl(9.5μg)，5×Tailing buffer

5.0μl，0.1％BSA 2.5μl和2mM dCTP 6.0μl混合均匀后在94℃变性2min，冰上冷却1min。加入TdT 2.0μl，在37℃反应30min，65℃失活10min。

4)5’-RACE第一轮PCR

Abridged anchor promer：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG-3’

第一轮PCR反应体系：第一链cDNA 2.0μl(2.0ug)，H₂O 37.6μl，dNTP 1.0μl(10mM)，10×PCR buffer 5.0μl，ExTaq DNA polymerase 0.4μl(5U/μl)，Abridged anchor promer 2.0μl(10μM)，引物(LCY-5)2.0μl(10μM)。

扩增程序：先94℃ 5min；然后94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min，共40个循环；最后72℃ 10min。

5)第二轮巢式PCR

根据引物LCY-5，设计巢式引物LCY-6：5’-TGGCTTCAAACTCATCAACCC-3’

以LCY-6和AUAP为引物，退火温度为55℃进行PCR扩增，扩增体系：5′RACE第一轮PCR产物2.0μl(2.0ug)，H₂O 37.6μl，dNTP 1.0μl(10mM)，10×PCR buffer 5.0μl，ExTaq DNA polymerase 0.4μl(5U/μl)，AUAP 2.0μl(10μM)，引物(LCY-6)2.0μl(10μM)。

按以下程序进行扩增反应：先94℃ 2min；然后94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min，共40个循环；最后72℃ 10min。4℃保存。电泳检测。结果表明最终得到697bp的SeLCY基因5’序列。

4、SeLCY全长cDNA片段的扩增

根据测定的SeLCY基因5’-RACE，3’-RACE以及中间片段的序列，采用DNAMAN软件进行序列拼接，获得全长为1937bp的核苷酸序列。然后设计引物扩增全长的cDNA片段。

LCY-7：5’-CACTCAGCCACAACAACCATT-3’

LCY-8：5’-ACGTATCAACAGAGTGTATTG-3’

以LCY-7和LCY-8为引物，以盐角草幼苗的总RNA反转录合成的第一链cDNA为模板进行PCR扩增，扩增体系为：

盐角草幼苗的总RNA反转录合成的第一链cDNA 2.0μl(2.0ug)，H₂O 37.6μl，dNTP 1.0μl(10mM)，10×PCR buffer 5.0μl，ExTaq DNA聚合酶0.4μl(5U/μl)，LCY-7 2.0μl(10μM)，LCY-8 2.0μl(10μM)。

按以下程序进行扩增反应：先94℃ 3min；然后94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1.5min，共40个循环；最后72℃ 10min。4℃保存。电泳检测结果表明获得1906bp的片段(图2)。图2中，泳道M为DL2000分子量标准，泳道2为PCR扩增获得的1906bp SeLCY基因片段(箭头示)。测序结果表明该1906bp的片段具有由自序列1的5′端的第1至1906位脱氧核苷酸组成的核苷酸序列。

SeLCY具有序列表中序列1的核苷酸序列。NCBI检索结果表明SeLCY和许多物种的LCY基因有很高的同源性。该序列包括1494bp的开放读码框(openreading frame，ORF)(自序列1的5′端第295-1788位核苷酸序列)，294个碱基的5′非翻译区(untranslated region，UTR)(自序列1的5′端第1-294位核苷酸序列)，120个碱基的3′非翻译区(自序列1的5′端第1789-1908位核苷酸序列)和29个碱基的多聚腺苷酸(自序列1的5′端第1909-1937位核苷酸序列)。此cDNA编码一个498个氨基酸的蛋白质SeLCY，SeLCY具有序列表中序列2的氨基酸残基序列，推测分子量为56.1kDa，等电点为8.41。

5、SeLCY蛋白的同源性分析

为了将盐角草的SeLCY的氨基酸序列和其它细菌、蓝藻和高等植物的LCY基因编码的蛋白进行同源性分析，从NCBI网站上检索到欧文氏菌(Pantoeaagglomerans)，蓝藻(Synechococcus sp.CC9605)，拟南芥(A.thaliana)，番茄(Lycopersicon esculentum)，烟草(Nicotiana tabacum)，甜椒(Capsicumannuum)，柑桔(Citrus sinensis)等生物的LCY同源基因的蛋白序列。通过DNAMAN软件分析结果表明：SeLCY蛋白编码的氨基酸序列与它们的同源性分别为15％，27％，75％，76％，76％，76％，79％。说明盐角草LCY蛋白与细菌的同源性最低，在高等植物中它们的同源性都比较高。相比之下，在N端的同源性要明显低于C端(图3)。

6、SeLCY基因二级结构分析

植物的LCY在细胞质中合成后，被运输到叶绿体，线粒体以及其它质体中发挥功能，参与类胡萝卜素的合成。Chlorop1.1分析软件网上预测(http：//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)结果表明自序列2的氨基端第1-37位氨基酸残基存在信号肽(图4)。

疏水性分析表明SeLCY在自序列2的氨基端79-96，367-385和454-474位氨基酸区域有3个跨膜区(图5)。

通过HNN软件包对盐角草，拟南芥，蓝藻和欧文氏菌的二级结构进行预测(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_nn.html)，结果如图6所示，结果表明盐角草(图6-A)SeLCY有498个氨基酸，其中有171个氨基酸形成了α-螺旋，形成多个连续的α-螺旋片段，占氨基酸数目的34.34％，拟南芥(图6-B)中形成α-螺旋的氨基酸占35.53％，而欧文氏菌(图6-D)和蓝藻(图6-C)中形成α-螺旋的氨基酸比例相对较高。盐角草和拟南芥的二级结构非常相似，但与细菌和蓝藻差异较大，不过它们在C端都有一段α-螺旋相对集中的结构域。

实施例2、SeLCY及其编码基因的功能验证

一、SeLCY基因表达载体的构建

为了鉴定SeLCY的功能，在SeLCY基因序列的3’和5’非编码区设计了一对引物：LCY-9：5’-TTGGATCCATGTCTACTTTGCTTAAAATT-3’；LCY-10：5’-TTG AGCTCTCAATCAGTATCTTTTACTAG-3’。以盐角草cDNA为模板，通过RT-PCR得到一条1513bp的DNA序列，并将它克隆到pUCm-T载体中，测序结果表明该片段序列含有SeLCY编码序列，该片段具有自序列1的5′端第295-1789位核苷酸序列。RT-PCR的产物的凝胶电泳图如图7所示，其中，泳道DL2000为DL2000分子量标准，泳道1为RT-PCR的产物。

将RT-PCR得到的片段连入pUCm-T载体构建成的重组载体与载体SN1301(SN1301由pCAMBIA1301载体的GUS基因上游插入单独的35S启动子序列构建而成，具有卡那霉素(Kanamycin)抗性和潮霉素(Hygromycin)抗性)分别用BamHI，SacI双酶切，并将SeLCY片段正向连接到植物表达载体SN1301的35S启动子下，将经过酶切，测序验证正确的重组载体命名为p35S-1301-SeLCY(重组载体p35S-1301-SeLCY的构建流程示意图如图8所示)。

二、转SeLCY基因拟南芥的鉴定及其功能分析

1、转SeLCY基因拟南芥的获得及筛选

1)潮霉素抗性筛选

将构建的质粒p35S-1301-SeLCY转入农杆菌LBA4404，用蘸花侵染法转化拟南芥。转化后得到的T1代种子用10％次氯酸钠消毒后平铺在含潮霉素25mg/L的MS₀培养基(未添加任何激素的MS基本培养基)上，4℃冰箱中春化3d，在培养箱中暗培养4d后检查种子的发芽和生长情况。生长良好且植株高者可初步确定为转基因植株，即T1代转基因植株。将其在光下培养3d后移入花盆中继续培养。T1代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T2代，依此类推。通过筛选得到8株T1代阳性苗。

2)GUS组织化学分析

将8株T1代转p35S-1301-SeLCY植株(L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8)的叶片经GUS组化反应液染色后出现不同程度的显色反应，其中有5株(L1、L2、L3、L4、L5)蓝色非常明显，而野生型(WT)叶片则无蓝色，暗示无GUS活性存在，部分T1代转p35S-1301-SeLCY植株(L1、L2、L3、L4)叶片的GUS染色结果如图9所示。

3)转基因拟南芥植株的PCR鉴定

以LCY-9，LCY-10为引物，对经GUS染色鉴定为阳性的转p35S-1301-SeLCY T1代拟南芥基因组DNA进行PCR检测，以野生型拟南芥(图10中WT)和p35S-1301-SeLCY(图10中质粒)的PCR检测为对照，结果表明除L2外，L1、L3、L4、L5中均可扩增到1513bp的条带，而野生型植株中没有扩增产物出现，部分转p35S-1301-SeLCY单株的PCR产物电泳图片如图10所示。图10中，质粒表示p35S-1301-SeLCY。

4)转p35S-1301-SeLCY拟南芥植株的Southern和Northern杂交验证

将GUS染色和PCR检测为阳性的转p35S-1301-SeLCY拟南芥单株提取DNA，以GUS基因的特异引物GUS-1和GUS-2，以转p35S-1301-SeLCY拟南芥基因组DNA为模板扩增得到720bp GUS基因片段为探针进行Southern杂交，具体方法如下所述：

A、杂交膜的制备

取20-30μg转p35S-1301-SeLCY拟南芥基因组DNA用EcoRI进行酶切，酶切反应体系如下：基因组DNA 20μl，10×buffer 20μl，EcoRI 10μl，灭菌水150μl。

杂交膜制备方法，按常规方法进行，具体如下所述：将酶切产物加入2倍预冷的无水乙醇，-20℃保存2hr。12000rpm离心10min。加入70％乙醇，12000rpm离心10min。弃上清，将DNA充分干燥，否则DNA会在点样时随乙醇顺着点样孔爬出。将酶切的总DNA在0.7％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml EB)上电泳，电压条件为1V/cm，当溴酚兰标准移到离凝胶末端2cm处时，停止电泳。在紫外灯下，将琼脂糖凝胶上没有DNA的、不平整的边缘和点样孔切除，并在凝胶左上角(加样孔一端为上)切去一角，作为记号。将切好的琼脂糖凝胶放在数倍体积的变性液中(1.5M NaCl+0.5M NaOH)浸泡45min，并不断温和摇动，使凝胶中的DNA变性。将凝胶块用无离子水漂洗，然后浸泡于数倍体积的中和液(1.0M Tris·Cl pH7.4+1.5M NaCl)中，温和摇动15min，更换中和液，将凝胶继续浸泡15min。用Whatman 3MM滤纸包裹一有机玻璃平台，放进一白瓷盘中，倒入转移缓冲液(10×SSC)，使液面略低于平台表面。当平台上面的滤纸渗透后，赶出滤纸下所有的气泡。裁取一张比凝胶长、宽各大1mm的Hybond-N⁺尼龙膜(Amersham Pharmacia Biotech)，并切除一角，使之与琼脂糖凝胶上的缺角一致。将尼龙膜浮在无离子水表面，直至滤膜从下向上湿透为止，随后用20×SSC浸泡尼龙膜5min。从中和液中取出凝胶，将其翻转以使其背面朝上。把凝胶放在平台上湿润的Whatman 3MM滤纸中央，放胶时要确保滤纸和凝胶之间不能有气泡。用保鲜膜铺在凝胶四周边上，形成隔液裙以阻止转移缓冲液不通过凝胶直接向凝胶上方的吸水纸上流。在凝胶上放好用20×SSC浸泡过的尼龙膜，并使二者的缺角重叠，用玻璃棒挤出滤膜与凝胶之间的气泡。用2×SSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的Whatman 3MM滤纸，铺在尼龙膜上，挤出气泡。切一叠(10cm厚)与凝胶大小相当的吸水纸，放在Whatman 3MM滤纸的上方，滤纸顶端压上重量为500g左右的重物，转移过夜。期间要不断更换吸水纸。移去重物，吸水纸、取出尼龙膜，在6×SSC溶液中浸泡5min。从6×SSC溶液中取出尼龙膜，等滤膜上的溶液滴尽后，放在吸水纸上晾干30min。80℃烘干2hr，将DNA交联在尼龙膜上。

B、α-³²P-dCTP标记探针的制备

设计GUS基因的特异引物为：

GUS-1：5’-GCATGTTACGTCCTGTAGAAACCC-3’

GUS-2：5’-CAAAGCCAGTAAAGTAGAACGGT-3’

以转基因拟南芥基因组DNA为模板，按照如下体系盒程序标记探针：10×buffer 5.0μl，dATP、dTTP、dGTP(2.5mmol/L each)3.0μl，30μCiα-³²P dCTP 3.0μl，Gus-1(10μmol/L)1.0μl，Gus-2(10μmol/L)1.0μl，模板DNA(0.1μg/μl)1.0μl，Taq polymerase(2.5U/μl)1.0μl，无菌水33μl。

使用PCR产物纯化试剂盒进行纯化(天为时代)

加5倍体积的结合液PB，混匀，转入吸附柱CB中，室温放1min，12000rpm离心1min，倒掉废液。加入700μl漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉废液。加入.500μl漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉废液。将CB放回收集管中，12000rpm离心2min。取出吸附柱，放入一干净的离心管中，加20～100ul洗脱缓冲液EB，室温放1min，12000rpm离心1min。

C、预杂交：

将含有目的DNA的尼龙膜漂浮于6×SSC液面上，待其由下至上完全浸透后，将尼龙膜在6×SSC中浸泡2min。将杂交的尼龙膜卷入杂交管中，倒入20ml预交液，杂交炉中65℃预杂交3hr以上。

D、杂交：

将制备好的探针于沸水浴加热5min，迅速置于冰中冷却。迅速倒干净预杂交液。将已预热到65℃杂交液(约10ml)迅速倒入杂交管，并迅速加入已变性探针。杂交炉中65℃杂交过夜(16hr以上)。

E、洗膜及显影：

含有探针的杂交液倒入回收废液桶中。用2×SSC+0.5％SDS在65℃洗膜两遍，每次15min。废液倒入废液桶中。用0.2×SSC+0.1％SDS在65℃洗膜两遍，每次15min。测定放射性强弱，一般非条带区应小于500，条带区应高于800。信号合适后，压片。-70℃曝光15d。显影、定影，并记录结果。

结果表明L1，L4单株表现为SeLCY单拷贝插入(图11中A)。

将GUS染色和PCR检测为阳性的转p35S-1301-SeLCY拟南芥植株(L1、L3、L4、L5提取RNA，以步骤1中LCY-9，LCY-10为引物，以p35S-1301-SeLCY质粒DNA为模板扩增得到1513bp GUS基因片段为探针进行Northern杂交，具体方法如下所述：

提取转SeLCY基因T1代株系的RNA，进行甲醛变性凝胶电泳。

探针标记体系为：10×buffer 5.0μl，dATP、dTTP、dGTP(均2.5mmol/L)3.0μl，30μCiα-³²P dCTP 3.0μl，Primer LCY-9(10μmol/L)1.0μl，Primer LCY-10(10μmol/L)1.0μl，模板DNA(0.1μg/μl)1.0μl，Taq polymerase(2.5U/μl)1.0μl，无菌水33μl。

结果表明L1，L3，L4出现杂交信号，表明SeLCY已经在转基因拟南芥中转录。而对照野生型(WT)拟南芥没有任何杂交信号，部分结果如图11中B所示。

2、功能鉴定

1)盐分对转p35S-1301-SeLCY拟南芥幼苗生长的影响

将野生型(WT)和转p35S-1301-SeLCY拟南芥植株L1，L4的T3代种子在不加潮霉素的1/2MS₀培养基(未添加任何激素的MS基本培养基)上发芽后，选长势一致的幼苗移栽到营养钵中，培养3周后分别用1/4Hoagland溶液和100mM NaCl(用1/4Hoagland配制)处理幼苗根系。结果如图12所示，在1/4Hoagland处理下，转基因株系L4的长势优于野生型。L1的T3代和野生型没有太大的区别。但在100mM NaCl下，转基因株系均表型出比野生型强的耐盐性。处理4天后，野生型则开始出现坏死的斑点，且叶片呈萎焉状，变白；转基因株系却没有出现任何胁迫症状。

2)对氧化胁迫的影响

A、不同浓度盐分和百草枯处理对拟南芥离体叶片的影响

将野生型拟南芥(WT)和转p35S-1301-SeLCY植株L1，L3，L4的T3代植株同一部位的叶片分别浸泡在蒸馏水，5μM，10μM百草枯和200mM，400mMNaCl溶液中，1-2d后拍照。每个试验设三个重复。

结果表明处理24hr后，转p35S-1301-SeLCY植株叶片在百草枯处理下叶片出现坏死的斑点比野生型要少。相比之下在NaCl处理下，转p35S-1301-SeLCY株系并没有表现出比野生型更强的抗性。(图13)。

B、盐分对转p35S-1301-SeLCY拟南芥幼苗丙二醛含量的影响

将野生型(WT)和转p35S-1301-SeLCY拟南芥植株L1，L4的T3代种子在不加潮霉素的1/2MS₀培养基上发芽后，选长势一致的幼苗移栽到营养钵中，培养3周后分别用1/4Hoagland和100mM NaCl(用1/4Hoagland配制)处理幼苗根系。5天后，称取0.7g植株叶片，加入7ml 5％三氯乙酸(TCA)溶液在研钵中研磨，匀浆在3000rpm离心10min，取上清2ml加入2ml 0.5％的硫代巴比妥酸溶液，摇匀，沸水浴30min。立即将试管放入冷水中。冷却后，3000rpm离心15min，取上清液并量其体积，以0.5％硫代巴比妥酸溶液为空白测吸光度A₄₅₀，A₅₃₂和A₆₀₀。提取液中MDA的含量(μM)＝6.45(A₅₃₂-A₆₀₀)-0.56A₄₅₀，并进一步算出其在植物组织中的含量。结果如图14所示，表明在不加盐的条件下，野生型和转基因植株的丙二醛含量没有显著的变化，经100mMNaCl处理后野生型丙二醛的含量是转p35S-1301-SeLCY拟南芥植株L1，L4的T3代植株的1.16，1.17倍。说明在盐胁迫下转p35S-1301-SeLCY植株的膜质过氧化程度明显小于野生型。

C、盐分对转p35S-1301-SeLCY拟南芥幼苗H₂O₂含量的影响

按照上述方法，用1/4Hoagland和100mM NaCl(用1/4Hoagland配制)处理野生型(WT)和转p35S-1301-SeLCY拟南芥植株L1，L4的T3代幼苗根系，然后，测定H₂O₂含量。拟南芥幼苗中H₂O₂含量测定是参照Patterson等(1984)(Anal Biochem，139(2)：487-492)的方法。称取3g新鲜的拟南芥叶片加入10ml冷丙酮，3000×g离心15min，取上清液3ml，加入0.2ml 0.2M TiSO₄，0.4ml浓氨水，3000×g离心10min，弃上清液，沉淀用冷丙酮悬浮洗涤3次。最后在沉淀中加入10.0ml 2.0M H₂SO₄溶解。于415nm处测定光吸收值。

结果如图15所示，表明转p35S-1301-SeLCY拟南芥在1/4Hoagland和100mM NaCl处理下的过氧化氢的含量都比野生型拟南芥降低。在1/4Hoagland下转基因植株的过氧化氢含量比野生型分别降低了33％和14％，而在100mM NaCl下转基因植株的过氧化氢含量比野生型分别降低了16％和9％。

D、盐分对转p35S-1301-SeLCY拟南芥幼苗POD，CAT，SOD酶活的影响

按照上述方法，将野生型(WT)和转p35S-1301-SeLCY拟南芥植株L1，L4的T3代用100mM的NaCl处理，然后，按照如下方法检测POD，CAT，SOD活性：

SOD活性的测定：将2.0g样品加提取介质10ml(50mM，pH＝7.8磷酸缓冲液，内含1％PVP)，在冰上研磨成匀浆，4℃，13000rpm离心30min，上清液为酶提取液。取20μM核黄素溶液(以含0.1mM EDTA的50mM pH＝7.8磷酸缓冲液配制)0.3ml、750μM的硝基四唑蓝0.3ml，130mM蛋氨酸0.3ml和酶提取液0.1ml于试管中，在3000Lux灯下放置15min，然后立即遮光停止反应，在560nm波长处测OD值，以0.01ml 50mM Ph＝7.8的磷酸缓冲液作空白。酶活力，即SOD活力(U/g FW)＝((D1-D2)×V)/(D1×Vt×W×50％)，式中D₁为空白对照吸光值，D2为测定样品的吸光值，ΔA：为A₀与加入酶反应液的吸光值差，W：为样品鲜重，V：为酶提取液的总体积，Vt：为加入酶液的体积。

POD活性的测定：准确称取2.0g样品，加入10ml 200mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝6.4)，将样品于冰上研磨成匀浆，13000rpm，4℃离心30min，上清液即为酶提取液，保存在冷处备用。取酶提取液0.1ml，0.1％愈创木酚2ml于比色杯中30℃5min，加0.08％过氧化氢1ml。在470nm波长下测OD值，每隔10sec读数1次，以反应混合液中加0.1ml 200mM的磷酸缓冲液(pH＝6.4)为空白对照。酶活性以每分钟吸光度变化值表示。

CAT活性的测定：准确称取2.0g样品，加入10ml 50mM磷酸缓冲液(pH＝7.0)，将样品于冰上研磨成匀浆，13000rpm，4℃离心30min，轻轻吸取上清即为酶提取液。取0.2ml酶提取液，加入2.8ml 40mmol/L H₂O₂，10sec后在240nm扫描1min内吸光值的变化，间隔10sec。计算CAT的活性。

结果如图16所示，结果表明，经1/4Hoagland处理后，POD在野生型和转基因株系中的活性没有变化，但是在盐胁迫下转p35S-1301-SeLCY拟南芥植株L1，L4的T3代比野生型分别升高了1.22和1.21倍。

转基因植株的CAT活性在1/4Hoagland和100mM NaCl下显著升高。在1/4Hoagland下转基因植株CAT活性比野生型植株分别增加了32.4％和21.3％。在100mM NaCl下转基因植株CAT活性比转p35S-1301-SeLCY拟南芥植株L1，L4的T3代分别升高了33.2％和21.4％。

在1/4Hoagland下转基因植株SOD活性比野生型植株显著升高，但是在100mM NaCl下野生型植株SOD活性和转p35S-1301-SeLCY拟南芥植株L1，L4的T3代之间差异并不显著。

3)盐分胁迫对转基因拟南芥光合作用的影响

A、盐分对转基因拟南芥幼苗光合速率和气孔导度的影响

将野生型(WT)和转p35S-1301-SeLCY拟南芥植株L1，L4的T3代种子在不加潮霉素的1/2MS₀培养基上发芽后，选长势一致的幼苗移栽到营养钵中，培养3周后分别用1/4Hoagland和100mM NaCl(用1/4Hoagland配制)处理幼苗根系。5天后，用Li-6400光合测定系统及其配备的拟南芥叶室(Li-COR公司，美国)测定不同处理的野生型(WT)和转p35S-1301-SeLCY拟南芥植株L1，L4的T3代幼苗叶片的光合速率和气孔导度。早上9:00-11:00进行，温室中幼苗的叶片在强光下照射30min后测定。每个样品设三个重复，每个重复测5个数据。

结果如图17、18所示，转p35S-1301-SeLCY拟南芥植株L1，L4的T3代拟南芥植株的光合速率得到显著的提高，在1/4Hoagland处理下转p35S-1301-SeLCY拟南芥植株L1，L4的T3代植株的光合速率比对照增分别增加了0.77，1.12倍。在100mM NaCl下转p35S-1301-SeLCY植株的光合速率也比对照分别增加了0.8，2.0倍(图17)。在1/4Hoagland处理下，转p35S-1301-SeLCY植株和野生型植株的气孔导度并没有显著的变化，但是在100mM NaCl下转基因植株的气孔导度显著增加(图18)。

B、盐分对转基因幼苗荧光特性的影响

用FMS₂型脉冲调制荧光仪(英国Hansatech公司)于晴天测定叶绿素荧光。

将不同浓度NaCl处理的拟南芥幼苗叶片暗适应20min后，分别测定叶片的Fo，Fm，Fv和Fv/Fm。Fo：初始荧光强度，它是已经暗适应的光合机构全部PSII中心都开放时的荧光强度。Fm：黑暗中最大荧光强度，它是已经暗适应的光合机构全部PSII中心都关闭时的荧光强度。Fv：黑暗中最大可变荧光强度，Fv＝Fm-Fo，表明潜在的PSII的光化学效率。Fv/Fm：没有遭受环境胁迫并经过充分暗适应的植物叶片PSII最大的量子效率指标。

结果如图19所示，在1/4Hoagland处理下，转p35S-1301-SeLCY拟南芥植株L1，L4的T3代植株和野生型Fv/Fm比值稍微没有显著变化。但在盐胁迫下，转p35S-1301-SeLCY拟南芥植株L1，L4的T3代株系比野生型植株Fv/Fm比值显著提高。说明转p35S-1301-SeLCY植株的光系统II的损伤程度明显低于野生型。

SeLCY对氧化胁迫的抗性的可能机理如下：

LCY是类胡萝卜素合成途径中的分支点上的关键酶。能够促进类胡萝卜素的合成向β-胡萝卜素合成。在植物中最重要的单线氧的淬灭剂就是类胡萝卜素，而在类胡萝卜素中，β-胡萝卜素淬灭单线氧的效果最好。同时在植物叶绿体中，叶黄素循环是保护植物光系统II的主要途径。SeLCY基因导入拟南芥在一定程度上可能提高了叶黄素循环中玉米黄素，环氧玉米黄素和堇菜黄素的含量。使得转基因拟南芥能够通过叶黄素循环消除植物光合作用中产生的ROS，提高其抗氧化能力。

序列表

<160>2

<210>1

<211>1937

<212>DNA

<213>盐角草(Salicornia europaea L.)

<400>1

cactcagcca caacaaccat tgccactcga aatcaagata tccgggttgg atttttcaat 60

cgattcatct tcctccacca ccaccgactc cacagcccat ctcctcaccg ccgtcccccg 120

actgccatct cttttttacg gcttcgaagt tcgttctgca gcactccatc tctacactcg 180

aagttccttc gtggctgcct tccccattga agtagaagcg gagcttctga ggttcacttc 240

ctagatctga tactgatttg gaggataccc acttgggaat tttttggggg aaaaatgtct 300

actttgctta aaattcatca caagtttgag ttttggagcc atgttcggtt ttctgagaga 360

tgttctcatt tgagtgttcc aaagggacac caacattata ttagaaaacc ccatgaaaaa 420

gggttcaaaa aggggtctgt tagagtaagc agtactcttt tggagcttgt tcctgagacc 480

aagaaggaga accttgaatt cgagctgcct ttctatgact cgtctaaggg cctgttggta 540

gaccttgccg ttgtgggagg tggccctgct ggactcgctg ttgcacaaca agtttctaat 600

gcaggtctct cagtttgtgc gattgatcct aacccgaaat tgatatggcc taataactat 660

ggtgtttggg tagatgaatt tgaagccatg gatttgcttg attgcctcga tactacatgg 720

tcaggtgctg ttgtttacat tgatgagaat ttaaagaaga atcttgatag gccttacgga 780

agggttaata gaaagttatt aaagtccaaa atgatgcaaa aatgtatatc aactggagtg 840

aaatttcatc aagcaaaagt catgaaagtc gtccatggag agtctaaatc gcaacttatg 900

tgcaatgacg gagtcacaat tcaagcttct gtggttttgg atgcaacggg gtttgctcgc 960

tgccttgtac agtatgataa accatacaac cctggttacc aagttgctta tgggattttg 1020

gccgaagttg aagggcatcc ttttgatgtg gataagatgt tattcatgga ttggagagat 1080

tcgcacttgg ttgataataa ggaattaaga gggagaaata gcaaaattcc gaccttccta 1140

tatgctatgc ctttctcgtc taataggata ttcttggagg aaacttcact cgttgctcgg 1200

cctggagtgc ctatggagga cattcagcaa agaatggacg ctcgattgag gcaccttggc 1260

ataaacatca agcgcattga ggaggatgaa cgctgcgtga tccctatggg tgggcccctt 1320

ccggtaatcc ctcaaagagt tgtgggaatt ggtggcactg ctggtttggt gcatccttct 1380

acggggtata tggttgcaag gactttggca gcagctccaa ttgttgccag tacaattgtt 1440

cagtatttgg gttcaggagg caggcaggat ggaagtgaat tgtttgaagg agtgtggaaa 1500

aacttatggc ccatagagag gaggcgtcaa agagagttct tctgctttgg tatggatatc 1560

ctgctcaaac ttgatttgcc gggtacaaga aagtttttcg atgcattttt tgatctagaa 1620

ccacgttatt ggcatggatt cttgtcttct cgactatatc ttcctgaact tattgttttc 1680

gggttctctc tttttgctca tgcctctaac tcttctaggc tagaaataat gtcaaaaggc 1740

actcttccat tgttaaatat ggtcaacaac ctagtaaaag atactgattg atatgtctta 1800

gcttgtttta tgtctttttc atttgtgatc atgcatacag atcatttgct tcaacttgta 1860

gattaaaata taaaaatgtc aattacaata cactctgttg atacgtataa aaaaaaaaaa 1920

aaaaaaaaaa aaaaaaa 1937

<210>2

<211>498

<212>PRT

<213>盐角草(Salicornia europaea L.)

<400>2

Met Ser Thr Leu Leu Lys Ile His His Lys Phe Glu Phe Trp Ser His

1 5 10 15

Val Arg Phe Ser Glu Arg Cys Ser His Leu Ser Val Pro Lys Gly His

20 25 30

Gln His Tyr Ile Arg Lys Pro His Glu Lys Gly Phe Lys Lys Gly Ser

35 40 45

Val Arg Val Ser Ser Thr Leu Leu Glu Leu Val Pro Glu Thr Lys Lys

50 55 60

Glu Asn Leu Glu Phe Glu Leu Pro Phe Tyr Asp Ser Ser Lys Gly Leu

65 70 75 80

Leu Val Asp Leu Ala Val Val Gly Gly Gly Pro Ala Gly Leu Ala Val

85 90 95

Ala Gln Gln Val Ser Asn Ala Gly Leu Ser Val Cys Ala Ile Asp Pro

100 105 110

Asn Pro Lys Leu Ile Trp Pro Asn Asn Tyr Gly Val Trp Val Asp Glu

115 120 125

Phe Glu Ala Met Asp Leu Leu Asp Cys Leu Asp Thr Thr Trp Ser Gly

130 135 140

Ala Val Val Tyr Ile Asp Glu Asn Leu Lys Lys Asn Leu Asp Arg Pro

145 150 155 160

Tyr Gly Arg Val Asn Arg Lys Leu Leu Lys Ser Lys Met Met Gln Lys

165 170 175

Cys Ile Ser Thr Gly Val Lys Phe His Gln Ala Lys Val Met Lys Val

180 185 190

Val His Gly Glu Ser Lys Ser Gln Leu Met Cys Asn Asp Gly Val Thr

195 200 205

Ile Gln Ala Ser Val Val Leu Asp Ala Thr Gly Phe Ala Arg Cys Leu

210 215 220

Val Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Asn Pro Gly Tyr Gln Val Ala Tyr Gly

225 230 235 240

Ile Leu Ala Glu Val Glu Gly His Pro Phe Asp Val Asp Lys Met Leu

245 250 255

Phe Met Asp Trp Arg Asp Ser His Leu Val Asp Asn Lys Glu Leu Arg

260 265 270

Gly Arg Asn Ser Lys Ile Pro Thr Phe Leu Tyr Ala Met Pro Phe Ser

275 280 285

Ser Asn Arg Ile Phe Leu Glu Glu Thr Ser Leu Val Ala Arg Pro Gly

290 295 300

Val Pro Met Glu Asp Ile Gln Gln Arg Met Asp Ala Arg Leu Arg His

305 310 315 320

Leu Gly Ile Asn Ile Lys Arg Ile Glu Glu Asp Glu Arg Cys Val Ile

325 330 335

Pro Met Gly Gly Pro Leu Pro Val Ile Pro Gln Arg Val Val Gly Ile

340 345 350

Gly Gly Thr Ala Gly Leu Val His Pro Ser Thr Gly Tyr Met Val Ala

355 360 365

Arg Thr Leu Ala Ala Ala Pro Ile Val Ala Ser Thr Ile Val Gln Tyr

370 375 380

Leu Gly Ser Gly Gly Arg Gln Asp Gly Ser Glu Leu Phe Glu Gly Val

385 390 395 400

Trp Lys Asn Leu Trp Pro Ile Glu Arg Arg Arg Gln Arg Glu Phe Phe

405 410 415

Cys Phe Gly Met Asp Ile Leu Leu Lys Leu Asp Leu Pro Gly Thr Arg

420 425 430

Lys Phe Phe Asp Ala Phe Phe Asp Leu Glu Pro Arg Tyr Trp His Gly

435 440 445

Phe Leu Ser Ser Arg Leu Tyr Leu Pro Glu Leu Ile Val Phe Gly Phe

450 455 460

Ser Leu Phe Ala His Ala Ser Asn Ser Ser Arg Leu Glu Ile Met Ser

465 470 475 480

Lys Gly Thr Leu Pro Leu Leu Asn Met Val Asn Asn Leu Val Lys Asp

485 490 495

Thr Asp

Claims

1、一种植物抗逆性相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2、权利要求1所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因的编码序列为自序列1的5′端第295-1788位脱氧核苷酸。

4、根据权利要求2或3所述的编码基因，其特征在于：所述植物抗逆性相关蛋白的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的DNA；

5、含有权利要求2-4任一所述的基因的重组表达载体。

6、含有权利要求2-4任一所述的基因的转基因细胞系。

7、含有权利要求2-4任一所述的基因的工程菌。

8、权利要求2-4任一所述的基因在培育抗逆性植物中的应用。

9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗逆性是抗盐性和/或抗氧化性。