CN1757733A - 编码甘薯番茄红素β－环化酶的cDNA序列 - Google Patents

Abstract

本发明提供了编码甘薯番茄红素β－环化酶的cDNA核苷酸序列，从红心甘薯块根分离克隆而得，其全长cDNA的长度为1,847bp，开放阅读框为1,728bp，详细序列如表1。甘薯番茄红素β－环化酶催化番茄红素环化形成β－胡萝卜素，是甘薯β－胡萝卜素合成的关键酶，因此该cDNA序列有重要的应用价值。

Description

编码甘薯番茄红素β-环化酶的cDNA序列

所属领域

本发明涉及甘薯(Ipomoea batatas)中表达的番茄红素β-环化酶(Ipomoea batatasLycopene β-cyclase)cDNA核苷酸序列。

技术背景

β-胡萝卜素(β-Carotene)的生物合成主要发生于高等植物、藻类、真菌和细菌体内，动物体内不能从头合成β-胡萝卜素。β-胡萝卜素是维生素A(Vitamin A)的前体，在人体内可根据需要转化为维生素A。它具有营养、着色的双重作用，是联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)食品添加剂联合专家委员会认定的A类优秀有营养的食品添加剂(foodadditives)。近年来，越来越多的医学研究表明，β-胡萝卜素可抗多种癌症，特别是可降低肺癌发病率。β-胡萝卜素在淬灭自由基，增强人体免疫力，预防心血管疾病等保护人类健康方面起着重要的作用。

天然β-胡萝卜素顺式异构体比例高，目前化学合成法还无法合成β-胡萝卜素顺式异构体，而顺式异构体已被临床证明其抗癌、抗心血管疾病以及保健功能远远高于全反式异构体。

类胡萝卜素合成是一个十分庞大的次生代谢途径，β-胡萝卜素的合成从牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)开始，依次经八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、ζ-胡萝卜素脱氢酶和番茄红素β-环化酶的催化，最终合成β-胡萝卜素，番茄红素β-环化酶是β-胡萝卜素合成的关键酶之一。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的甘薯番茄红素β-环化酶的核苷酸序列。

发明内容

本发明的目的是提供甘薯番茄红素β-环化酶的cDNA序列。

在本发明中，“分离的”cDNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒、粘粒等。在产生本发明的甘薯番茄红素β-环化酶cDNA时，可以将甘薯番茄红素β-环化酶cDNA可操作地连于表达调控序列，从而形成甘薯番茄红素β-环化酶cDNA的表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

本发明的甘薯番茄红素β-环化酶cDNA全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

获得有关的序列后，用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸小片段，然后再进行连接而获得编码本发明甘薯番茄红素β-环化酶cDNA序列。然后，可将该核酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。

表2列出了本发明的甘薯番茄红素β-环化酶cDNA与辣椒的β-胡萝卜素环化酶基因(GenBank Accession No.X86221)序列的同源比较图。

下面结合具体步骤，进一步阐述本发明。应理解，这些步骤仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列步骤中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等《分子克隆》、《实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

步骤1

甘薯番茄红素β-环化酶cDNA的克隆

1.组织分离(isolation)

红心甘薯品种金山72来源于福建农林大学作物学院薯类研究室，在大田种植90天，取幼嫩块根，用液氮速冻。

2.总RNA的分离(total RNA isolation)和检测

取根部，用研钵研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至50ml新管，抽提总RNA(TRIzol Reagents，Invitrogen，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，电泳图谱呈现出3条清晰可区分的条带，其中28SRNA∶18SRNA比值约为2∶1，表明总RNA基本上未降解，可用于甘薯番茄红素β-环化酶cDNA的全长克隆。

3.番茄红素β-环化酶cDNA的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)进行cDNA全长克隆，分四个阶段进行：

(1)RT-PCR

根据黄水仙、玉米、番茄、胡萝卜、辣椒等植物的番茄红素β-环化酶基因的核酸保守序列，设计保守引物，正向与反向引物分别为：lyc-b基因为SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2。采用RT-PCR的方法(TaKaRa试剂盒)，得到保守序列lyc-bcon(478bp)，连接到T-easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，lyc-b基因的保守序列与已知番茄(Lycopersicon esculentum)、烟草(N.tabacum)、辣椒(C.annuum)的番茄红素β-环化酶基因的同源性分别为82％、81％、80％，初步认为它是甘薯番茄红素β-环化酶cDNA的一个片段；

(2)3’-RACE

反转录总RNA，得到第一链cDNA。

第一轮PCR(引物为GR3(SEQ ID NO.9)+SEQ ID NO.3)

第二轮PCR(GR3N(SEQ ID NO.10)+SEQ ID NO.4)得到lyc3(584bp)其它过程如同(1)所示。

测序结果已有的数据库(Genebank+EMBL)搜索，得到其核酸序列与已知烟草(C.annuum)和番茄(Lycopersicon esculentum)、辣椒(C.annuum)的番茄红素β-环化酶基因的同源性分别为82％、82％、81％，故可进一步确认它是甘薯番茄红素β-环化酶cDNA的片段。

(3)5’-RACE

第一轮PCR(GR5(SEQ ID NO.11)+SEQ ID NO.5)

第二轮PCR(GR5N(SEQ ID NO.12)+SEQ ID NO.6)得到lyc5(924bp)其它过程如同(1)所示。

(4)PCR扩增番茄红素β-环化酶cDNA的编码区

通过组合使用上述3种方法，拼接候选的甘薯番茄红素β-环化酶cDNA序列，在该序列(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计正向引物lycF(SEQ ID NO.7)和反向引物lycR(SEQ ID NO.8)，以总RNA经Oligo(dT)反转录为模板，用高保真的Pyrobest酶，进行PCR扩增，PCR条件为94℃ 5min，随之以94℃ 30sec、60℃ 30sec和72℃ 2min进行30个循环，最后以72℃延伸10min。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1,728bp。(其它过程同(1))。

因此，组合上述4种方法得到的结果，获得了甘薯番茄红素β-环化酶cDNA序列(表1)。

BLAST的结果证明从甘薯中新得到的基因确为番茄红素β-环化酶cDNA。由于已知的同源番茄红素β-环化酶能够催化番茄红素环化形成β-胡萝卜素，故推测该系列基因具有相同的功能。

步骤2

甘薯番茄红素β-环化酶cDNA的序列信息与同源性分析：

本发明新的甘薯番茄红素β-环化酶cDNA的长度为1,847bp，开放读框位于276-1781位核苷酸，详细序列见表1。将甘薯番茄红素β-环化酶cDNA序列用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索，结果与番茄(Lycopersiconesculentum)的番茄红素β-环化酶基因(GenBank Accession No.X86221)在核苷酸水平上有74％的相同性，可以认为两者在功能上有很高相似性。

步骤3

甘薯番茄红素β-环化酶cDNA的功能分析：

在该步骤中，将甘薯番茄红素β-环化酶cDNA的编码序列构建入植物表达载体之中，并转化烟草，以分析各基因的功能。

1.植物表达载体的构建

依据甘薯番茄红素β-环化酶cDNA序列(表1)，设计扩增出各个基因完整编码阅读框的引物，分别在正反引物上引入限制性内切酶位点：正反引物分别引入BamHI和KpnI酶切位点。以步骤1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，保证甘薯番茄红素β-环化酶cDNA的阅读框完全正确。用内切酶BamHI和KpnI进行37℃酶切3h，回收目的片段1,728bp；植物表达载体p2300用BamHI和KpnI内切酶37℃酶切3h，回收目的片段。将经酶切的甘薯番茄红素β-环化酶cDNA的目的片段与经相应内切酶切过的p2300表达载体连接，转化大肠杆菌DH5α，37℃培养20h，进行重组子的PCR鉴定和酶切鉴定。

2.植物表达载体转化农杆菌

(1)取四份感受态农杆菌EHA105，加入含甘薯番茄红素β-环化酶cDNA的植物表达载体约1μg，轻轻混匀；

(2)于液氮中速冻2分钟，37℃温育5分钟；

(3)分别加入500μl YEB液体培养基，28℃轻摇2-4小时，消除感受态；

(4)分别取50-200μl菌液，分别涂布于含适当抗生素的YEB选择平板上，28℃倒置培养两天。

(5)鉴定呈阳性的农杆菌EHA105单菌落，接种到含50mg/L利福平，100mg/L卡那霉素的20ml液体YEB培养基中，于28℃恒温摇床振荡培养30个小时至对数生长期，取适量农杆菌用液体MS培养基稀释20-30倍。

3.烟草的遗传转化及再生

(1)取无菌烟草叶片，切除叶片边缘与中脉，于Ms+1.0mg/L NAA固体培养基中28℃预培养2天；

(2)重新取出材料，放入无菌MS液体培养基稀释过的带有目的基因的农杆菌中，浸泡15分钟，然后在有28℃摇床中低速摇15分钟；

(3)取出小叶片，用无菌滤纸吸去多余菌液，于MS固体培养基中28℃暗培养两天；

(4)把小叶片，用加500mg/L Cb的无菌水洗两次，无菌滤纸吸去多余菌液后，转入含100mg/LKm和500mg/L Cb分化培养基M₁中，28℃光下培养至分化出愈伤组织，直至长出芽，其间每15天继代一次；

(5)将长至3-5cm的芽转入生根培养基1/2Ms上诱导生根。

(6)经鉴定为阳性转基因烟草后，继续培养成苗。

4.转基因烟草叶片类胡萝卜素的提取

(1)取各转基因烟草叶片，迅速冷冻干燥，制成冻干粉，置真空干燥箱中避光保存，并尽快测定。

(2)准确称取冻干粉1.000g于具塞三角瓶中，加入提取液(丙酮∶乙醇＝3∶2)45mL，摇匀，盖上瓶塞，用超声波提取20分钟，过滤于50mL容量瓶中并定容。取20mL滤液置分液漏斗中，加入10mL石油醚混匀，加入10mL蒸馏水进行分配，取石油醚相置旋转蒸发瓶中，剩余水加入10mL石油醚进行再分配，合并2次石油醚相置旋转蒸发仪上，40-45℃蒸干，用2.0mL异丙醇溶解，过滤后上机测定。

5.高效液相色谱法测定转基因烟草叶片类胡萝卜素

(1)β-胡萝卜素标样的制备：β-胡萝卜素标淮品(Sigma公司产品)1.0mg，用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解，溶液转入25.0ml容量瓶中，用石油醚定容，浓度为0.04mg/ml，冰箱保存。临用时，吸取1.0ml于10.0ml容量瓶中，加流动相至刻度，此时浓度为0.004mg/ml。

(2)番茄红素标样的制备：番茄红素标淮品(Sigma公司产品)1.0mg，用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解，溶液转入25.0ml容量瓶中，用石油醚定容，浓度为0.04mg/ml，冰箱保存。临用时，吸取1.0ml于10.0ml容量瓶中，加流动相至刻度，此时浓度为0.004mg/ml。

(3)测定方法：流动相：乙腈∶三氯甲烷(92∶8)。检测波长：双波长测定，470nm(0-min)和450nm(8-13min)。流速：1.0mL/min。柱温：35℃。观测样品在470nm与450nm处有吸收峰的大小变化。

                      本发明涉及的记号及序列分列如下：

    (1)SEQ ID NO.1的信息

      (i)序列特征：

        (A)长度：23bp

        (B)类型：核苷酸

        (C)链性：单链

        (D)拓扑结构：线性

      (ii)分子类型：寡核苷酸

      (iii)序列描述：SEQ ID NO.1

      TATGGGGTTTGGGTGGATGAATT

    (2)SEQ ID NO.2的信息

      (i)序列特征：

        (A)长度：23bp

        (B)类型：核苷酸

        (C)链性：单链

        (D)拓扑结构：线性

      (ii)分子类型：寡核苷酸

      (iii)序列描述：SEQ ID NO.2

      TCCATACCG/aAAG/aCAG/aAAGAACTC

    (3)SEQ ID NO.3的信息

  (i)序列特征；

    (A)长度：25bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (iii)序列描述：SEQ ID NO.3

  AGAATGGTGGCTCGTTTAAGGCA

(4)SEQ ID NO.4的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：23bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (iii)序列描述：SEQ ID NO.4

  GCATTGAAGAAGACGAGCGTTGT

(5)SEQ ID NO.5的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：23bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (iii)序列描述：SEQ ID NO.5

  CTTATCGTACTGAACCAGGCATCT

(6)SEQ ID NO.6的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：23bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (iii)序列描述：SEQ ID NO.6

  CCACAGTTGCTTGAATCGTCACA

(7)SEQ ID NO.7的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：29bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (iii)序列描述：SEQ ID NO.7

  CGGGATCCGACATGGTAAGCCTACAACTG

(8)SEQ ID NO.8的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：26bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (iii)序列描述：SEQ ID NO.8

  GGGGTACCAACCAAAGTGCAAATCAA

(9)SEQ ID NO.9的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：25bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (iii)序列描述：SEQ ID NO.9

  GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG

(10)SEQ ID NO.10的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：23bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (iii)序列描述：SEQ ID NO.10

  CGCTACGTAACGGCATGACAGTG

(11)SEQ ID NO.11的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：23bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (iii)序列描述：SEQ ID NO.11

  CGACTGGAGCACGAGGACACTGA

(12)SEQ ID NO.12的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：26bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (iii)序列描述：SEQ ID NO.12

  GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA

表1编码甘薯番茄红素β-环化酶的cDNA序列

<110>福建农林大学

<120>编码甘薯番茄红素β-环化酶的cDNA序列

<160>1

<170>Patent In Version 2.1

<210>1

<211>1847

<212>DNA

<213>甘薯(Ipomoea batatas)

<221>gene

<222>(1)…(1847)

<400>Full length sequence of lycopene β-cyclase gene from Ipomoea batatas

1    GAAAACTGCT CACCACACCA CAAGCTTCTC CTCCCACGAA CCAAAACAAT GAGATTTCTT

61   TTTGTTCACT CACCTCCTGC GACATGGTAA GCCTACAACT GTCTACCTAT GCTGTCCTTC

121  AATTTTCTAA TTTTCTCTAC TAATTTATGT GGGATTTCTT GAAATTTTAG TCCAACCCAT

181  TTCACTATAT CCCTATTTAT TCCCTCCTGT ATTCCTTGTT CTTTGTACAT ACATACTGTT

241  TATCTTGAAA CCCCAGATTG TAGTGTGGAA GGGTG ATGGA TACTCTGCTA AAAACCCCTA

301  ATGAGCTTGA ATTTCTGCAC CCACATCATG GGTTTGCAGT TAAAGCTAGT GCCTTTACCT

361  CCCTGAAGCC TCAAAAACAG GAAATTAGGA TTGGTTCATT GAAATCTTGC AGGAATTTTG

421  GCCGTGTTAA GGCCAGCAGT AGTGCCCTAT TAGAACTTGT GCCTGTGACC AAGAAAGAGA

481  ATCTTGATTT TGAGCTCCCT ATGTTTGAAC CCTCTAAAGG GATTGTTGTG GATCTAGCTG

541  TGGTTGGGGG TGGCCCTGCT GGGCTTGCAG TGGCTCAGCA GGTTTCACAA GCTGGGCTAT

601  CAGTTTGTTC AATTGACCCC TCTCCCAAAT TGATTTGGCC CAATAACTAT GGAGTTTGGG

661  TGGATGAATT CGAGGCCATG GATTTGTTGG ATTGCCTCGA TACCACGTGG TCTGGAGCTA

721  TGGTGTATAT TGATGACCGC ACGACTAAAG ATCTTGACAG GCCTTATGGG CGGGTTAACA

781  GGAAGAAACT CAAATCGAAA ATGATGCAGA AATGCATTGC GAATGGTGTT AAGTTTCATC

841  AAGCCAAGGT TATAAGGGTG ATCCATGAAG AATCGAAATC CATGTTGATT TGCAGTGATG

901  GTGTGACGAT TCAAGCAACT GTGGTTCTTG ATGCAACTGG CTTTTCTAGA TGCCTGGTTC

961  AGTACGATAA GCCTTATAAT CCGGGCTATC AAGTTGCGTA TGGCATTCTG GCAGAAGTGG

1021 AGGAACACCC TTANGATTTG AATAAGATGG TTTTCATGGA TTGGCGAGAC TCTCACCTAA

1081 ACAGTAACTT GGAGCTAAAG GAGAGAAATA AAAGAATCCC GACCTTTCTT TATGCCATGC

1141 CATTTTCCTC GCAGAGGATA TTCCTTGAAG AAACCTCGCT AGTGGCTCGT CCCGGCTTAG

1201 ATATGAAGGA TATTCAGGAA AGAATGGTGG CTCGTTTAAG GCACTTAGGT ATCAACGTCA

1261 AGAGCATTGA AGAAGACGAG CGTTGTGTTA TCCCAATGGG AGGTCCCCTA CCCGTGATAC

1321 CCCAACGAGT TGTTGGAATT GGCGGTACTG CAGGTATGGT TCATCCCTCG ACCGGATATA

1381 TGGTGGCGAG GACTCTGGCT GCAGCTCCGG TTGTTGCCAA CGCAATCATT CAGTACCTAG

1441 GTTCCGAGAG AAGTCTTCTG GGCAACGAAT TATCAGCATC TGTTTGGAAA GACCTGTGGC

1501 CAATAGAGAG GAGGCGGCAA AGGGAATTCT TTTGTTTTGG TATGGATATT CTACTGAAGC

1561 TCGATTTGCC AGCCACAAGA AGATTTTTTG ATGCGTTTTT TGATCTAGAA CCCCGTTATT

1621 GGCATGGATT TCTATCATCC CGGCTGTTTC TTCGTGAGCT CATATTTTTT GGTCTCTCGC

1681 TTTTCTCTCA TGCCAGTAAT ACTTCTAGGT TAGAGATAAT GACCAAGGGC ACTTTGCCTC

1741 TGGTAAACAT GATCAACAAT TTGTTACAGG ATATAGAT TA AGTAATTTTG ATTTGCACTT

1801 TGGTTGGAAA TTATGTATGT AGCAATTCCT ATGTCCCAAA AAAAAAA

表2  Percent Identity：74％in nt overlap

1    GAAAACTGCTCACCACACCACAAGCTTCTCCTCCCACGAACCAAAACAATGAGATTTCTT

                             |||        |   ||  ||   ||   ||| |

1    ........................CTTAATTATAGAAATACTTAAGATATATCATTGCCC

61   TTTGTTCACTCACCTCCTGCGACATGGTAAGCCTACAACTGTCTACCTATGCTGTCCTTC

     |||  ||| | |  |    |    |    |  || |   |   | | |      |  |

37   TTTAATCATTTATTTTTAACTCTTTTAAGTGTTTAAAGATTGATTCTTTGTACATGTTCT

121  AATTTTCTAATTTTCTCTACTAATTTATGTG...GGATTTCTTGAAATTTTAGTCCAACC

       ||   |  | ||    | | | || | |    | ||||    | | | |||   | ||

97   GCTTCATTTGTGTTGAAAATTGAGTTGTTTTCTTGAATTTTGCAAGAATATAGGGGACCC

178  CATTTCACTATATCCCTATTTA..TTCCCTCCTGTATTCCTTGTTCTTT...GTACATA.

     |||||   |  |    |    |  || | |  ||| ||  | | | |||   | | |||

157  CATTTGTGTTGAAAATTGAGCAGCTTTCTTTGTGTTTTGTTCGATTTTTCAAGAATATAG

232  ...CATACTGTTTATCTTGAAACCCCAGATTGTAG..TGTGGAAGGGTGATGGATACTCT

        |  | | | | | ||        | |||| |   ||| |       |||||||| ||

217  GACCCCATTTTCTGTTTTCTTGAGATAAATTGCACCTTGTTGGGAAAATATGGATACGCT

287  GCTAAAAACCCCTAATGAGCTTGAATTTCTGCACCCACATCATGGGTTTGCAGTTAAAGC

       | | |||||| ||  | ||||||||||||||         ||| ||||  |||||||

277  CTTGAGAACCCCAAACAATCTTGAATTTCTGCA.........TGGATTTGGTGTTAAAGT

347  TAGTGCCTTTACCTCCCTGAAGCCTCAAAAACAGGAAATTAGGATTGGTTCATTGAAATC

     ||||||||||| |||  ||||| |||| ||    |    || ||   |||   ||||

328  TAGTGCCTTTAGCTCTGTGAAGTCTCAGAAGTTTGGTGCTAAGA..AGTTTTGTGAAGGT

407  TTGCAGG..AATTTTGGCCGTGTTAAGGCCAGCAGTAGTGCCCTATTAGAACTTGTGCCT

     |||  |   |    || | |||| ||||| || |||||||| || || || ||||| |||

386  TTGGGGAGTAGAAGTGTCTGTGTGAAGGCTAGTAGTAGTGCTCTTTTGGAGCTTGTACCT

465  GTGACCAAGAAAGAGAATCTTGATTTTGAGCTCCCTATGTTTGAACCCTCTAAAGGGATT

     | ||| || || || ||||||||||||||||| ||||||| ||| || || |||||| ||

446  GAGACAAAAAAGGAAAATCTTGATTTTGAGCTTCCTATGTATGACCCTTCAAAAGGGGTT

525  GTTGTGGATCTAGCTGTGGTTGGGGGTGGCCCTGCTGGGCTTGCAGTGGCTCAGCAGGTT

     ||||||||||| |||||||| || ||||| ||||| || ||||| || || ||||| |||

506  GTTGTGGATCTTGCTGTGGTCGGTGGTGGTCCTGCAGGTCTTGCTGTTGCACAGCAAGTT

585  TCACAAGCTGGGCTATCAGTTTGTTCAATTGACCCCTCTCCCAAATTGATTTGGCCCAAT

     ||  |||| || || || |||||||| ||||| ||   ||| |||||||| ||||| |||

566  TCTGAAGCAGGACTTTCTGTTTGTTCGATTGATCCGAATCCTAAATTGATATGGCCTAAT

645  AACTATGGAGTTTGGGTGGATGAATTCGAGGCCATGGATTTGTTGGATTGCCTCGATACC

     |||||||| ||||||||||||||||| ||||| ||||| ||||| ||||| || ||| |

626  AACTATGGTGTTTGGGTGGATGAATTTGAGGCTATGGACTTGTTAGATTGTCTTGATGCT

705  ACGTGGTCTGGAGCTATGGTGTATATTGATGACCGCACGACTAAAGATCTTGACAGGCCT

     || |||||||| ||   |||||| ||||||||    || |||||||||||| | || |||

686  ACTTGGTCTGGTGCAGCGGTGTACATTGATGATAAAACAACTAAAGATCTTAATAGACCT

765  TATGGGCGGGTTAACAGGAAGAAACTCAAATCGAAAATGATGCAGAAATGCATTGCGAAT

     |||||  |||||||| | ||| |  | ||||||||||||||||||||||| ||   ||||

746  TATGGAAGGGTTAACCGAAAGCAGTTGAAATCGAAAATGATGCAGAAATGTATACTGAAT

825  GGTGTTAAGTTTCATCAAGCCAAGGTTATAAGGGTGATCCATGAAGAATCGAAATCCATG

     |||||||| || ||||||||||| ||||||| ||| |||||||| ||||| |||||||||

806  GGTGTTAAATTCCATCAAGCCAAAGTTATAAAGGTAATCCATGAGGAATCTAAATCCATG

885  TTGATTTGCAGTGATGGTGTGACGATTCAAGCAACTGTGGTTCTTGATGCAACTGGCTTT

     ||||| |||| ||||||| | || ||||| || || ||||| || ||||||||||||||

866  TTGATATGCAATGATGGTATTACTATTCAGGCGACAGTGGTGCTCGATGCAACTGGCTTC

945  TCTAGATGCCTGGTTCAGTACGATAAGCCTTATAATCCGGGCTATCAAGTTGCGTATGGC

     |||||||  || |||||||| |||||||||||||| || || |||||||| || ||||||

926  TCTAGATCTCTTGTTCAGTATGATAAGCCTTATAACCCCGGGTATCAAGTAGCTTATGGC

1005 ATTCTGGCAGAAGTGGAGGAACACCCTTANGATTTGAATAAGATGGTTTTCATGGATTGG

     ||| |||| ||||| || || ||||| |  ||| | || |||||||||||||||||||||

986  ATTTTGGCTGAAGTTGAAGAGCACCCCTTTGATGTAAACAAGATGGTTTTCATGGATTGG

1065 CGAGACTCTCACCTAAACAGTAACTTGGAGCTAAAGGAGAGAAATAAAAGAATCCCGACC

     || ||||||||  | || |  ||| | ||||| |||||||||||||  ||||| || ||

1046 CGCGACTCTCATTTGAAGAACAACGTTGAGCTCAAGGAGAGAAATAGTAGAATACCAACT

1125 TTTCTTTATGCCATGCCATTTTCCTCGCAGAGGATATTCCTTGAAGAAACCTCGCTAGTG

     || |||||||||||||||||||| ||  | |||||||| |||||||||||||| || ||

1106 TTCCTTTATGCCATGCCATTTTCATCCAACAGGATATTTCTTGAAGAAACCTCACTTGTT

1185 GCTCGTCCCGGCTTAGATATGAAGGATATTCAGGAAAGAATGGTGGCTCGTTTAAGGCAC

     |||||||| || || | |||| | |||||||| ||| ||||||||||||||||||| |||

1166 GCTCGTCCTGGTTTGGGTATGGATGATATTCAAGAACGAATGGTGGCTCGTTTAAGTCAC

1245 TTAGGTATCAACGTCAAGAGCATTGAAGAAGACGAGCGTTGTGTTATCCCAATGGGAGGT

     || || || || || |||||||||||||| || || | |||||| || |||||||| |||

1226 TTGGGGATAAAAGTTAAGAGCATTGAAGAGGATGAACATTGTGTAATACCAATGGGTGGT

1305 CCCCTACCCGTGATACCCCAACGAGTTGTTGGAATTGGCGGTACTGCAGGTATGGTTCAT

      || || || ||  |||| ||  |||||||||||||||| || || || ||||||||||||

1286  CCTCTTCCAGTATTACCTCAGAGAGTTGTTGGAATTGGTGGCACAGCCGGTATGGTTCAT

1365  CCCTCGACCGGATATATGGTGGCGAGGACTCTGGCTGCAGCTCCGGTTGTTGCCAACGCA

      || || ||||| |||||||| || ||||| || ||||||||||| || |||||||| ||

1346  CCATCCACCGGTTATATGGTAGCAAGGACACTAGCTGCAGCTCCTGTCGTTGCCAATGCC

1425  ATCATTCAGTACCTAGGTTCCGAGAGAAGTCTTCTGGGCAACGAATTATCAGCATCTGTT

      || |||||||||||  |||| || ||||||| |  |||  | || ||||| ||| |||||

1406  ATAATTCAGTACCTCAGTTCTGAAAGAAGTCATTCGGGTGATGAGTTATCCGCAGCTGTT

1485  TGGAAAGACCTGTGGCCAATAGAGAGGAGGCGGCAAAGGGAATTCTTTTGTTTTGGTATG

      ||||| ||  ||||||| |||||||||||||| ||||| || ||||| || || ||||||

1466  TGGAAGGATTTGTGGCCGATAGAGAGGAGGCGTCAAAGAGAGTTCTTCTGCTTCGGTATG

1545  GATATTCTACTGAAGCTCGATTTGCCAGCCACAAGAAGATTTTTTGATGCGTTTTTTGAT

      || ||||| |||||||| || || || || ||||| || || |||||||| || || ||

1526  GACATTCTTCTGAAGCTTGACTTACCGGCTACAAGGAGGTTCTTTGATGCATTCTTCGAC

1605  CTAGAACCCCGTTATTGGCATGGATTTCTATCATCCCGGCTGTTTCTTCGTGAGCTCATA

       ||||||| |||||||||||||| ||  | |||||| || ||||||| | ||| ||||||

1586  TTAGAACCTCGTTATTGGCATGGCTTCTTGTCATCCAGGTTGTTTCTACCTGAACTCATA

1665  TTTTTTGGTCTCTCGCTTTTCTCTCATGCCAGTAATACTTCTAGGTTAGAGATAATGACC

       ||||||| ||||| ||||||||||||||    ||||||||||| ||||||||||||||

1646  GTTTTTGGGCTCTCACTTTTCTCTCATGCTTCAAATACTTCTAGATTAGAGATAATGACA

1725  AAGGGCACTTTGCCTCTGGTAAACATGATCAACAATTTGTTACAGGATATAGATTAAGTA

      ||||| ||| | ||  | ||| | ||||||||||||||||||||||||| ||| | | |

1706  AAGGGAACTCTTCCATTAGTACATATGATCAACAATTTGTTACAGGATAAAGAATGAATT

1785  ATTTTGATTTGCACTTTGGTTGGAAATTATGTATGTAGCAATTCCTATGTCCCAAAAAAA

         | || ||   | | ||

1766  CGACTTATCTGGGATCTTGT

1845  AAA

上列：甘薯番茄红素β-环化酶的cDNA序列

下列：番茄番茄红素β-环化酶的核酸序列(GenBank Accession No.X86221)

Claims (1)

1、编码甘薯番茄红素β-环化酶的cDNA序列，其特征是从红心甘薯块根分离克隆而得，其全长cDNA核苷酸序列的长度为1,847bp，其中开放阅读框位于276-1779位核苷酸，具体如下：

1     GAAAACTGCT CACCACACCA CAAGCTTCTC CTCCCACGAA CCAAAACAAT GAGATTTCTT

61    TTTGTTCACT CACCTCCTGC GACATGGTAA GCCTACAACT GTCTACCTAT GCTGTCCTTC

121   AATTTTCTAA TTTTCTCTAC TAATTTATGT GGGATTTCTT GAAATTTTAG TCCAACCCAT

181   TTCACTATAT CCCTATTTAT TCCCTCCTGT ATTCCTTGTT CTTTGTACAT ACATACTGTT

241   TATCTTGAAA CCCCAGATTG TAGTGTGGAA GGGTGA TGGA TACTCTGCTA AAAACCCCTA

301   ATGAGCTTGA ATTTCTGCAC CCACATCATG GGTTTGCAGT TAAAGCTAGT GCCTTTACCT

361   CCCTGAAGCC TCAAAAACAG GAAATTAGGA TTGGTTCATT GAAATCTTGC AGGAATTTTG

421   GCCGTGTTAA GGCCAGCAGT AGTGCCCTAT TAGAACTTGT GCCTGTGACC AAGAAAGAGA

481   ATCTTGATTT TGAGCTCCCT ATGTTTGAAC CCTCTAAAGG GATTGTTGTG GATCTAGCTG

541   TGGTTGGGGG TGGCCCTGCT GGGCTTGCAG TGGCTCAGCA GGTTTCACAA GCTGGGCTAT

601   CAGTTTGTTC AATTGACCCC TCTCCCAAAT TGATTTGGCC CAATAACTAT GGAGTTTGGG

661   TGGATGAATT CGAGGCCATG GATTTGTTGG ATTGCCTCGA TACCACGTGG TCTGGAGCTA

721   TGGTGTATAT TGATGACCGC ACGACTAAAG ATCTTGACAG GCCTTATGGG CGGGTTAACA

781   GGAAGAAACT CAAATCGAAA ATGATGCAGA AATGCATTGC GAATGGTGTT AAGTTTCATC

841   AAGCCAAGGT TATAAGGGTG ATCCATGAAG AATCGAAATC CATGTTGATT TGCAGTGATG

901   GTGTGACGAT TCAAGCAACT GTGGTTCTTG ATGCAACTGG CTTTTCTAGA TGCCTGGTTC

961   AGTACGATAA GCCTTATAAT CCGGGCTATC AAGTTGCGTA TGGCATTCTG GCAGAAGTGG

1021  AGGAACACCC TTANGATTTG AATAAGATGG TTTTCATGGA TTGGCGAGAC TCTCACCTAA

1081  ACAGTAACTT GGAGCTAAAG GAGAGAAATA AAAGAATCCC GACCTTTCTT TATGCCATGC

1141  CATTTTCCTC GCAGAGGATA TTCCTTGAAG AAACCTCGCT AGTGGCTCGT CCCGGCTTAG

1201  ATATGAAGGA TATTCAGGAA AGAATGGTGG CTCGTTTAAG GCACTTAGGT ATCAACGTCA

1261  AGAGCATTGA AGAAGACGAG CGTTGTGTTA TCCCAATGGG AGGTCCCCTA CCCGTGATAC

1321  CCCAACGAGT TGTTGGAATT GGCGGTACTG CAGGTATGGT TCATCCCTCG ACCGGATATA

1381  TGGTGGCGAG GACTCTGGCT GCAGCTCCGG TTGTTGCCAA CGCAATCATT CAGTACCTAG

1441  GTTCCGAGAG AAGTCTTCTG GGCAACGAAT TATCAGCATC TGTTTGGAAA GACCTGTGGC

1501  CAATAGAGAG GAGGCGGCAA AGGGAATTCT TTTGTTTTGG TATGGATATT CTACTGAAGC

1561  TCGATTTGCC AGCCACAAGA AGATTTTTTG ATGCGTTTTT TGATCTAGAA CCCCGTTATT

1621  GGCATGGATT TCTATCATCC CGGCTGTTTC TTCGTGAGCT CATATTTTTT GGTCTCTCGC

1681  TTTTCTCTCA TGCCAGTAAT ACTTCTAGGT TAGAGATAAT GACCAAGGGC ACTTTGCCTC

1741  TGGTAAACAT GATCAACAAT TTGTTACAGG ATATAGATTA AGTAATTTTG ATTTGCACTT

1801  TGGTTGGAAA TTATGTATGT AGCAATTCCT ATGTCCCAAA AAAAAAA