转基因合成紫穗槐-4,11-二烯
本发明涉及一段DNA序列,该序列编码的多肽,以及所述DNA序列和多肽在制备紫穗槐二烯(amorphadiene)中的应用。
人类疟疾是一种常见的发生较普遍的传染病,85%的病例是由镰刀形疟原虫(Plasmodium falciparum)引起。该寄生虫导致最致命形式的疟疾,热带疟疾。每年,疟疾引起的临床疾病通常非常严重,超过1亿人,其中100多万人将最终死亡。大约40%的世界人口处在疟疾感染的危险之中(据世界卫生组织估计)。
传统上治疗疟疾采用喹啉类物质,如喹宁、氯喹、甲氟喹和伯氨喹,以及抗叶酸制剂。不幸的是,大部分镰刀形疟原虫株已变得对氯喹耐药,有些已经发展到对甲氟喹和氯氟菲醇(halofantrine)耐药。因此,急需耐药寄生虫敏感的新型抗疟药。本文青蒿素(artemisinin)及其半合成的衍生物就是很有前途的候选药物。
青蒿素(artemisinin,图1),[3R-(3α,5αβ,6β,8αβ,9α,12β,12αR*)]-八氢-3,6,9-三甲基-3,12-环氧-12H-吡喃-[4,3-j]-1,2-苯并二氧庚英-10(3H)-酮;分子量282.35),也叫arteannuin,qinghaosu或QHS),是从植物黄花蒿(Arternisia annua L.)的地上部分提取的一种倍半萜内酯内过氧化物。
黄花蒿也叫青蒿(中文),草蒿或香蒿,或香艾,一年生草本,原产于亚洲。青蒿属菊科,属于Asteroideae的Anthemideae群落,是一种常高达2m以上的大型药草。通常单茎多分枝,叶芳香、深裂,长2.5~5cm。青蒿素作为次级代谢物,主要在叶片中生产,野生种群中浓度为干重的0.01~0.6%。青蒿素为植物青蒿所特有,可能的特例是邪蒿(A.apiacea L.)。本发明中所用的青蒿源自越南。
由于在植物中含量低,青蒿素是一种相对昂贵的药用资源。因而,目前的研究旨在利用有机合成方法,较大规模生产青蒿素。但是,由于青蒿素由七个手性碳原子构成,理论上可形成27=128种异构体,其中只有一种与青蒿素相同。鉴于青蒿素如此复杂的结构,从商业观点来看,利用有机合成生产该化合物并非有利可图。
利用生物合成途径的遗传工程可能在植物中获得高水平的青蒿素。为了能够干预青蒿素的生物合成,必须完全或部分了解其生物合成途径。为阐明其完整的生物合成途径,已经进行了很多努力。不过到目前为止,准确的途径大多仍不为人知。
在导致本发明的研究中,发现了以前未见发表的一条独特途径。该途径特别涉及到形成青蒿素前体紫穗槐-4,11-二烯(amorpha-4,11-diene)(1β,6β,7β,10αH-紫穗槐-4,11-二烯)以及二氢青蒿素酸(dihydroarteannuic acid)的过氧化氢化物。以前未见文献报道在青蒿中发现这些前体。
从文献可知,萜环化酶(合成酶)是一种枝点酶,可能在萜类的生物合成中具有重要作用。因此,本发明的工作假说是,过量表达这样的枝点酶(萜环化酶)可以增加生物体中萜类的产量。就青蒿素而言,通往青蒿素的后续生物合成步骤的数目和本质是可能影响该方法成功的因素。图2所示为本发明者假定的青蒿素生物合成途径。该途径分为三个部分:
第Ⅰ部分(部分Ⅰ)代表萜类(类异戊二烯)途径,属常规途径。例如,二磷酸法呢酯(焦磷酸法呢酯,FPP)存在于所有活的生物体中,是大量初级和次级代谢物的前体,已经明确FPP是所有倍半萜的前体。因此,可以确定FPP是青蒿素的前体。
部分Ⅱ显示普通前体FPP经环化作用成为高特异性的前体紫穗槐-4,11-二烯(也称为紫穗槐二烯),是青蒿素的第一个特异性前体。紫穗槐二烯合成酶是该途径的枝点酶,在青蒿素的生物合成途径中处于关键地位。
部分Ⅲ,二氢青蒿素酸(dihydroarteannuic acid,DHAA),也称为dihydroartemisinic acid,通过光氧化作用转化成其过氧化氢化物(DHAA-OOH),该DHAA的过氧化氢化物将会自发地氧化成为青蒿素。这一途径中不涉及酶,因而,不可能通过过量表达该途径中涉及的基因,来改变青蒿素的产量。
在紫穗槐二烯转化为DHAA,即部分Ⅱ和部分Ⅲ之间的过渡状态中(见图3),很可能涉及烯酸还原酶(enoate reductase)以及多种受细胞色素P-450催化的酶。因为在植物中这部分途径的中间体没有发现,或以检测不到的量存在(积累)(有一例外是青蒿素酸(arteannuic acid),也称为artermisinic acid,或4,11(13)-紫穗槐二烯-12-酸),很可能这些前体被非常迅速地转换成DHAA。该部分途径不太可能有限速步骤。
综合考虑这些因素,本发明者断定,由紫穗槐二烯合成酶将FPP转化(环化)为紫穗槐二烯,是可经遗传干预而改变的最合理的步骤。
因此本发明目的在于提供一种方法,其中通过至少部分是生物学的路线获得青蒿素。
该目的通过提供一段DNA序列而达到,该序列与图12所示序列至少70%同源,并编码具有紫穗槐二烯合成酶生物活性的多肽。
紫穗槐二烯合成酶的生物活性涉及普通前体焦磷酸法呢酯(FPP)转化为青蒿素特异性前体紫穗槐-4,11-二烯,后者在青蒿中被进一步转化为青蒿素。根据本发明,通过测试其基因表达产物将FPP转化为紫穗槐-4,11-二烯的能力,可选择适当的基因。
利用本发明的DNA序列转化适当的宿主细胞,能够增强焦磷酸法呢酯(FPP)到高特异性前体紫穗槐二烯的转化,如果该生物体中天然不存在该转化路线,则可诱导这种转化。如果是后一种情况,生物体应该含有,或能生产FPP。适当的宿主细胞是例如细菌细胞,如大肠杆菌细胞,酵母细胞如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris),特别是产油酵母,如Yarrowialipolytica,或者是植物细胞,如类似青蒿的那些植物。
有几种植物能产生大量FPP,有可能成为生产紫穗槐二烯的生物体。
可能的产油酵母宿主细胞,例如,象Yarrowia lipolytica和Cryptococcus curvatus,能够在含油小体中蓄积高达约50%(干重)的储存碳水化合物,是引人注目的大量生产萜类的候选生物体。根据本发明,获得高水平的萜蓄积的方法是,例如借助于新陈代谢流向的重定向,使有利于形成紫穗槐-4,11-二烯。
Shimada等人利用类异戊二烯途径的代谢工程提高食物酵母产朊假丝酵母(Candida utilis)的类胡萝卜素产量(应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)64,2676-2680(1998)),与此类似,根据本发明,在这样的酵母细胞中,目标基因是乙酰辅酶A羧化酶(ACC,破坏)、羟基-甲基-戊二酰辅酶A还原酶(HMGR,过量表达)和鲨烯合成酶(SQS,破坏),以增加前体的供应,以及过量表达紫穗槐-4,11-二烯合成酶以蓄积紫穗槐二烯。由文献可知,几种表达系统(例如Muller等人,酵母(Yeast)14,1267-1283(1998);Park等人,生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry)272,6876-6881(1997);Tharaud等人,基因(Gene)121,111-119(1992))和转化系统(例如Chen等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,48232-235(1997))适于Y.lipolytica,因此在Y.lipolytica中转化和表达前述目标基因是可能的,没有大的技术难题。
把FPP加到其中含有本发明的酶(如按实施例1所述分离)或含有本发明DNA序列(如例3和例4所述)并表达的转化细胞如大肠杆菌的培养基中,可以将FPP转化成紫穗槐二烯,然后作为生产青蒿素的原料。
因在其中表达本发明的紫穗槐二烯合成酶而生产紫穗槐二烯的转化细胞,既可以裂解形式(例如通过超声处理),也可以完整细胞,用作为紫穗槐二烯的来源。
萜环化酶据认为是限速步骤,所以在青蒿中过量表达紫穗槐二烯合成酶编码基因,将增加青蒿素产生。
本研究结果(假定的青蒿素的生物合成途径)清楚表明,在紫穗槐二烯合成酶处存在唯一的主要限速步骤,在青蒿中过量表达紫穗槐二烯合成酶编码基因,将增加青蒿素的生产。
FPP的环化产物是青蒿素的第一个特异性前体,其化学结构文献未见报道。迄今为止,没有人在青蒿中检测到这样的化合物。不过,根据DHAA和青蒿素酸的结构,预测该环化产物的大概结构是可能的(图3)。这种方式预测的结构与文献报道的化合物4,11-紫穗槐二烯一致(J.D.Connelly和R.A.Hill,萜类字典(Dictionary of terpenoids),Chapmann和Hill,伦敦,英国),如图4所示。Bohlmann等人先前曾描述过从Viguiera oblongifolia中提取这种化合物,但将其错误命名为杜松-4,11-二烯(植物化学23(5)1183-1184(1984))。从青蒿素酸(从青蒿中提取)开始,能够合成紫穗槐二烯。这样获得的紫穗槐二烯,其物理和化学性质与Bohlmann等人描述的完全一致,该标准用来表明,在青蒿的萜提取物中存在紫穗槐二烯。
本发明的另一个目的在于,提供可按实施例1所述方法获得的具有紫穗槐二烯合成酶生物活性的多肽。该多肽能用来将FPP转化成紫穗槐二烯,进而转化成青蒿素。如果在含有把紫穗槐二烯进一步转换成青蒿素所需酶的植物内表达紫穗槐二烯合成酶多肽,即能在植物体内发生这种转化。或者把FPP和所述多肽(分离形式或作为细胞内表达产物)放在混合体系中温育,也能在体外发生这种转化。
在由本发明所述DNA序列转化的适当的宿主生物体中产生的紫穗槐二烯,随后可以作为前体被化学转化为二氢青蒿素酸。二氢青蒿素酸本身就能用来生产青蒿素。
紫穗槐二烯化学转化为二氢青蒿素酸(图15),是从紫穗槐二烯和BH3的对映体、立体和区域选择性(反马科尼科夫规则)的硼氢化反应开始,产生三烷基硼烷,随后三烷基硼烷被NaOH/H2O2氧化,产生醇(高等有机化学(Advanced Organic Chemistry),Jerry March,第四版,Wiley,1992)。PDC(重铬酸吡啶鎓)能使醇温和氧化为酸,而不会攻击第二个双键(图15)(有机合成(Organic Synthesis),M.B.Smith,第一版,McGraw-Hill,1994)。
文献报道,已克隆了很多编码二磷酸法呢酯生物合成途径相关酶的基因。例如,文献报道了编码青蒿中二磷酸法呢酯合成酶的基因序列(Y.Matsushita,W-K.Kang和V.Charlwood,基因(GENE)172(1996)207-209)。诱导或提高生物体产生紫穗槐二烯的另一条途径是,将本发明的DNA序列与一种或多种二磷酸法呢酯生物合成相关基因同时转化该生物体(如青蒿),表达紫穗槐二烯合成酶和二磷酸法呢酯合成酶的融合蛋白就是一个实例。
(倍半)萜,如紫穗槐二烯,已知也是食品和香水工业的调料和香料化合物。另外,萜类在植物-昆虫的互作中起作用,例如植物吸引或排斥昆虫。再者,二氢青蒿素酸(青蒿中从紫稳槐二烯到青蒿素代谢途径的中间体),能用做抗氧化剂。
由(过量)表达本发明的DNA序列或使用本发明的多肽(紫穗槐二烯合成酶)所得到的紫穗槐二烯,也能用于这些用途。
优选地,可用于本发明的植物是已能产生青蒿素的植物。青蒿是最好的实例,它含有通向青蒿素的其余途径。不过,本发明也可用于在植物中产生紫穗槐二烯,其如前所述可用做调料、香料或杀虫剂,或者通过化学方法或利用微生物、酵母、植物细胞的生物方法转化为青蒿素。
优选地,用于产生紫穗槐二烯的植物是已有基本途径和储藏区室而能产生倍半萜的植物,或者是能够受激发诱导生物合成倍半萜类的植物。本发明所述方法易于通过常规技术用于许多植物,例如包括来自田苋蒿属(Carum)、菊苣属(Cichorium)、胡萝卜属、刺柏属(Juniperus)、春黄菊属(Chamomilla)、莴苣属(Lactuca)、广藿香属(Pogostemon)和香根草属(Vetiveria)的物种,以及来自可(通过激发)诱导产生倍半萜类植物抗毒素的属-辣椒属、棉属、番茄属、烟草属、梯牧草属、茄属和榆属的物种。不过,象大豆、向日葵和油菜籽(rapeseed)那样的常见农作物也是引人注意的候选对象。
本发明将由以下实施例作进一步阐明,但将不仅局限于此。在实施例中图注如下:
图1:青蒿素的结构式。
图2:青蒿中假定的青蒿素生物合成途径。
图3:图2中部分Ⅱ和部分Ⅲ间的转化:假定的青蒿中紫穗槐二烯到二氢青蒿素酸的转化。
图4:紫穗槐-4,11-二烯的结构式。
图5:[3H]-FPP分析的放射气相色谱图(Radio-GC)。A.紫穗槐二烯的火焰电离检测器(FID)信号(参照)。B.3H标记的分析产物紫穗槐二烯(保留时间14分钟)和法呢醇(非特异性磷酸水解酶活性产物,保留时间28分钟)的放射信号,其得自粗酶提取物。C.3H标记的分析产物紫穗槐二烯的放射信号,其得自Mono Q纯化的酶提取物。
图6:紫穗槐二烯作参照的质谱,与采用从青蒿中纯化的萜环化酶(合成酶)的FPP分析的质谱比较。该比较得到质量评分为99%,对应同一性的最大评分。
图7:PCR制备探针,克隆到pGEM 7Zf+。
图8:探针的核苷酸序列以及推测的氨基酸序列,该探针(538bp)由使用引物A和B的PCR制备。
图9:从受诱导青蒿的cDNA文库中分离得到的一个阳性克隆的质粒。
图10:从受诱导青蒿的cDNA文库中分离得到的一个阳性克隆(紫穗槐二烯合成酶编码基因)的核苷酸序列以及推测的氨基酸序列,序列侧翼为EcoRⅠ(NotⅠ)衔接头(Gibco BRL)。
图11:紫穗槐二烯合成酶编码基因起始和终止密码子之间的部分(两端分别为NcoⅠ和BamHⅠ位点),克隆于表达载体pET11d的NcoⅠ/BamHⅠ位点。
图12:由使用引物C和D的PCR制备的紫穗槐二烯合成酶编码基因起始和终止密码子之间(两端分别为NcoⅠ和BamHⅠ位点)的核苷酸序列以及推测的氨基酸序列。
图13:SDS-PAGE凝胶:泳道1和2分别表示pET11d的菌体和上清(阴性对照);泳道3和4分别表示含有烟草5-表-马兜铃碱合成酶(tobacco 5-epi-aristolochene synthase,TEAS)基因的pET11d的菌体和上清(阳性对照);泳道5,7,9和6,8,10分别表示含有紫穗槐二烯合成酶的pET11d的菌体和上清。所有构建体都在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。含有TEAS的pET11d(阳性对照)和含有紫穗槐二烯合成酶的pET11d的菌体成分的泳道都显示明显的条带,在pET11d阴性对照中则没有。Mw是低分子量标准(PharmaciaBiotech)。
图14:A.紫穗槐-4,11-二烯和法呢醇的火焰电离检测器(FID)信号(参照);B.用完整BL21(DE3)细胞做的[3H]-FPP分析的放射气相色谱,该细胞由含有紫穗槐二烯合成酶编码基因的pET11d表达载体转化而来;C.用超声破碎的BL21(DE3)细胞上清做的[3H]-FPP分析的放射气相色谱,该细胞由含有紫穗槐二烯合成酶编码基因的pET11d表达载体转化而来。
图15:假定的以紫穗槐-4,11-二烯为前体,化学合成二氢青蒿素酸。该反应包括紫穗槐二烯和BH3的对映体、立体和区域选择性(反马科尼科夫规则)的硼氢化反应,形成的三烷基硼烷随后被NaOH/H2O2氧化,产生醇。PDC(重铬酸吡啶鎓)使醇温和氧化为酸,而不会攻击第二个双键。
图16:利用分子排阻层析(凝胶过滤)测定紫穗槐-4,11-二烯的分子量。-*-是活性曲线;-▲-是分子量标准;-是分子量校准线。
实施例
实施例1
通过紫穗槐二烯合成酶将焦磷酸法呢酯转换为紫穗槐二烯
A.从青蒿中分离、部分纯化和鉴定紫穗槐二烯合成酶
本分析中分离与制备酶的全部操作均在冰上或4℃进行。将10g采自温室培养的青蒿的嫩叶冷冻,在预冷的研钵中捣碎,于40ml预冷的含25mM MES(pH5.5),20%(v/v)甘油,25mM抗坏血酸钠,25mMNaHSO3,10mM MgCl2和5mM DTT的缓冲液(缓冲液A)中研磨,所述缓冲液中加入1g聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)和一勺纯净海沙搅成浆状。加入10g聚苯乙烯树脂(Amberlite XAD-4,Serva),小心搅拌浆液10分钟,然后用干酪布过滤。滤液于20,000g离心20分钟(弃沉淀),然后100,000g离心90分钟。取3ml上清样品用含15mMMOPSO(pH7.0),10%(v/v)甘油,1mM抗坏血酸钠,10mM MgCl2和2mM DTT的缓冲液(缓冲液B)脱盐,用作酶分析/产品鉴定(参见下述“B”)。
将12.5g DEAE阴离子交换树脂(Whatman DE-52)用缓冲液A漂洗数次,加入剩余上清中,小心搅拌10分钟,18,000g离心20分钟,移出上清,丢弃DE-52沉淀。加入(NH4)2SO4至70%终浓度,小心搅拌30分钟,20,000g离心10分钟,以沉淀上清中蛋白。产生的沉淀重溶于6ml缓冲液A,用缓冲液B脱盐。在加入甘油多至30%(v/v)后,可以将酶制剂在液氮中冷冻,-80℃保存而不失活。预先用含0.1%Tween-20、不含抗坏血酸钠的缓冲液B平衡Mono-Q FPLC柱(HR5/5,Pharmacia Biotech),将该酶制剂0.5ml上样,用0-2.0M KCl梯度的相同缓冲液洗脱该酶。为测定酶活性,取0.75-ml洗脱组分的50ul,在Eppendorf管中用缓冲液B稀释2倍,加入20uM[3H]FPP。反应混合物覆盖1ml己烷,封闭挥发性产物和各混合成分。30℃温育30分钟后,剧烈混合,短暂离心,使其分相。己烷相部分(750ul)移入一个新Eppendorf管,其中含有40mg硅胶(0.035-0.07mm,孔径6nm,Janssen Chimica),用以结合磷酸水解酶产生的萜烯醇。混匀并离心后,取500ul己烷层液体,加入4.5ml Ultima Gold cocktail(Packard)中,用于液体闪烁计数。合并各活性组分,分析产物同一性(参见下文)。在Mono-Q步骤之后,该酶与所有其它FPP转化活性被分离开来(图5C)。用该酶制剂测定其酶学特性,如分子量和Km。利用分子排阻层析测定其分子量。将200ul Mono-Q洗脱组分上样到Superdex 75(H/R10/30,Pharmacia Biotech),用与Mono-Q相同的缓冲液洗脱。同Mono-Q所述一样测定0.5ml组分中的酶活,只是不用稀释洗脱液。柱子用细胞色素C、核糖核酸酶A、α-胰凝乳蛋白酶原、卵清蛋白以及BSA(均自Sigma)校准,估计分子量为56kDa(图16)。利用5倍和10倍稀释的Mono-Q洗脱酶制剂,以及0.25-100uM浓度的[3H]-FPP测定酶的动力学。紫穗槐二烯合成酶的Km值为0.6uM。
B.测定产物同一性
为测定产物同一性,将20uM[3H]-FPP(Amersham;用于放射气相色谱分析)或50uM未标记的FPP(Sigma;用于气相色谱-质谱分析)加入1ml酶制剂中,管中覆盖1ml重蒸戊烷,以封闭挥发物,然后小心混合管内成分,30℃温育1小时。用煮沸的样品作对照。随后,剧烈混匀各管,移出有机层,通过一覆盖无水MgSO4的氧化铝小柱,用1ml二乙醚过柱提取,再用1.5ml二乙醚洗柱。合并的戊烷/二乙醚混合物在氮气流中缓慢浓缩,用于气相色谱分析。
用装有RAGA-90放射性探测器(Raytest,Straubenhardt,德国)的Carlo-Erba 4160系列气相色谱仪进行放射气液色谱分析。在放射性测定前,经过一个800℃的装满铂片的转换反应器,定量还原柱洗脱组分。以冷的在柱方式注入1ul样品。柱子是一根融合的二氧化硅毛细管(30m×0.32mm i.d.),包被有一层0.25um的聚乙二醇(EconoCap EC-WAX,Alltech Associates)薄膜,并在氦流速为1.2mlmin-1下操作。炉温设定程序为70℃5分钟,然后以5℃min-1升到210℃,最后5分钟。为通过放射性与参照标准的共洗脱测定保留时间和峰的同一性,通过可调分流器,约20%的柱流出液被分流到FID(温度270℃),余者引到转化反应器和放射性探测器。在反应器之前以3mlmin-1通氢气,在放射性探测器(5ml计数管)之前通甲烷作为淬灭气体,总流速为36ml min-1。主要的[3H]标记物与紫穗槐二烯参照标准(保留时间为14分钟)共洗脱(图5B)。第二个放射性标记物是作为非特异性磷酸水解酶活性的产物的法呢醇。在Mono-Q步骤之后,该酶与所有其它FPP转化活性被分离开来(图5C)。该酶制剂用来测定诸如Km和分子量等酶学特性。
气相色谱-质谱分析使用配有HP-5MS或HP-Innowax柱(均为30m×0.25mm i.d.,0.25um df)的HP 5890 seriesⅡ气相色谱仪和HP5972A质量选择性检测器(Hewlett-Packard)进行。炉温设定程序为起始温度70℃1分钟,然后以5℃min-1升到210℃,最后5分钟。注入口(非分流方式)、界面和质谱源温度分别为175,290和180℃,由电子压力控制器控制氦入口压力,使恒定流速为1.0ml min-1。电离电压设为70eV,并从30-250amu进行扫描。(NH4)2SO4沉淀的酶制剂不含内源性倍半萜类,利用该酶制剂从FPP生成倍半萜产物,用两个不同的气相色谱柱对这些产物进行气相色谱-质谱分析表明,主要产物的质谱和保留时间与半合成的紫穗槐二烯相同(图6)。
实施例2
紫穗槐二烯合成酶编码基因的分离和鉴定
A.转录诱导
如图2中部分Ⅲ所示,DHAA通过光氧化作用转换成DHAA-OOH。该反应中将活性氧(单线态O2)的形式加到DHAA上。DHAA有抗氧化剂作用,是各种形式活性氧的清除剂。在保有活性氧的反应中,稳定的终产物是青蒿素。植物在压力条件(如光压力、霜、干旱或机械损伤)下产生活性氧,对此植物一般产生抗氧化剂来响应。青蒿很可能产生DHAA作为抗氧化剂来对这种活性氧释放进行响应。将青蒿置于压力条件下,将能诱导紫穗槐二烯合成酶编码基因的转录。为达此目的,将室内气候条件下(23℃,90%湿度,3000LUX)生长的青蒿置于30℃、约30%湿度(干旱压力)和6000LUX(光压力)的压力条件下1小时。
B.总RNA提取
利用Verwoerd等人的方法(核酸研究(Nucleic Acids Research)17(6),2362(1989)),从受压力诱导植物(据实施例2A)的嫩叶中提取总RNA,用DNaseⅠ(脱氧核糖核酸酶Ⅰ,无RNase)从RNA提取物中去除DNA,然后在70℃处理15分钟灭活DNaseⅠ。
C.cDNA合成
在含有5ug总RNA,0.2ug oligo(dT)12,dATP、dTTP、dCTP和dGTP各0.5mM,10mM DTT,2U核糖核酸酶抑制剂(Gibco BRL),第一链合成缓冲液(Promega)并用200U无RNase H的Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)反转录酶(Promega)催化的20ul体系中进行反转录反应。37℃反应1小时后,将反应混合物在-20℃保存,以终止反应。
D.PCR探针制备
在比较萜类合成酶序列的基础上,针对2个保守区设计两条简并引物。有义引物(引物A)序列为5′-GA(C/T)GA(G/A)AA(C/T)GGIAA(G/A)TT(C/T)AA(G/A)GA-3′,反义引物(引物B)序列为5′-CC(G/A)TA IGC(G/A)TC(G/A)AA IGT(G/A)TC(G/A)TC-3′。PCR反应总体积为100ul,其中含有每种引物各0.5uM,每种dNTP各0.2mM,1USuper Taq聚合酶/lx PCR缓冲液(HT Biotechnology LTD,剑桥,英国)以及2ul cDNA。在热循环仪(PTC 150 MJ-research)中进行反应,其中95℃变性1分钟,40℃退火1分钟,72℃延伸1分15秒,共40个循环。琼脂糖凝胶电泳显示一条约550bp(538bp)的单一特异性PCR产物,只有使用从受压力诱导植物中提取的RNA制备的cDNA,才能获得该特异性的扩增产物。PCR产物经DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow)平端化、凝胶纯化,亚克隆到SmaⅠ酶切的pGEM7Zf(+)(Stratagene)中(图7),然后用该构建体转化Ecoli DH5α(GibcoBRL)。对8个独立转化子的插入片段测序,均具有如图8所示的相同序列。
E.cDNA文库构建
利用类似RiboClonecDNA合成系统(Promega)的方法,合成cDNA第二链。将双链DNA与序列如下的EcoRⅠ(NotⅠ)衔接头(Gibco BRL)连接后,
5′-pGTCGACGCGGCCGCG-3′
3 ′-CAGCTGCGCCGGCGCTTAA-OH-5′
再连接到λExcell EcoRⅠ/CIP(Pharmacia Biotech)。cDNA文库的包装和铺板使用Ready-To-GoLambda包装试剂盒(PharmaciaBiotech),未扩增文库的滴度为1.2×106噬斑形成单位。
F.文库筛选
为筛选文库,200ng PCR扩增探针(图8)经凝胶纯化,根据制造商推荐程序进行[α-32P]dCTP随机标记(随机引发的DNA标记试剂盒,Boehringer Mannheim Biochemica),用于筛选铺于大肠杆菌NM522的cDNA文库104个噬斑的复制膜。在68℃,1M NaCl,1%SDS和10%PEG(5000-7000)中杂交16小时,然后在50℃,含0.1%SDS的2xSSC中洗膜两次,各10分钟,用Fuji X光片于-70℃爆光16小时。通过第二轮、第三轮杂交分离阳性克隆。将阳性克隆转染大肠杆菌NP66(Pharmacia Biotech),根据制造商说明书(PharmaciaBiotech)获得释放的质粒(图9)。将这些阳性克隆测序,得到如图10所示序列。
实施例3
在大肠杆菌BL21(DE3)中表达紫穗槐二烯合成酶编码基因
将cDNA克隆符合读框地亚克隆到表达载体pET11d(Stratagene),以进行功能性表达。为引入合适的亚克隆酶切位点,使用PCR扩增该基因,其中有义引物(引物C)为5′-GTCGACAAACCATGGCACTTACAGAA G-3′ (在起始密码ATG处引入NcoⅠ位点),反义引物(引物D)为5′-GGATGGATCCTCATATACTCATAGGATAAACG-3′ (在终止密码TGA后引入BamHⅠ位点)。PCR反应在标准条件下进行。PCR产物(图12)和表达载体pET11d经BamHⅠ和NcoⅠ酶切、凝胶纯化、连接,得到如图11所示的构建体。
为了获得表达,将该基因构建体(图11)、作为阴性对照的无插入基因的pET11d,以及作为阳性对照的带有烟草5-表-马兜铃碱合成酶(TEAS)基因(Back等人,生物化学和生物物理进展(Archives ofBiochemistry and Biophysics)315(2)527-532(1994);Facchini和Chappell,美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89,11088-11092(1992);Back和Chappell,生物化学杂志(The Journal ofBiological Chemistry)270,7375-7381(1995))的pET11d转化大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene),在补加氨苄青霉素的LB琼脂平板上37℃培养过夜。将这些过夜培养物接种到50ml补加氨苄青霉素(100ug/ml)和0.25mM异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB培养基中,培养至A600=0.5,然后在27℃培养3小时。2000g离心8分钟收集细胞,重悬于2ml分析缓冲液中。重悬细胞1ml于冰上超声4次,每次5秒钟,间隔30秒,然后用微量离心机(13,000转/分)4℃离心5分钟,上清用于环化酶活性测定和SDS-PAGE凝胶电泳。
在大肠杆菌BL21(DE3)中紫穗槐二烯合成酶基因-pET11d构建体(图11)的表达,产生一种约50-60kDa的蛋白质,如图13中泳道5-10所示,与从青蒿中分离的测定为56kDa的紫穗槐二烯合成酶(图16)的大小非常一致。
实施例4
通过大肠杆菌中表达的紫穗槐二烯合成酶将FPP转化为紫穗槐二烯。
除超声处理细胞的上清以外,完整的细胞也被用于FPP分析。同前所述进行FPP分析、放射气相色谱分析(GC-RAGA)和气相色谱-质谱分析(GC-MS)。图14和14A分别表示用完整的转化细胞和超声处理的转化细胞的上清进行分析的放射气相色谱的色谱图。两个分析中均生成了紫穗槐二烯。这些分析产物经气相色谱-质谱鉴定,得到的质谱与参照的紫穗槐二烯相同,质量评分为99%(最大评分),质谱图与图6所示相同。用阳性和阴性对照进行的分析中未发现紫穗槐二烯。
实施例5
在转基因烟草中表达紫穗槐-4,11-二烯合成酶
把DNA导入植物细胞有很多方法,适当的方法包括土壤杆菌感染或者直接转移DNA,例如通过PEG介导的原生质体转化(Omirulleh等人,植物分子生物学(Plant Molecular Biology)21,415-428(1993))或电穿孔,以及通过DNA包裹微球加速(例如微球轰击)的显微注射等。
由于已有文献报道根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的倍半萜环化酶基因转化青蒿和烟草(Vergauwe等人,植物细胞报告(Plant Cell Reports)15,929-933(1996);Hohn和Ohlrogge,植物物理学(Plant Physiol)97,460-462(1991)),由土壤杆菌介导转移含有紫穗槐二烯合成酶编码基因的表达单位(盒),似乎是合理的途径。
有几种二元载体系统,适于将组装在表达盒中位于合适的启动子(例如花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子)之后、合适的终止子(例如胭脂碱合成酶转录终止子(nopaline synthasetranscription terminator,nos-tail))上游的紫穗槐二烯合成酶编码基因转移到烟草和/或青蒿中。
与实施例3类似,用PCR引入适合亚克隆的酶切位点,其中有义引物(引物G)为5′-GA GGA TCC ATG TCA CTT ACA GAA-3′(在起始密码子ATG前引入BamHI位点),反义引物(引物H)为5′-ATGGA TCC TCA TAT ACT CAT AGG A-3′(在终止密码子TGA后引入BamHⅠ位点)。PCR产物和植物表达盒pLV399经BamHⅠ酶切、凝胶纯化和连接,得到带有花椰菜花叶病毒35S启动子和胭脂碱合成酶转录终止子的紫穗槐二烯合成酶编码基因。植物表达盒pLV399是一个pUC19载体(Yanisch-Perron C.等人,基因33,103-119(1985)),其多克隆位点(多接头)由在BamHl位点融合了nos-tail(终止子)的CaMV 35S启动子替换,在启动子下游的单一酶切位点有EcoRⅠ,KpnⅠ,XhoⅠ和HindⅢ,在终止子上游的单一酶切位点有EcoRⅠ,XhoⅠ,PstⅠ,SphⅠ,KpnⅠ,HindⅢ。通过PstⅠ和NdeⅠ的限制性酶切分析,检查紫穗槐-4,11-二烯编码基因在pLV399中的方向。用KpnⅠ部分酶切该构建体后,将旁侧为35S启动子和nos终止子的紫穗槐-4,11-二烯编码基因连接进KpnⅠ酶切的二元载体pCGN1548。
为了将该重组二元载体转移进入根瘤土壤杆菌LBA4404(GibcoBRL,Life Technologies),利用了三亲株杂交程序,其中使用携带重组二元载体的大肠杆菌(DH5α)和携带质粒pRK2013的辅助大肠杆菌以将该重组二元载体转移进入根瘤土壤杆菌LBA4404。
利用转化的土壤杆菌菌株转化目标植株的外植体。只有携带抗性标志(卡那霉素抗性,位于二元质粒T-DNA边界序列之间)的转化组织才能在选择性(含卡那霉素)再生培养基中再生(据Rogers SG,Horsch RB,Fraley RT,酶学方法(Methods Enzymol),(1986)118627-640)。
从转化组织中再生的植物表达紫穗槐二烯合成酶基因,结论得至气相色谱-质谱分析证实存在紫穗槐二烯。
实施例6
通过青蒿由紫穗槐二烯转换为青蒿素(DHAA)
采用与Koepp等人(生物化学杂志270,8686-8690(1995))描述的类似分析方法进行分析。将放射性([3H]标记)的紫穗槐二烯供给青蒿叶片。为使紫穗槐二烯渗进青蒿叶片,可将放射性的紫穗槐二烯制成水溶性,例如与环糊精复合。利用转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞(携带克隆的青蒿紫穗槐二烯合成酶基因)进行FPP分析,得到放射性的紫穗槐二烯。分析中产生的物质通过放射性气相色谱鉴定。预期的中间体青蒿素酸(AA)、二氢青蒿素酸(DHAA)及终产物青蒿素都用作参照。
按5∶5∶5∶1的摩尔比制备α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精以及3H部分标记的紫穗槐-4,11-二烯(20uM)的混合物。将青蒿叶片在该混合物中温育。温育120小时后,采用与实施例1中B部分类似的放射气相色谱方法,检测青蒿素酸和二氢青蒿素酸。
实施例7
在转基因青蒿中表达紫穗槐-4,11-二烯合成酶及产生青蒿素
如实施例5所示制备青蒿素转化植株。
为再生青蒿,诱导愈伤组织、发芽、生根的培养基由Murashige和Skoog微量和主要元素组成,其中包括改性的维生素(DuchefaBiochemie,Haarlem,The Netherlands),4%(w/v)蔗糖,0.1mg/L吲哚-3-乙酸(IAA),0.1mg/L 6-苄氨基嘌呤(BAP)以及0.8%(w/v)琼脂(植物琼脂,Duchefa Biochemie,哈勒姆,荷兰)。加琼脂之前用NaOH调节pH至5.7,培养基于1磅高压灭菌20分钟。在该培养基中,转化的外植体再生为完全的再生植株。
发现紫穗槐-4,11-二烯合成酶在再生的植株中过量表达,使产生的青蒿素酸、二氢青蒿素酸以及青蒿素的水平超过未转化植株的天然水平。
实施例8
在酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母中表达紫穗槐-4,11-二烯合成酶基因
将该cDNA亚克隆到诱导型表达载体pYES2(附加体型载体,Invitrogen)以及组成型表达载体(将基因构建体整合到基因组中)pGAPZ A(Invitrogen)中,进行功能性表达。为引入适合亚克隆的酶切位点,用PCR扩增该基因,其中使用有义引物(引物E)为5′-CGA GAATTC ATG TCA CTT ACA G-3′(在起始密码子ATG前引入EcoRⅠ位点),反义引物(引物F)为5′-GGAT CTC GAG TCA TAT ACT CAT-3′(直接在终止密码子TGA后引入BamHⅠ位点)。采用与实施例3类似的方法将PCR产物亚克隆进pYES2和pGAPZ A。
将获得的基因构建体分别经酿酒酵母EasycompTM转化试剂盒(Invitrogen)转化酿酒酵母,经毕赤酵母EasycompTM转化试剂盒(Invitrogen)转化巴斯德毕赤酵母。所有转化都根据制造商的说明书进行,生长、选择和诱导也根据制造商的说明书进行。酵母细胞的收集和超声处理采用与实施例3所述类似的方法进行。
表达紫穗槐-4,11-二烯合成酶基因的酵母细胞,其提取物的FPP分析得到了与实施例4相同的放射气相色谱图和气相色谱-质谱图。