CN104293837B - 一种利用单酶生产多种烯醛类香料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用单酶生产多种烯醛类香料的方法，该方法使用的酶为一种克隆酶，具有脂氧合酶和氢过氧化物裂解酶样双功能，能利用单酶一步完成对亚麻酸、花生四烯酸、DHA、EPA等多不饱和脂肪酸的酶解反应，获得不同碳数的短链天然烯醛类香料化合物。与现有技术相比，该方法反应条件温和易控，反应效率高，无有害物质产生，反应成本低，且能与多种底物反应，获得多种纯天然的香料化合物。
Description
技术领域
本发明涉及烯醛类香料的生产方法，尤其涉及一种利用单酶生产多种烯醛类香料的方法。
背景技术
烯醛类物质是天然香料和芳香剂的重要组成成分，微量存在于许多植物的挥发性物质中，在植物的果实、叶、茎等组织以及海洋藻类中都能够检测到其存在。如：1-辛烯-3-醇，又称松蕈醇，是一种带有强烈愉悦感的土壤香香气、蘑菇香气和甘草香气融合的化合物，自然界中主要存在于薄荷类、百里香以及鲜蘑菇中，属于天然等同香料，在饮料、糖果、冰制食品、烘烤食品、调味品及烟用香精中应用广泛，是香料行业中一种有价值的香料。2-壬烯醛是一种可以赋予一些食物以淡淡的木香香味的食用香料，自然界中主要存在于甜瓜、桃子、葡萄、西红柿、胡萝卜、黄豆、芝麻等植物中，可以加到天然或合成增香的食物中，如肉、咖啡冰淇淋、糖果以及其他饮料中，使食物的香味和香气比天然物还浓厚，广泛用于调配日化香精和食用香精。3-已烯醛具有独特优雅的青香香气，广泛存在于绿色植物的叶和果实中，是赋予植物叶子及果实等新鲜青香香气的组分，目前广泛用于调配香料。
目前这类烯醛类香料主要以天然提取和化学合成为主，其中天然提取主要通过从植物组织或植物精油中提取，但植物组织或植物精油中烯醛类物质含量非常低，不易分离，且相关植物资源少，提取成本高，不能满足市场的需求；而化学合成法也有诸多限制，如：起始原料难于获得、合成路线较长、副产物多、产品的精致和纯化过程程序多、收率低，且带有严重的环境污染，因此许多开发研究工作仅停留在实验阶段，仅有少数国外企业投入生产。
近年来，人们开始尝试通过酶法来合成烯醛类物质，如中国专利CN1563310A公开了一种酶催化生产烯醛类香料的方法，该法以C18～C20多元不饱和脂肪酸为原料，以从天然植物组织中提取的“不饱和脂肪酸氧化酶与过氧化氢物裂解酶”组成的酶系为催化剂，在室温15～25°氧存在的条件下，使多元不饱和脂肪酸专一地酶催化裂解成烯醛类香料。中国专利CN101225406A涉及一种利用番石榴组织中存在的酶合成天然香料的方法，该方法提供一种以亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸等具有顺、顺-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的底物，利用番石榴组织中存在的酶降解底物，合成具有天然风味香料的方法，其中番石榴组织中存在的酶为番石榴果实中存在的脂肪氧化酶和过氧化氢物裂解酶。上述利用酶法合成烯醛类物质的基本原理为：植物体内具有合成挥发性烯醛类芳香化合物的oxylipin酶系催化合成途径，其中脂氧合酶（LOX）以多不饱和脂肪酸为底物形成脂肪酸氢过氧化产物，随后氢过氧化脂肪酸裂解酶（HPL）以脂肪酸氢化氧化物为底物裂解形成不同碳数的烯醛类挥发性物质。与化学合成法相比，酶法合成烯醛类物质效率高，产率高，且合成需要的酶提取于自然植物对环境的污染小，但它也存在如下问题：1、植物脂氧合酶对底物具有专一性，因此一套反应酶系，只能生产主要的一种烯醛类物质，不能同时获得多种烯醛类物质，所以产物单一；
2、反应过程中需要同时控制两种酶体系的反应条件，因此使得生产条件变得复杂难控，不适合大规模生产；
3、从植物中提取的反应酶以C18脂肪酸为反应底物，形成的挥发性物质主要是C6的已烯醛，因此用该酶法不能获得C8等来源于C20脂肪酸的挥发性香料；
4、从植物中提取的反应酶为粗酶液，酶种类多、酶活不稳定，导致产物不稳定，不适合生产化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种通过一步酶反应获得多种烯醛类物质的利用单酶生产多种烯醛类香料的方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种利用单酶生产多种烯醛类香料的方法，其特征在于：以具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸为原料，利用一种同时具有LOX和HPL样功能的克隆酶PhLOX催化产生多种烯醛类香料，其包括以下步骤：
1）在所述克隆酶PhLOX纯化溶液中加入游离的所述原料溶液，混匀形成反应液，该反应液在20℃反应15min-1h；
2）在所述反应液中加入乙酸乙酯，4℃避光震摇萃取1h，收集上层乙酸乙酯相，然后在下层相中再加入等量乙酸乙酯重复抽提一次后收集上层有机相，合并两次收集液；
3）在上述收集液中加入预冷的去离子水，震荡混匀充分，冰浴5min，获得的有机溶剂相，在25℃旋转蒸发浓缩获得多种烯醛类物质。
上述方案中的克隆酶PhLOX的氨基酸序列如SEQID NO.2所述，其cDNA的核苷酸序列如SEQID NO.1所述；该克隆酶PhLOX的源基因来自坛紫菜，克隆过程中首先从坛紫菜中提取总RNA，根据脂氧合酶基因序列设计引物，通过RACE技术扩增出全长cDNA序列，重组到表达载体pET-28a，转化大肠杆菌E.coli BL21，筛选出阳性克隆，通过诱导表达产生表达量为2mg/L菌液的多功能克隆酶PhLOX。
作为优选，上述方案中克隆酶PhLOX溶液的反应浓度为10-30mg/L，所述原料溶液浓度为100-400μM。
进一步，所述原料包括亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳四烯酸（DHA）。
所述烯醛类物质包括C-6，C-7,C-8,C-9,C-10的醛类和醇类物质。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明中使用的克隆酶PhLOX具有多种功能，能通过一步反应催化裂解多不饱和脂肪酸产生具有天然香味的香料物质，反应条件温和易控，反应效率高，无有害物质产生，反应成本低，且能与多种底物反应，获得多种纯天然的香料化合物。
附图说明
图1为实施例2中PhLOX催化亚麻酸的前后变化的LC示意图；
图2为实施例3中PhLOX催化花生四烯酸的前后变化的LC示意图；
图3为实施例4中PhLOX催化二十二碳四烯酸的前后变化的LC示意图；
图4为实施例5中PhLOX催化二十碳五烯酸的前后变化的LC示意图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：克隆酶PhLOX的制备
1、以CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)提取坛紫菜叶状体的基因组DNA，步骤如下：
1)65℃水浴预热2%CTAB抽提液后，分装15mL抽提液到50mL离心管中，加入0.1%的巯基乙醇，混匀待用；
2）取500mg叶状体，于无菌研钵中液氮快速研磨至粉末，后立即转入CTAB抽提液中；
3）震荡均匀后65℃水浴加热60min，期间每10min反复颠倒离心管数次；
4）放入离心机离心，离心条件为：4℃，8000rpm，10min，离心结束后吸上清；
5）在上述上清液中加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液（比例为：25/24/1），颠倒数次，于4℃，10000rpm离心10min；
6）吸上清至新离心管中，重复5）抽提一次；
7）吸上清，加2/3体积异丙醇，轻颠倒混匀，-20℃放置3h沉淀DNA；
8）4℃，10000rpm，离心10min，弃上清；
9）2mL75%酒精漂洗沉淀2次，然后于4℃，10000rpm，离心10min，弃上清；
10）在超净工作台上倒置离心管，至沉淀周围水分晾干，用500μL无菌水溶解DNA，-20℃保存待用。
采用Takara RNAiso Plus kit（Takara，日本），以trizol法提取坛紫菜叶状体的总RNA。采用Takara primescript RT reagent kit（Takara，日本），对提取的坛紫菜叶状体总RNA进行反转录得到坛紫菜叶状体总cDNA。
在NCBI中搜索藻类脂氧合酶LOXs序列信息，采用Primer primer5软件设计可行性引物，进行坛紫菜脂氧合酶核心片段的克隆，其中特异性引物序列为LOX-S1-5'CTCACCCGCAAGGGAGATGG3'
LOX-A1-5'TGGTAGGCCGCCGAGAAGAC3'，扩增353bp片段。分别以坛紫菜叶状体的基因组DNA和cDNA为模板进行PCR扩增，PCR程序见表1。
表1PhLOX核心片段克隆的PCR程序
以脂氧合酶核心片段为模板，分别设计用于3’端和5’端延伸的特异性引物，进行RACE(rapid-amplification of cDNA ends，cDNA末端快速扩增技术)扩增。
3’RACE特异性引物：lox-os：5’GCCCTCCCGTCCACCCACGTT3’
lox-is：5’TGCCCCACTTCGCCGACACC3’；
5’RACE特异性引物：lox-oa：5’CGAGCCCAGAAAGTCCCACCCTT3’
lox-ia：5’GCCGCCGAGAAGACGTCCATCC3’。
表2PhLOX全长扩增的PCR程序
得到RACE产物序列后，采用MEGA5软件进行比对拼接，总长为3288bp，包含一个完整的编码框。于该ORF两端设计一对特异性引物对PhLOX进行验证。
LORF-S：5'GGTCGTCCCATACCACATCG3'
LORF-A：5'TGAAGGAAGCAGCTCGGATC3'。
产物2974bp，扩增程序如表3。
表3PhLOX完整ORF验证的PCR程序
2、PhLOX原核表达的重组体系构建
在PhLOX的ORF(开放阅读框)两端设计一对带NdeΙ/HindΙΙΙ酶切位点的特异性引物：正向引物：5'GGAATTCCATATGATGGGGAATGCG3'
反向引物：5'CCCAAGCTTCTAGATGTCGATGGACAG3'。
以叶状体cDNA为模板，扩增PhLOX完整ORF。克隆的目的片段首先连接到pMD-18T上形成LOX-18T的重组克隆载体，通过转化E.coli DH5α进行测序，以检测目的片段的编码正确性。选择pET-28a为表达载体，将LOX-18T和pET-28a空载体各自用NdeΙ/Hind ΙΙΙ（BioLabs，英国）进行双酶切，37℃孵育2h以上。取5μL酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，待质粒酶切完全后进行割胶回收和定量，将回收的目的片段和表达载体通过T4连接酶（Fermentas，美国）在4℃下过夜连接，以构建重组质粒LOX-28a。重组质粒转化至表达宿主E.coli BL21中，构建重组体系LOX-28a-BL21。通过含50μg/mL卡那霉素（Kana+）的LB固体平板进行阳性克隆筛选，并送测序以确定重组载体的编码正确性。得到的真阳性克隆LOX-28a-BL21保存于含20%甘油的LB+Kana+（50μg/mL）液体培养基中，-70℃下储存保菌。
3、PhLOX蛋白的诱导和纯化
将实施例2中获得的克隆菌株活化、扩培，以0.1mM IPTG诱导表达。诱导条件为20℃，100rpm，14～20h。诱导完成后，以5000rpm，4℃，15min离心收集菌体。去上清培养液，再用10mL细胞裂解液buffer A-ΙΙ（50mM Tris-HCl，pH8.0，200mM NaCl，10%（v/v）glycerol，0.1%tween20）充分重悬菌体。以6500rpm，20s-破碎/2min-冰浴的程序进行菌体破碎匀浆（Bertin technologies Precellys24Dual，法国），循环4次。12000rpm，4℃，10min离心匀浆液，并收集上清。
采用6×His-Tagged Protein Purification Kit（CWBIO，中国）对上清液进行目的蛋白的纯化，并以含10mM、50mM、150mM、500mM咪唑的洗脱液进行梯度洗脱和收集目的蛋白。
实施例2：
在0.5mL25mg/L浓度的由实施例1所得的克隆酶PhLOX蛋白纯化溶液中加入100μM的亚麻酸，混匀后在20℃下孵育15min，获得酶解反应液。
产物提取和检测方法为：在反应液中加1mL乙酸乙酯（色谱纯），4℃避光振摇1h。12000rpm，4℃，离心10min，收集上层乙酸乙酯相，并在下层相中再加入0.5mL乙酸乙酯重复抽提一次后收集上层有机相。然后合并两次收集液，加入1mL预冷的去离子水，震荡混匀充分，冰浴5min，以洗去水溶性杂质。12000rpm，4℃，离心10min，取上层乙酸乙酯相，利用LC-MS分析底物消耗量，如图1所示，发现底物消耗量达到38.7%，其中图1中上面的图谱线表示反应前，下面的图谱线表示反应后，图中的数字表示峰面积；再利用固相微萃取柱吸附烯醛类香料产物，通过GC-MS分析产物种类，所得到的天然香料为2-己烯醛、3-己烯醛和2-庚烯醛。
实施例3：
在5mL25mg/L浓度的由实施例1所得的克隆酶PhLOX蛋白纯化溶液中加入100μM的花生四烯酸，混匀后在20℃孵育1h，获得酶解反应液。
产物提取和检测方法为：在反应液中加10mL乙酸乙酯（色谱纯），4℃避光振摇1h，分离上层乙酸乙酯相，并在下层相中再加入5mL乙酸乙酯重复抽提一次后收集上层有机相。然后合并两次收集液，加入10mL预冷的去离子水，震荡混匀充分，冰浴5min，以洗去水溶性杂质。分离上层乙酸乙酯相，利用LC-MS分析底物消耗量，如图2所示，发现底物消耗量达到100%，其中图2中上面的图谱线表示反应前，下面的图谱线表示反应后，图中的数字表示峰面积利用固相微萃取柱吸附烯醛类香料产物；通过GC-MS分析产物种类，所得到的天然香料为2-壬烯醛、3-壬烯醛、1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮和2-辛烯-1-醇。
实施例4：
在5mL30mg/L浓度的由实施例1所得的克隆酶PhLOX蛋白纯化溶液中加入200μM的DHA，混匀后在20℃下孵育30min，获得酶解反应液。
产物提取和检测方法为：在反应液中加10mL乙酸乙酯（色谱纯），4℃避光振摇1h，分离上层乙酸乙酯相，并在下层相中再加入5mL乙酸乙酯重复抽提一次后收集上层有机相。然后合并两次收集液，加入10mL预冷的去离子水，震荡混匀充分，冰浴5min，以洗去水溶性杂质。分离上层乙酸乙酯相，利用LC-MS分析底物消耗量，如图3所示，发现底物消耗量达到95%，其中图3中上面的图谱线表示反应前，下面的图谱线表示反应后，图中的数字表示峰面积；利用固相微萃取柱吸附烯醛类香料产物，通过GC-MS分析产物种类，所得到的天然香料为3,5-辛烯-2-酮。
实施例5：
在0.5mL10mg/L浓度的由实施例1所得的克隆酶PhLOX蛋白纯化溶液中加入400μM的EPA，混匀后在20℃下孵育15min，获得酶解反应液。
产物提取和检测方法为：在反应液中加1mL乙酸乙酯（色谱纯），4℃避光振摇1h。12000rpm，4℃，离心10min，收集上层乙酸乙酯相，并在下层相中再加入0.5mL乙酸乙酯重复抽提一次后收集上层有机相。然后合并两次收集液，加入1mL预冷的去离子水，震荡混匀充分，冰浴5min，以洗去水溶性杂质。12000rpm，4℃，离心10min，取上层乙酸乙酯相，利用LC-MS分析底物消耗量，如图4所示，发现底物消耗量达到49.0%，其中图4中上面的图谱线表示反应前，下面的图谱线表示反应后，图中的数字表示峰面积；再利用固相微萃取柱吸附烯醛类香料产物，通过GC-MS分析产物种类，所得到的天然香料为2,6-2-烯-壬醛。
Claims (3)
1.一种利用单酶生产多种烯醛类香料的方法，其特征在于：以具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸为原料，利用一种同时具有LOX和HPL样功能的克隆酶催化产生多种烯醛类香料，该原料包括亚麻酸、花生四烯酸、EPA、DHA，该烯醛类香料包括C-6，C-7,C-8,C-9,C-10的醛类和醇类物质，所述克隆酶的氨基酸序列如SEQID NO.2所述，其包括以下步骤：
1)在所述克隆酶纯化溶液中加入游离的所述原料溶液，混匀形成反应液，该反应液在20℃反应15min-1h；
2)在所述反应液中加入乙酸乙酯，4℃避光震摇萃取1h，收集上层乙酸乙酯相，然后在下层相中再加入等量乙酸乙酯重复抽提一次后收集上层有机相，合并两次收集液；
3)在上述收集液中加入预冷的去离子水，震荡混匀充分，冰浴5min，获得的有机溶剂相，在25℃旋转蒸发浓缩获得多种烯醛类物质。
2.根据权利要求1所述的利用单酶生产多种烯醛类香料的方法，其特征在于：所述克隆酶的cDNA的核苷酸序列如SEQID NO.1所述。
3.根据权利要求2所述的利用单酶生产多种烯醛类香料的方法，其特征在于：所述克隆酶溶液的反应浓度为10-30mg/L，所述原料溶液浓度为100-400μM。
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