JP6436417B2

JP6436417B2 - アモルファ−４，１１−ジエン増産方法及び天然ゴム増産方法

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Publication number: JP6436417B2
Application number: JP2014242895A
Authority: JP
Inventors: 山口　晴彦; 山口　　晴彦; ゆき乃井之上; 啓治高木; 伏原　和久; 和久伏原; 俊哉村中; 鈴木　啓子; 啓子鈴木; 佳那子小林
Original assignee: Sumitomo Rubber Industries Ltd; Osaka University NUC
Current assignee: Sumitomo Rubber Industries Ltd; Osaka University NUC
Priority date: 2014-12-01
Filing date: 2014-12-01
Publication date: 2018-12-12
Anticipated expiration: 2034-12-01
Also published as: JP2016103985A; US20160153007A1; US9719110B2

Description

本発明は、アモルファ−４，１１−ジエン増産方法、及び天然ゴム増産方法に関する。

アルテミシニンは、セスキテルペンの１種で抗マラリア活性を有する化合物として注目されている。

イソプレノイド化合物はイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を基本の構成要素として生合成される化合物の総称であり、ＩＰＰはメバロン酸経路（ＭＶＡ経路）と非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路）により生合成される。セスキテルペンであるアルテミシニンは、主に細胞質のＭＶＡ経路由来のＩＰＰから中間代謝物であるファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）を経由し、最終的にアルテミシニンまで生合成されると考えられている。

アルテミシニン代謝経路への反応の第一段階は、アモルファジエン合成酵素（ＡＤＳ）によって、他の化合物の代謝経路と共通の中間代謝産物であるＦＰＰからアモルファ−４，１１−ジエンが生合成される。従って、アモルファ−４，１１−ジエンの生合成量を増加させることは、アルテミシニンの増産に対して非常に有益であり、代謝工学的な手法を用いた改善の余地がある。

一方、現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴム（ポリイソプレノイドの１種）は、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）を栽培し、ラテックス（乳液）を採取することによって得られる。パラゴムノキは、天然ゴム（ポリイソプレノイド）を生合成し、蓄積する乳管細胞を有する。

天然ゴムは、ゴム製品の原料として様々な用途において幅広くかつ大量に使用されるにもかかわらず、パラゴムノキをほぼ唯一の採取源としている。

しかしながら、パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でのみ生育可能な植物である。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、天然ゴム（イソプレノイド）を採取できる期間は２０〜３０年に限られている。

今後、開発途上国を中心に天然ゴムの需要の増大が見込まれており、天然ゴム資源の枯渇が懸念されている。しかし、上述の理由によりこれまでのようなパラゴムノキの植樹による天然ゴムの大幅な増産は困難であり、天然ゴムを増産する新たな方法が望まれている。

ゴム産生植物による天然ゴム製造の効率を向上させるために、例えば、ゴム産生植物の幹にエチレンやｅｔｈｅｐｈｏｎ（２−クロロエチルホスホン酸）を塗布し、乳管から流出してくるラテックスが傷口で凝固することを防ぎ、ラテックスの採取効率を向上させる方法が知られている。また、ジャスモン酸やその前駆体であるリノレン酸等を配合したラノリンをゴム産生植物の幹に塗布することにより、乳管分化を促進し、乳管密度を増大する方法が知られている（非特許文献１）。しかしながら、これらの方法は天然ゴム生成のメカニズムに直接的に作用するものではなく、増産効果は限定的であった。

Ｈａｏ、他、ＡｎｎａｌｓｏｆＢｏｔａｎｙ、２０００年、第８５巻、３７〜４３ページ

本発明は、前記課題を解決し、アモルファ−４，１１−ジエンを増産する方法及び天然ゴムを増産する方法を提供することを目的とする。

天然ゴムの生合成経路は、中間代謝物であるＦＰＰをプライマーとしてイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の重合が繰り返され、最終的に天然ゴムまで生合成されると考えられている。

上述の通り、アルテミシニン代謝経路への反応の第一段階は、アモルファジエン合成酵素（ＡＤＳ）によって、ＦＰＰからアモルファ−４，１１−ジエンが生合成される。

中間代謝物であるＦＰＰは、セステルぺノイドであるアルテミシニン、ポリイソプレノイドである天然ゴム以外にも多くのテルぺノイド（様々なセスキテルペン、ポリイソプレノイド、トリテルペン、ステロール、ファルネシル化蛋白質のファルネシル基）の合成に用いられる（図１参照）。このように、ＦＰＰは、多くのテルぺノイドの生合成の前駆体として機能している。

本発明者らは、ＦＰＰが多くのテルぺノイドの生合成の前駆体として機能しており、ＦＰＰが分岐点となっている点に着目し、目的物質以外の経路に誘導する酵素を阻害することによって、本来は異なるテルぺノイドの生合成に用いられるＦＰＰを、特定の生合成経路に用いられるようにスイッチングすることにより、特定の生合成経路に用いられるＦＰＰ量が増加し、その結果、目的物質の増産が可能であるとの技術思想に想到した。

本発明者らは、更に鋭意検討した結果、アモルファジエン合成酵素をコードする遺伝子をシロイヌナズナに導入し、該シロイヌナズナにおいて、ファルネシル二リン酸を基質とする酵素反応を触媒する酵素の内、アモルファジエン合成酵素以外の少なくとも１種の酵素を阻害することにより、アモルファ−４，１１−ジエンを増産できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、第１の本発明は、アモルファジエン合成酵素をコードする遺伝子が導入されたシロイヌナズナに、酵素阻害剤を付着させる工程を有し、上記酵素阻害剤が、ファルネシル二リン酸を基質とする酵素反応を触媒する酵素の内、アモルファジエン合成酵素以外の少なくとも１種の酵素を阻害するものであるアモルファ−４，１１−ジエン増産方法に関する。

本発明者らは、更に鋭意検討した結果、ゴム産生植物において、ファルネシル二リン酸を基質とする酵素反応を触媒する酵素の内、天然ゴムの合成に関与する酵素以外の少なくとも１種の酵素を阻害することにより、天然ゴムを増産できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、第２の本発明は、ゴム産生植物に、酵素阻害剤を付着させる工程を有し、上記酵素阻害剤が、ファルネシル二リン酸を基質とする酵素反応を触媒する酵素の内、天然ゴムの合成に関与する酵素以外の少なくとも１種の酵素を阻害するものである天然ゴム増産方法に関する。上記ゴム産生植物が、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、グアユール（Ｐａｒｈｅｎｉｕｍａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、及びロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍｋｏｋｓａｇｈｙｚ）からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。

上記酵素阻害剤により阻害される酵素が、スクアレン合成酵素であることが好ましい。

上記酵素阻害剤が、Ｓｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎであることが好ましい。

上記酵素阻害剤が、水又は水溶性媒体に上記酵素阻害剤を溶解させた酵素阻害剤溶液であり、上記酵素阻害剤溶液中の上記酵素阻害剤の濃度が５〜１０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。

第１の本発明のアモルファ−４，１１−ジエン増産方法では、アモルファジエン合成酵素をコードする遺伝子が導入されたシロイヌナズナに、酵素阻害剤を付着させる工程を有し、上記酵素阻害剤が、ファルネシル二リン酸を基質とする酵素反応を触媒する酵素の内、アモルファジエン合成酵素以外の少なくとも１種の酵素を阻害するものであるため、アモルファ−４，１１−ジエンの増産が可能である。

第２の本発明の天然ゴム増産方法では、ゴム産生植物に、酵素阻害剤を付着させる工程を有し、上記酵素阻害剤が、ファルネシル二リン酸を基質とする酵素反応を触媒する酵素の内、天然ゴムの合成に関与する酵素以外の少なくとも１種の酵素を阻害するものであるため、天然ゴムの増産が可能である。

ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を示す模式図である。各Ｓｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎ濃度における植物体の湿重量とアモルファ−４，１１−ジエンの量の一例を示す模式図である。

第１の本発明は、アモルファジエン合成酵素をコードする遺伝子が導入されたシロイヌナズナに、酵素阻害剤を付着させる工程を有し、前記酵素阻害剤が、ファルネシル二リン酸を基質とする酵素反応を触媒する酵素の内、アモルファジエン合成酵素以外の少なくとも１種の酵素を阻害するものであるアモルファ−４，１１−ジエン増産方法に関する。

本明細書において、アモルファジエン合成酵素とは、ファルネシル二リン酸を基質としてアモルファ−４，１１−ジエンを合成する酵素反応を触媒する酵素を意味する。

第２の本発明は、ゴム産生植物に、酵素阻害剤を付着させる工程を有し、前記酵素阻害剤が、ファルネシル二リン酸を基質とする酵素反応を触媒する酵素の内、天然ゴムの合成に関与する酵素以外の少なくとも１種の酵素を阻害するものである天然ゴム増産方法に関する。

本明細書において、天然ゴムは、イソプレン単位（Ｃ_５Ｈ_８）で構成された重合体を意味する。
天然ゴムにおいて、イソプレンユニット中の１，４−シス構造の含有量は、好ましくは１０モル％以上、より好ましくは３０モル％以上、更に好ましくは６０モル％以上、特に好ましくは９０モル％以上、最も好ましくは９８モル％以上である。１，４−シス構造の含有量の上限は特に限定されない。
１，４−シス構造の含有量は、ＮＭＲにより測定することができる。

天然ゴムの重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは１０００以上、より好ましくは１００００以上、更に好ましくは１０００００以上、特に好ましくは１００００００以上である。１０００未満では、ゴムとして利用しにくい傾向がある。また、上記重量平均分子量の上限は、特に限定されない。
天然ゴムのＭｗは、ゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）による測定値をもとに標準ポリスチレン換算等の値により求めることができる。

第１の本発明において、使用される植物は、アモルファジエン合成酵素（ＡＤＳ）をコードする遺伝子が導入されたシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）である。ＡＤＳをコードする遺伝子をシロイヌナズナに導入することにより、該シロイヌナズナにおいて、アモルファ−４，１１−ジエンを好適に合成することが可能となる。

ＡＤＳをコードする遺伝子は、その由来は特に限定されないが、植物由来であることが好ましく、ヨモギ属の植物由来であることがより好ましく、クソニンジン（Ａｒｔｅｍｉｓｉａａｎｎｕａ）由来であることが更に好ましい。

シロイヌナズナに、ＡＤＳをコードする遺伝子を導入する方法としては特に限定されず、公知の方法を使用できる。

第２の本発明において、使用される植物は、ゴム産生植物である。
ゴム産生植物としては、天然ゴムを産生可能な植物であれば特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏｖｉｒｇａｕｒｅａｓｕｂｓｐ．ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏｖｉｒｇａｕｒｅａｓｕｂｓｐ．ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏｖｉｒｇａｕｒｅａｓｕｂｓｐ．ｌｅｉｐｃａｒｐａｆ．ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏｖｉｒｇａｕｒｅａｓｕｂｓｐ．ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（ＳｏｌｉｄａｇｏｇｉｇａｎｔｅａＡｉｔ．ｖａｒ．ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａＦｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（ＴａｒａｘａｃｕｍｖｅｎｕｓｔｕｍＨ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（ＴａｒａｘａｃｕｍｈｏｎｄｏｅｎｓｅＮａｋａｉ）、カントウタンポポ（ＴａｒａｘａｃｕｍｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍＤａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（ＴａｒａｘａｃｕｍｏｆｆｉｃｉｎａｌｅＷｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍｋｏｋｓａｇｈｙｚ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（ＦｉｃｕｓｐｕｍｉｌａＬ．）、イヌビワ（ＦｉｃｕｓｅｒｅｃｔａＴｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（ＦｉｃｕｓａｍｐｅｌａｓＢｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（ＦｉｃｕｓｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓＭｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（ＦｉｃｕｓｉｒｉｓａｎａＥｌｍ．）、ガジュマル（ＦｉｃｕｓｍｉｃｒｏｃａｒｐａＬ．ｆ．）、オオバイヌビワ（ＦｉｃｕｓｓｅｐｔｉｃａＢｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；レタス（Ｌａｃｔｕｃａｓｅｒｒｉｏｌａ）、ベンガルボダイジュ等が挙げられる。なかでも、Ｈｅｖｅａ属、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ属、及びＴａｒａｘａｃｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物であることが好ましく、パラゴムノキ、グアユール、及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましい。

第１の本発明において、酵素阻害剤により阻害される酵素は、ファルネシル二リン酸を基質とする酵素反応を触媒する酵素の内、アモルファジエン合成酵素以外の酵素であれば特に限定されず、例えば、スクアレン合成酵素（ＳＱＳ）等が挙げられる。

第１の本発明において使用可能な酵素阻害剤は、ファルネシル二リン酸を基質とする酵素反応を触媒する酵素の内、アモルファジエン合成酵素以外の少なくとも１種の酵素を阻害するものであれば特に限定されず、具体的には、上記で例示した酵素を阻害できるものであれば特に限定されず、例えば、Ｓｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎ等が挙げられる。なかでも、アモルファ−４，１１−ジエンの増産効果が高いという理由から、スクアレン合成酵素を阻害可能な酵素阻害剤が好ましい。スクアレン合成酵素を阻害可能な酵素阻害剤としては、上述の阻害剤のうち、Ｓｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎが該当する。なかでも、アモルファ−４，１１−ジエンの増産効果が高いという理由から、Ｓｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎが好ましい。

第２の本発明において、酵素阻害剤により阻害される酵素は、ファルネシル二リン酸を基質とする酵素反応を触媒する酵素の内、天然ゴムの合成に関与する酵素以外の酵素であれば特に限定されず、例えば、スクアレン合成酵素（ＳＱＳ）等が挙げられる。

第２の本発明において使用可能な酵素阻害剤は、ファルネシル二リン酸を基質とする酵素反応を触媒する酵素の内、天然ゴムの合成に関与する酵素以外の少なくとも１種の酵素を阻害するものであれば特に限定されず、具体的には、上記で例示した酵素を阻害できるものであれば特に限定されず、例えば、Ｓｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎ等が挙げられる。なかでも、天然ゴムの増産効果が高いという理由から、スクアレン合成酵素を阻害可能な酵素阻害剤が好ましい。スクアレン合成酵素を阻害可能な酵素阻害剤としては、上述の阻害剤のうち、Ｓｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎが該当する。なかでも、天然ゴムの増産効果が高いという理由から、Ｓｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎが好ましい。

スクアレン合成酵素を阻害した場合に、すなわち、スクアレン合成酵素を阻害可能な酵素阻害剤を使用した場合に、アモルファ−４，１１−ジエンや天然ゴムの増産効果が高い理由は、以下のように推測される。上記で例示した酵素を阻害することにより、目的物質の生合成経路に流れるＦＰＰの量を増加させることができるが、更に、スクアレン合成酵素を阻害した場合には、当該効果に加えて、植物が持つフィードバック制御により、ＩＰＰ供給経路であるＭＶＡ経路の律速段階である３−ヒドロキシー３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）の活性を増加させることでモノマーであるＩＰＰの生合成量が増えるため、その結果、ＦＰＰの生合成量も増加し、これらの効果が相乗的に作用して、アモルファ−４，１１−ジエンや天然ゴムの増産効果が顕著であると推測される。

第１の本発明、第２の本発明において、酵素阻害剤は、水又は水溶性媒体に酵素阻害剤を溶解させた酵素阻害剤溶液であることが好ましい。これにより、容易に植物に酵素阻害剤を付着させることができると共に、酵素阻害剤を植物に対して効果的に作用させることができる。

水溶性媒体としては、特に限定されないが、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。

酵素阻害剤を溶解させる溶媒としては、植物への影響が少ないという点で水であることが望ましい。ただし、酵素阻害剤が難水溶性である場合は、エタノールやジメチルスルホキシドのような溶媒を用いてもよい。

植物に付着させる酵素阻害剤の濃度（酵素阻害剤溶液中の酵素阻害剤の濃度）としては、３〜１０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、５〜１０μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。この様に設定することで、アモルファ−４，１１−ジエンや天然ゴムを増産できると共に、酵素阻害剤による植物の生育への悪影響を低減できる。３μｍｏｌ／Ｌ（好ましくは５μｍｏｌ／Ｌ）未満であると、生育阻害は起こりにくいものの、アモルファ−４，１１−ジエンや天然ゴムの増産効果が充分に得られないおそれがある。一方、１０μｍｏｌ／Ｌを超えると、アモルファ−４，１１−ジエンや天然ゴムの増産効果は高いものの、植物に対する生育阻害が著しく大きくなるおそれがある。

特に、酵素阻害剤としてＳｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎを使用し、酵素阻害剤の濃度を５〜１０μｍｏｌ／Ｌとすることにより、植物に対する生育阻害を最小限に抑制でき、アモルファ−４，１１−ジエンや天然ゴムの増産効果を好適に得ることができる。

第１の本発明、第２の本発明において、上記植物に酵素阻害剤を付着させる方法としては、上記植物と酵素阻害剤が接触するように上記植物に酵素阻害剤が付着すれば特に限定されず、例えば、上記植物に酵素阻害剤を塗布する方法、上記植物に酵素阻害剤を噴霧する方法等が挙げられる。具体的には、例えば、上記植物に酵素阻害剤溶液を、刷毛等を用いて塗布又はスプレーなどを用いて噴霧すればよい。
また、上記以外の方法としては、例えば、酵素阻害剤を含む培地で上記植物を培養する方法等が挙げられる。
なお、上記植物として、上記植物の細胞を使用してもよい。

酵素阻害剤を付着させる部位としては、特に限定されないが、例えば、上記植物の幹、茎、根、葉、葉柄、芽、花弁、子葉、胚軸、葯等が挙げられる。なかでも、本発明の効果がより好適に得られるという理由から、幹、茎、根が好ましく、幹、茎がより好ましい。幹、茎には、ゴムを産生する乳管組織が多いため、好適にゴムの増産効果が得られる。

まず、上記植物に酵素阻害剤を塗布又は噴霧する場合について説明する。

植物に付着させる酵素阻害剤の植物あたりの量は、特に限定されず、植物体の重量等に合わせて適宜調整すればよい。
また、植物に付着させる酵素阻害剤の濃度としては、上述のとおりである。

ゴム産生植物が樹木植物（木本植物）である場合、酵素阻害剤のゴム産生植物への付着工程の前に、ゴム産生植物のコルク層を剥離し、剥離した部分に酵素阻害剤を付着させることが好ましい。ゴム産生植物の表面は堅いコルク層で覆われているため、コルク層を剥離して、コルク層の内側にある組織に酵素阻害剤が到達しやすくすることにより、増産効果を高めることができる。

コルク層とは、ゴム産生植物の外樹皮に位置し、乳管細胞および乳管細胞形成組織よりも外側に存在する層をいう。剥離される幹又は茎の一部分としては、該部分に酵素阻害剤を付着させることにより増産効果が得られる部分であれば特に限定されるものではないが、タッピングによりラテックスを回収する部分の近傍部分であることが好ましい。また、剥離する部分の厚さは、乳管細胞および乳管細胞形成組織を傷つけずにコルク層を剥離する厚さであれば、特に限定されるものではないが、例えば、０．１〜１０ｍｍ、好ましくは０．５〜８ｍｍ、更に好ましくは、３〜６ｍｍであることが好ましい。

コルク層を剥離する方法は、特に限定されるものではなく、樹皮等の剥離に通常用いられる方法を用いて行うことができる。例えば、ナイフ等を用いて幹又は茎の一部分に傷をつけてコルク層を剥離する方法が挙げられる。また、剥離を行う時期、剥離を行う部分の数は、増産効果が得られれば特に限定されるものではなく、酵素阻害剤の有効成分の種類や濃度、付着方法、植物の樹齢や種類等を考慮して適宜決定することができる。

なお、ゴム産生植物が草本植物である場合、コルク層が存在しないため、付着部位（例えば、茎）に直接酵素阻害剤を付着させればよい。

植物への酵素阻害剤の付着時期は、特に限定されないが、植物に対する生育阻害を低減するという点で、植物の生育中、常に付着させるのではなく、目的物質を採取する数日前に付着を開始することが望ましい。付着開始日は特に限定されないが、付着から効果が得られるまである程度の時間が必要であると考えられるという理由から、好ましくは目的物質採取の３日前、より好ましくは５日前、更に好ましくは１週間前から付着し始めるのが良い。

アモルファ−４，１１−ジエンや天然ゴムは、ゴム産生植物が樹木植物である場合は、ナイフ等を用いて溝状に傷をつけて（タッピング）、切断された乳管からの流出物として回収できる。ゴム産生植物が草本植物である場合は、茎や根に傷をつけて（タッピング）、切断された乳管からの流出物として回収したり、植物を凍結乾燥した後、乳鉢で粉砕したものから有機溶媒を用いて回収することができる。

次に、酵素阻害剤を含む培地で上記植物を培養する場合について説明する。

培養条件は、上記植物がアモルファ−４，１１−ジエンや天然ゴムを製造できる条件であれば特に限定されない。使用される培地としては、植物や植物細胞の培養に通常使用される培地であればよい。具体的には、Ｗｈｉｔｅの培地、Ｈｅｌｌｅｒの培地、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地、ＭＢ培地、ＷＰ培地（ＷｏｏｄｙＰｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地が挙げられる。こららの培地に酵素阻害剤を添加すればよい。なお、植物に好適に酵素阻害剤を付着させることができるため、培地は液体であることが好ましい。

培地中の酵素阻害剤の濃度は、上述の植物に付着させる酵素阻害剤の濃度と同様である。これにより、アモルファ−４，１１−ジエンや天然ゴムを増産できると共に、酵素阻害剤による植物の生育への悪影響を低減できる。

培養温度は、植物や植物細胞の種類によって異なるが、０〜５０℃であることが好ましく、１０〜４０℃であることがより好ましく、２０〜３５℃であることが更に好ましい。ｐＨは、ｐＨ３〜１１であることが好ましく、４〜１０であることがより好ましく、５〜９であることが更に好ましい。

培養は、バッチ式培養でも可能であり、また、バイオリアクターを用いた連続式培養でも可能である。具体的な培養方法として、振とう培養、回転培養などが挙げられる。アモルファ−４，１１−ジエンや天然ゴムは、細胞内に蓄積させることができ、また、培養上清中に生成蓄積させることもできる。

培養後の植物や植物細胞からアモルファ−４，１１−ジエンや天然ゴムを取得する場合、遠心分離等により植物や植物細胞を回収した後、植物や植物細胞を破砕し、破砕液からｎ−ヘキサン等の溶剤を使用して抽出することができる。また、溶剤抽出法に、クロマトグラフィー等公知の精製方法を適宜併用することもできる。

培養上清からアモルファ−４，１１−ジエンや天然ゴムを取得するには、遠心分離等にて植物や植物細胞を除去した後、得られた上清から、ｎ−ヘキサン等の溶剤にて抽出すればよい。また、溶剤抽出法に、クロマトグラフィー等公知の精製方法を適宜併用することもできる。

以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
アモルファジエン合成酵素（ＡＤＳ）をコードする遺伝子が導入されたシロイヌナズナとして、３５Ｓ：ＡＤＳＡ．ｔｈａｌｉａｎａを用いて、該シロイヌナズナに、酵素阻害剤であるＳｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎ（スクアレン合成酵素阻害剤）を付着させることにより、アモルファ−４，１１−ジエンの増産効果があることを確認するために、以下の実験を行った。
３５Ｓ：ＡＤＳＡ．ｔｈａｌｉａｎａは、Ａｒｔｅｍｉｓｉａａｎｎｕａ由来のＡＤＳをコードする遺伝子が過剰発現されたシロイヌナズナであり、４３３７−５ラインとして、大阪大学大学院工学研究科生命先端工学専攻細胞工学領域にて適切に管理されている。

３５Ｓ：ＡＤＳＡ．ｔｈａｌｉａｎａの種子を滅菌するため、種子を種子滅菌水（０．２５％次亜塩素酸ナトリウム溶液、１％ＳＤＳ）中に２０分間浸した後、滅菌水で４回洗浄した。

種子をｐＨ５．８に調整したＭＳ寒天培地（ＭＵＲＡＳＨＩＧＥ＆ＳＫＯＯＧＭＥＤＩＵＭＩｎｃｌｕｄｉｎｇＶｉｔａｍｉｎｓ４．４ｇ／Ｌ、Ｓｕｃｒｏｓｅ１０ｇ／Ｌ、Ａｇａｒ１０ｇ／Ｌ）に播種した。

播種後、２日間以上４℃で春化処理を行った後、２３℃で、長日条件（明条件１６時間／暗条件８時間）で７日間培養した。

得られたシロイヌナズナの芽生えをＳｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎ（ＳＱＳ阻害剤）を添加したＭＳ液体培地（Ｓｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎ濃度：０，１，３，５，１０，１５μｍｏｌ／Ｌ）に移し、２３℃で、長日条件（明条件１６時間／暗条件８時間）で７日間更に振盪培養した。

７日間の振盪培養後、生育したシロイヌナズナの湿重量を測定し、生育阻害の影響を比較した。

シロイヌナズナからのアモルファ−４，１１−ジエンの抽出は、以下の手順で行った。シロイヌナズナ植物体約１００ｍｇ（湿重量）を乳鉢に入れ、ｎ−ヘキサンを５ｍＬ程度添加した。内部標準として、ｎ−テトラデカン溶液１００μＬを加え、磨砕抽出を行った。抽出液を一度回収し、再度新しいｎ−ヘキサン５ｍＬを加え、磨砕抽出を行った。２回目の抽出液は１回目の抽出液と合わせた。この操作を２回繰り返した後、抽出液を無水硫酸ナトリウムのカラムに通した。

カラムからの溶出液をロータリーエバポレーターで１ｍＬ程度になるまで減圧濃縮を行った後、窒素吹き付け式試験管濃縮装置で乾固させた。

最後に乾固物にｎ−ヘキサン１ｍＬを加え、ＧＣ−ＭＳ用測定資料とした。

ＧＣ−ＭＳ分析はＪＭＳ−ＳＵＮ２００質量分析装置（ＪＥＯＬ）およびガスクロマトグラフ（６８９０ＳｅｒｉｅｓＧＣＳｙｓｔｅｍ：ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。

ガスクロマトグラフはガードカラムとして不活性化シリカキャピラリーチューブ（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅｓ）、キャピラリーカラムとしてＨＰ−５ＭＳ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪ＆Ｗ）を用いて行った。

各Ｓｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎ濃度における植物体の湿重量とアモルファ−４，１１−ジエンの量を図２に示す。

図２より、３μｍｏｌ／Ｌ以上のＳｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎで処理することにより、シロイヌナズナ内部のアモルファ−４，１１−ジエン量が増加することが分かった。一方、植物体の湿重量を見ると１０μｍｏｌ／Ｌを超えた濃度で処理すると、成長阻害が著しいことがわかった。

（比較例）
スクアレン合成酵素（ＳＱＳ）ではなく、その一つ下流のスクアレンエポキシダーゼ（ＳＱＥ）を阻害した場合のアモルファ−４，１−ジエン増産効果を評価した。

上記実施例１と同様にして得られたシロイヌナズナの芽生えをＴｅｒｂｉｎａｆｉｎｅ（ＳＱＥ阻害剤）を添加したＭＳ液体培地（Ｔｅｒｂｉｎａｆｉｎｅ濃度：０，１，３，５μｍｏｌ／Ｌ）に移した点以外は実施例１と同様に行った。

Ｔｅｒｂｉｎａｆｉｎｅで処理した結果、シロイヌナズナ中へのアモルファ−４，１１−ジエンの増産はほとんど見られなかった。５μｍｏｌ／Ｌで処理した際に、０．００４μｇｇＦＷ^−１（同濃度のＳｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎで処理した場合の１／１０以下）程度の蓄積しか確認されなかった。

（実施例２）
ゴム産生植物であるロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍｋｏｋｓａｇｈｙｚ）に、酵素阻害剤であるＳｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎ（スクアレン合成酵素阻害剤）を付着させることにより、天然ゴムの増産効果があることを確認するために、以下の実験を行った。

ロシアンタンポポ種子を２日間以上４℃で春化処理を行った後、土植えした。

土植え後、２５℃で、明条件１２時間、暗条件１２時間の条件下で５カ月栽培した。

得られたロシアンタンポポ植物体２個体に、Ｓｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎを０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に１０μｍｏｌ／Ｌの濃度で溶解したＳｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎ溶液を４日間、１日１回５０ｍＬずつスプレーを用いて噴霧した。

比較例として、同じくロシアンタンポポ２個体に、Ｓｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎを溶かしていない０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を４日間、１日１回５０ｍＬずつスプレーを用いて噴霧した。

処理開始５日目にロシアンタンポポの根からラテックスを採取し、エタノールに５時間浸漬し、天然ゴムを固化させた。

固化させた天然ゴムは３日間室温で乾燥させたのち、乾燥重量を測定し、比較した。

Ｓｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎで処理したことにより、Ｓｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎで処理しない場合に比べて、ロシアンタンポポから採取された天然ゴム量が２．５倍増加することが分かった（表１参照）。なお、表１の結果は、２個体で実施した結果の平均値を示す。

実施例２で得られたゴムの重量平均分子量（Ｍｗ、ポリスチレン換算）を、下記（１）〜（７）の条件で、ゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により測定した。Ｍｗは、約２４７万であった（表１参照）。これは、Ｓｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎで処理しない場合（Ｍｗ：約２４４万）に比べて分子量は変化なく、酵素阻害剤の効果は収量のみに効いていると考えられる。
（１）装置：東ソー社製ＨＬＣ−８０２０
（２）分離カラム：東ソー社製ＧＭＨ−ＸＬ
（３）測定温度：４０℃
（４）キャリア：テトラヒドロフラン
（５）流量：０．６ｍＬ／分
（６）検出器：示差屈折、ＵＶ（２１５ｎｍ）
（７）分子量標準：標準ポリイソプレン、標準ポリスチレン

Claims

アモルファジエン合成酵素をコードする遺伝子が導入されたシロイヌナズナに、酵素阻害剤を付着させる工程を有し、
前記酵素阻害剤が、スクアレン合成酵素を阻害するものであるアモルファ−４，１１−ジエン増産方法。
前記酵素阻害剤が、Ｓｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎである請求項１記載のアモルファ−４，１１−ジエン増産方法。
前記酵素阻害剤が、水又は水溶性媒体に前記酵素阻害剤を溶解させた酵素阻害剤溶液であり、
前記酵素阻害剤溶液中の前記酵素阻害剤の濃度が５〜１０μｍｏｌ／Ｌである請求項１又は２に記載のアモルファ−４，１１−ジエン増産方法。
ゴム産生植物に、酵素阻害剤を付着させる工程を有し、
前記酵素阻害剤が、スクアレン合成酵素を阻害するものである天然ゴム増産方法。
前記酵素阻害剤が、Ｓｑｕａｌｅｓｔａｔｉｎである請求項４記載の天然ゴム増産方法。
前記酵素阻害剤が、水又は水溶性媒体に前記酵素阻害剤を溶解させた酵素阻害剤溶液であり、
前記酵素阻害剤溶液中の前記酵素阻害剤の濃度が５〜１０μｍｏｌ／Ｌである請求項４又は５に記載の天然ゴム増産方法。
前記ゴム産生植物が、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、及びロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍｋｏｋｓａｇｈｙｚ）からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の天然ゴム増産方法。