JP5135215B2 - モノテルペン及び/又はセスキテルペンを蓄積する形質転換植物 - Google Patents
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Description
本発明は、形質転換植物に関する。特に、モノテルペン及び/又はセスキテルペンを蓄積する形質転換植物。前記植物は形質転換されて、HMG−CoA還元酵素(HMGR)及びテルペンシンターゼ(TS)、及び、場合により、プレニルトランスフェラーゼ(PRT)をコードする付加的な遺伝子を、過剰発現するか又は含んでなる。本発明はさらに、前記植物を製造する方法、植物中の特定のテルペンの含量を改変する方法、テルペンを生産する方法及び形質転換植物を生産するための前記の遺伝子の使用に関する。
テルペン及びテルペノイドは、たいていの生物中に見出される。それらの常に増大している重要な商業的価値は、異なるテルペンにより包含される生理活性(bioactivities)及び官能性の多岐にわたる範囲に結び付いている。それに応じて、多くのビタミン、ホルモン、昆虫忌避剤、医薬、フレーバー及びフレグランスは、この極めて多くの部類の化合物の中で見出されており、これら全てが、イソプレン単位と呼ばれる5個の炭素の単位から出発して製造される。
注目に値することに、本発明者らは、テルペンシンターゼ(TS)及びレギュレーションされていない形のHMG−CoA還元酵素(HMGR)を発現するように生物を形質転換するのに成功し、かつTSにより合成される高収率のテルペンを得た。意外なことに、TSをコードする異種の遺伝子単独で形質転換された植物中で、テルペン蓄積は、検出可能であったが、しかし僅かであり、かつTSタンパク質発現レベルと相互に関係していなかった。本発明の重要な利点は、所望のいずれかのテルペンが、選択されたテルペンのシンターゼをコードするヌクレオチド配列が知られているか又は定型的に単離されることができる場合に、いずれかの植物中で蓄積されることができることである。これは、好ましくは植物のサイトゾルへ、HMGR及びテルペンを合成することのできる酵素、すなわちTSである少なくとも2つの遺伝子産物をターゲティングすることにより可能である。
図中で、
図1A、1B、1C及び1Dは、部分A及びB中で、対照タバコ系統(部分B)、及びHMG−CoA還元酵素(HMGR)及びセスキテルペン(パチュロール)シンターゼ(PTS)をコードする導入遺伝子の双方で形質転換されたもの、部分A、のGC−MS分析を示す。クロマトグラムA中のピーク10は、部分C中でMSにより分析され、かつ基準パチュロール(D)との比較によりパチュロールと同定されることができた。ピーク3を内標準(3−α−セドレン)として使用した。
本発明は、HMG−CoA還元酵素(HMGR)をコードする導入遺伝子及びテルペンシンターゼ(TS)をコードする導入遺伝子を発現する植物を提供する。
次の例は、本発明を説明するためのものであり、結果として範囲を限定するものではない。実施例の方法及びプロトコルは、特定の材料又はキットの製造者により供給される標準プロトコルに従って、又はSambrook他(1989)及びAusubel他(1987)により定義された次の十分確立されたプロトコルにより一般的に実施される。
以下14−8と呼ぶ、切断されたハムスターヒドロキシメチル−グルタリル−CoA還元酵素遺伝子を含有するタバコ(Nicotiana tobacum)‘Xanthi’系統のホモ接合系統、及び以下14−2と呼ぶ、導入遺伝子の欠いているF2分離同胞系統を、Chappell他(1995)により及び米国特許(US)第5306862号明細書、米国特許(US)第5349126号明細書、米国特許(US)第5365017号明細書に記載された通りに発生させた。簡単に言えば、最初にChin他(1984)により特性決定されたハムスター遺伝子を、ヌクレオチド28〜1023を除去することにより改変して、δ−227 HMGRと呼ばれる遺伝子の切断された形を生産した。切断されたHMGR cDNAのBamH1/Sst1フラグメントを単離し、中間体プラスミドベクターであるpKYLX 61中へ挿入し、その構成体のEcoR1/Cla1フラグメントを、その後にpKYLX71の相応する部位中へ挿入して、pKYLX71−切断されたHMGR遺伝子構成体を生産した。Ti−プラスミド系列pKYLX61及び71を、Schardl他(1987)により発生させた。
ハイグロマイシン選択マーカー(Hajdukiewicz他, 1994)を、形質転換植物のための選択マーカーを作り出すために選んだ。新しいベクターを、Hartley他(2000)により記載された通り、適切な組換えクローニング部位を用いて遺伝子操作した。
pBI101ベクター(Invitrogen、カールズバッド、CA)を制限酵素Sph1及びSst1で消化し、プラスミドベクターに相応するDNAフラグメント(RB境界配列及びNPTII遺伝子カセットを含まない)を、アガロースゲル精製により単離した(Sambrook他, 1989)、図8中(1)。並行して、ccdb遺伝子及びクロロアムフェニカル(chloroamphenical)耐性遺伝子を含むattp組換えカセットを、pDON221ベクター(Invitrogen、カールズバッド、CA)から、プライマーAttp1−SstI−FW及びAttp2−SphI−RVで標準PCR条件を用いて増幅させた(2)。PCR増幅したDNAフラグメントをSph1/Sst1酵素で制限し、ゲル精製し、前記の類似して消化したpBI101ベクターの相応する部位中へ連結して、中間体pBattpベクターが生じた(3)。
2つの異なるattBヘルパーベクターを、図9及び10に与えられたプロトコルに従って構成した。pBDONベクター中への、一方は単一遺伝子挿入(pTMON、図6A)について及び他方は2つのターゲット遺伝子挿入(pTDUAL、図6B)。
pTMONベクターを、改変されたpBI101ベクターから、Nde1制限部位及びプライマーCSMV−ATTB1−SGFI−FD中へ埋め込まれたattB1配列を含有する前方のPCRプライマー、及びEcoR1部位を含有するリバースプライマーCSMV−ECORI−RVで、カッサバモザイクウイルス(Pcv)プロモーターを最初に増幅することにより構成した(11)。PCRフラグメントを、pGem−Teasyベクター(Promega、マディソン、WI)中へT/Aクローニングし(12)、ついでNde1/EcoR1消化産物として再単離した。単離された消化産物(13)を、pECVSベクター、任意のプレースホルダー遺伝子、"遺伝子1"、NCBI受入れ番号CQ813508)を保有するpET28a誘導体の相応する制限部位中へ連結して、pEPCVSを生産した(14)。
pTDUALベクターを多段階プロセスで構成した(図10、部分1及び2)。最初に、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター(Pca)(Benfy他, 1990)を、pBI121ベクター(Invitrogen)から、プライマーPCaMV−XbaI−FW及びPCaMV−SpeI−RVを用いて増幅させ、pT7Blueベクター中へT/Aクローニングした(18)。プロモーター要素をその後に、このベクターからXba1及びSpe1での消化により放出した(19)。並行して、任意のプレースホルダー遺伝子("遺伝子2")を、エリシター処理された細胞培養物(PCT/US06/02265)から得られたヒオシアムス ムチクス(Hyoscyamus muticus) cDNAライブラリーから、プライマー7120D−SpeI−FW及び7120D−KpnI−RVで増幅させ、Spe1/Kpn1での消化及びpT7Blueベクターの相応する部位中へのライゲーションが続き、pTHPOが生じる(20)。pTHPOをついでXba1/Spe1で消化し、類似してpTPCaから放出されたCaMVプロモーターフラグメントを一緒に連結して、pTPHPOを得た(21)。
PTS及びPTS+FPS発現ベクターの生産は、pTMON、pTDUAL及びpBDONベクターと関連している適切な組換えクローニング部位によって大いに促進された。PTS(国際公開(WO)第2004/031376号パンフレット)又はFPS遺伝子(Tarshis他, 1994)を、それぞれ、プライマーペアPTS−AscF及びPTS−XhoR、又はFPP−SpeFW及びFPP−KpnRVで増幅させ、Asc1/Xho1又はSpe1/Kpn1のいずれかで消化し、ついで、pTMON又はpTDUALベクターの相応する部位中へ連結した。FPS−PTS遺伝子融合を、FPS遺伝子をプライマーFPS−AscF及びFPS−AscRで増幅し、生じたPCRフラグメントをAsc1で消化し、このフラグメントをpTMON及びpTDUALベクター中のPTS遺伝子に対して5′に見出される相応するAsc1部位中へ連結することによって生成させた。生じたプラスミドを、ついで、相応するPTS、PTS+FPS及びFPS−PTS遺伝子カセットを標準組換えクローニング(Hartley他, 2000)によりpBDONベクター中へ起動するために使用して、Ti−プラスミドベクターのファミリーを生じさせた(図7)。図7に示された一番目のカセットに相応するHisタグを有し、PTSをコードする遺伝子を含んでなるプラスミドpBDONベクターを寄託番号ATCC PTA−6707で寄託した。
個々のpBDONベクター構成体(図5、7)を、電気穿孔法によるアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)系統GV3850(Mersereau他, 1990)及びカナマイシン耐性について選択された形質転換体中へ形質転換した。選択されたコロニーを、限定されたDNA配列決定法により導入遺伝子構成体について検証し、その後に、カナマイシン100mg/Lを含有するLB培地50mL中で成長させた。0.6〜0.8に等しいOD600を有する一晩の培養物を、遠心分離により濃縮し、新鮮なLB培地30mL(抗生物質を有しない)中に再懸濁させ、前に記載された通り葉外植片の接種のために使用した(Chappell他, 1995; Horsch他, 1985)。簡単に言えば、無菌条件下で成長した植物からの葉を、アグロバクテリウム(Agrobacterium)培養物中へ入れ、約1cmセグメントに切断し、葉セグメントを非選択的培地プレート上にプレーティングした(Murashige及びSkoog, 1962)。3日後、葉外植片を、ハイグロマイシン15μg/mL(Invitrogen、カールズバッド、CA)及びセホタキシム500μg/mL(Bioworld、ダブリン、OH)を含有する培地プレートに及びその後に一週間同じ選択培地に、カルス及び再生産された植物シュートが明らかになるまで、移した。サイズが1〜3cmのシュートを、ついで、根発生を刺激するためにT−培地(Murashige及びSkoog、1962)(同じ抗生物質を含有する)へ移した。一度根系が定着されれば、小さな植物を商業的に入手可能な鉢植え用土に移し、温室中で繁殖させた。
例6において得られた形質転換植物の葉材料から抽出されたセスキテルペンを、同定し、GC−MS分析により定量した。200〜500mgの冷凍した葉試料を、液体窒素中で粉砕し、ついで、外標準としてα−セドレン200ngを含有するヘキサン:酢酸エチル混合物3mL(v/v 85:15)で抽出した。抽出物を、酢酸エチル:ヘキサンの同じ85:15混合物で溶離されるシリカカラム上に試料を流すことにより部分的に精製した。溶離液を、アリコート1μLをGC−MSにより分析する前に、窒素流下に、30μL濃縮した(Takahashi S, 2005)。試料を、Restec Rtx-5キャピラリーカラム(30m×0.32mm、相厚さ0.25μm)を備えたTrace GC-MS(ThermoFinnigan、サマセット、NJ)上へ注入し、スプリットレスモードで250℃のインジェクタ温度で及び70℃の初期オーブン温度で1min、引き続き1minあたり4℃勾配で230℃まで操作した。マススペクトルを、35から300までの原子質量単位にわたり、70eVで記録し、検証のためにライブラリー標準(NISTライブラリー)及び基準の標準と比較した。
14−8系統を有する形質転換植物を得るのが困難であるために、古典的なメンデル交雑を、PTS単独で(PTS)、FPPシンターゼを有するPTS(PTS+FPS)を、又はHMGRと共にFPPシンターゼを有する融合タンパク質(FPS−PTS)として、過剰発現する植物系統を生産するために使用した。PTS、PTS+FPS又はFPS−PTSのいずれかを発現させるために遺伝子操作したトランスジェニック植物系統を、ハイグロマイシン(15mg/L)の存在で初めに発芽させ、抗生物質耐性植物(所望の構成体を含んでなる)のみを成長させた(親系統P1)。親系統P2は、切断されたHMGR遺伝子(14−8)についてホモ接合であり(Chappell他、1995)、選択せずに発芽させ、かつ成長させた。相反交雑(2つの親系統の間での花粉交換)によりF1後代種が生じ、これらを、カナマイシン(50mg/L)及びハイグロマイシン(15mg/L)の存在で発芽させ、生じた耐性植物を例7で前記の通りパチュロール蓄積について評価した。これらの二重耐性植物は、図12(部分A)中に説明される通り、切断されたHMGRをコードする一番目の構成体及びPTS、FPS+PTS又はFPS−PTSのいずれかをコードする二番目の構成体の二重挿入を有する。
各系統の全RNAを、Trizol試薬を用いて製造者(Invitrogen Life Technologies、カールズバッド、CA)に従い若葉500mgから単離した。ファーストストランドcDNAを、反応緩衝液中の全RNA5μg、オリゴdT12−16プライマー200ng及び逆転写酵素(Superscript II、Invitrogen Life Technologies)を有する20μL反応及び製造者により推奨された通りの条件中で合成した。RNase H 1μLをその後に、cDNA調製物に添加し、37℃で1時間定温保持して、相補的RNAを除去した。
4〜5の合成されたペプチドの混合物を、PTS及びFPSの抗体を製造するための抗原として使用した。抗原ペプチドを、フリーソフトウエア(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html)により予測し、FPSについて直接的な3D構造分析(PDB:1FPS)又はPTSについて入手可能な構造EAS(PDB:5EAS)とのホモロジーモデル比較により選択した。PTSについて5つの抗原ペプチド(PTS46:EELKVEL;PTS108:HATALSFRLLRQHGYRVSCE;PTS353:DEELIKLGAPYRA;PTS462:HVRTAVECYME;PTS475:KVGKQEVVSE)、及びFPSについて4つの抗原ペプチド(FPP41:EFVGFFPQIVR;FPP59:GHPEVGDAVARLKEVLQY;FPP218:YKAIVKYKTAF−YSFYLPVAA;FPP320:PEKVAKVKELYEA)を設計した。全てのペプチドを、Sigma-Genosys(The Woodland、TX)により免疫学的グレードで10mgスケールで合成した。それぞれのペプチド混合物を、ついで、KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)キャリヤータンパク質に接合させ、Strategic Biosolutions(Windham、ME)によりウサギ中へ注入した。PTS及びFPSのためのポリクローナル抗体を、精製したPTS又はFPSタンパク質と結合されるCNBR−活性化セファロース4B樹脂を用いて製造された分取用抗原アフィニティーカラムにより製造者の指示書に従い(Amersham Biosciences、バッキンガムシア、英国)さらに精製した。
蓄積されたパチュロール中の炭素の生合成起源を決定するために、標識実験を実施し、かつ本発明の植物を、パチュロールの色素体生産について遺伝子操作した植物(PCT/IB2006/051198)と比較した。8PTS10(サイトゾル中でPTSを発現するトランスジェニック植物系統)及び2tpPTS+tpFPS12(色素体)の種を、ハイグロマイシン(15mg/l)を添加した固体MS培地上で発芽させた。
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Claims (13)
- HMG−CoA還元酵素(HMGR)をコードする導入遺伝子、テルペンシンターゼ(TS)をコードする導入遺伝子およびプレニルトランスフェラーゼ(PRT)をコードする導入遺伝子を発現する、植物。
- 導入遺伝子の産物が、植物の細胞のサイトゾルに向けられている、請求項1記載の植物。
- TSが、モノテルペンシンターゼ及び/又はセスキテルペンシンターゼである、請求項1または2記載の植物。
- PRTをコードする遺伝子が、ゲラニル二リン酸シンターゼ(GPS)及び/又はファルネシル二リン酸シンターゼ(FPS)をコードする遺伝子である、請求項1から3までのいずれか1項記載の植物。
- 導入遺伝子が核遺伝子である、請求項1から4までのいずれか1項記載の植物。
- 導入遺伝子を含んでない自然のままの植物に比較して、導入遺伝子によりコードされるTSにより合成されることができるテルペンを少なくとも1.2倍蓄積する、請求項1から5までのいずれか1項記載の植物。
- 導入遺伝子及び/又は付加的な遺伝子によりコードされるTSにより合成されることができるテルペンを、新鮮な葉1gあたり少なくとも400ng蓄積する、請求項1から6までのいずれか1項記載の植物。
- 形質転換植物を製造する方法であって、前記方法は、
・HMGR、TSおよびPRTをコードする付加的な遺伝子を含んでなるように植物材料を形質転換する段階、及び
・前記植物材料から形質転換植物を再生産する段階を含んでなる、形質転換植物を製造する方法。 - 形質転換植物を製造する方法であって、前記方法は、
・TSおよびPRTを含んでなるDNA構成体で植物材料を形質転換する段階、
・前記形質転換植物材料から植物を再生産する段階、
・HMGRをコードする少なくとも1つの遺伝子を含む遺伝子構成体で形質転換された植物を選択する段階、
・HMGRで形質転換された前記植物と前記再生産された植物を交雑する段階、
・TSをコードする遺伝子、HMGRをコードする遺伝子およびPRTをコードする遺伝子を含んでなる植物を交雑することで得られる後代を選択する段階を含んでなる、形質転換植物を製造する方法。 - 植物中のテルペンの含量を改変する方法であって、前記方法が、請求項8または9記載の段階を含んでなる、植物中のテルペンの含量を改変する方法。
- テルペンを生産する方法であって、前記方法が、請求項1から7までのいずれか1項記載の植物からか、又は請求項8または9記載の方法から得られた植物から、テルペンを単離する段階を含んでなる、テルペンを生産する方法。
- 改変されたテルペン含量を有する植物を生産するための、HMGRをコードする少なくとも1つの遺伝子、TSをコードする少なくとも1つの遺伝子およびPRTをコードする少なくとも1つの遺伝子の使用。
- HMGR、TSおよびPRTをコードする遺伝子が、色素体ターゲティング配列を欠いている核遺伝子である、請求項1から7までのいずれか1項記載の植物、請求項8または9記載の方法、及び/又は請求項12記載の使用。
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