CN101831456A - 采用转喜树aoc基因提高喜树愈伤组织中喜树碱含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种采用转aoc基因提高喜树愈伤组织中喜树碱含量的方法。本发明从喜树中克隆aoc基因，构建含aoc基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将aoc基因导入喜树细胞并再生出愈伤组织；PCR和半定量RT-PCR检测外源目的基因aoc的整合和表达情况，高效液相色谱检测器测定喜树愈伤组织中喜树碱含量，筛选喜树碱含量提高的转基因喜树愈伤组织。本发明获得的转基因喜树愈伤组织中喜树碱的含量显著提高，本发明提供了一种提高喜树细胞培养物中喜树碱含量的方法，对解决喜树碱药源匮乏、满足医药工业大规模工厂化生产需要具有重要意义。

Description

采用转喜树aoc基因提高喜树愈伤组织中喜树碱含量的方法

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种提高喜树愈伤组织中喜树碱含量的方法，特别是一种采用转化丙二稀氧化物环化酶基因(allene oxide cyclase，aoc)提高喜树愈伤组织中喜树碱含量的方法。

背景技术

喜树(Camptotheca acuminata Decaisne)，蓝果树科(Nyssaceae)喜树属多年生亚热带落叶阔叶树，别名有旱莲木、干丈树等，此属仅喜树1种植物，是我国特有树种(中国科学院中国植物志编辑委员会，1983)。自20世纪90年代来，美国、日本、加拿大和英国等国家积极投入大量人力物力进行喜树引种和栽培等的研究和喜树碱开发，喜树成为红豆杉(Taxus sp。)之后第2个重要的木本抗癌药用植物(Wallis，Wang et al.1997)。至此，已从喜树中分离出20多种化学成分，其中喜树碱及其类似物有8种，它们的共同点是结构中都拥有5个环。其中，10-羟基喜树碱(hydroxy-camptothecin，HCPT)是喜树碱分子的第10位碳原子的氢被羟基取代后的喜树碱的天然衍生物，来源于喜树的果实、叶，也可由喜树碱人工化学转化而来，为黄色柱状结晶、不溶于水，微溶于有机溶剂、溶液，具有蓝色荧光，其钠盐溶于水。该化合物具有显著的抗癌活性，较喜树碱剂量小、毒性轻、抗瘤广谱。从目前的研究情况和研究趋势来看，喜树碱及类似物主要从喜树中分离获得(Sriram，Yogeeswari et al.2005)。而喜树碱作为喜树中的一种天然次生代谢产物，其产量受到喜树生长发育和环境因素的影响，而过去人们一直着力于提取工艺和产品的开发，随着喜树碱市场的扩大，生产喜树碱及其类似物所需的原料将成为这一产业的瓶颈。据报道，中国国内每年新发现癌症患者160万人，并有130万人死于癌症，全世界的癌症患者将会更多。但现今全世界的喜树碱的生产能力仅为600kg，远远不能满足市场的需要，而且喜树碱仍不能化学全合成，所以喜树资源仍是喜树碱及其类似物的唯一来源。喜树愈伤组织和细胞培养系统则为生产喜树碱带来了新的希望。

喜树碱(camptothecin，简称CPT)是一种具有抗肿瘤活性的萜类吲哚生物碱。经对现有技术的文献检索发现，国内外科学家尝试了采用各种方法，包括优化培养条件(Helmut Wiedenfeld，et al.Camptothecin and 10-hydroxycamptothecin in callus and plantlets of Camptotheca acuminata.Plant Cell Tissue and Organ Culture，1997，49：213-218.Xue-Wu Pan，et al.Improvement of growth and camptothecin yield by altering nitrogen source supply in cell suspension cultures of Camptotheca acuminata.Biotechnology Letters，2004，26：1745-1748)、加入前体物质(Andrea Silvestrini，et al.Effects of alkaloid precursor feeding on Camptotheca acuminata.Physiology and Biochemistry，2002，40：749-753)及转化发根(Lorence A，et al.Camptothecin and 10-hydroxy-camptothecin from Camptotheca acuminatahairy roots.Plant Cell Reports，2004，22：437-441)来提高喜树组织培养物中喜树碱的含量。如Wiedenfeld等对喜树组织培养的培养基条件进行了研究，比较了不同的激素配比和培养基类型，选择了MS培养基和1.0mg/Lα-萘乙酸、1.0mg/L激动素和60mg/L蔗糖作为最优培养条件，发现体外培养的所有组织和器官中都含有喜树碱和10-羟基喜树碱，喜树愈伤中喜树碱含量变化范围从2.36mg/g到1.49mg/g干重。而Lorence等建立了利用发根农杆菌ATCC15834和A4遗传转化喜树的体系，获得了毛状根，其中喜树碱最高含量为1.0mg/g干重.

虽然尝试了多种办法来提高喜树愈伤组织和细胞培养物中的喜树碱含量，但到目前为止，通过愈伤组织和细胞培养系统来产生喜树碱，其含量依然太低不具商业前景。代谢工程为改变植物细胞或愈伤组织的组成成份和增加植物细胞或愈伤组织喜树碱产量提供了一条诱人的方法。为了更有效地生产喜树碱，应用一条新的途径进行植物次生代谢基因工程，开展茉莉酸合成途径关键酶基因的表达及调控研究，以及开展喜树碱代谢工程研究相结合将是提高喜树碱含量并最终解决喜树碱产品稀缺的有效方法。

ORCA3(octadecanoic-responsive Catharanthus AP2-domain protein 3)是一个受甲基茉莉酸诱导的植物基础和次级代谢的主要转录调控因子，可增强萜类吲哚生物碱(Terpenoid Indole Alkaloids，TIAs)代谢途径上多个基因(dxs、as、tdc、str)的表达，从而使代谢流向TIAs合成方向流动，利于TIAs的积累。在茉莉酸合成途径中，丙二烯氧化物环化酶(allene oxide cyclase，AOC，EC 5.3.99.6)是调控茉莉酸合成途径中最优先考虑的靶点。它催化一种不稳定的丙二烯氧化物环化生成茉莉酸最终前体12-氧植物二烯酸。采用基因工程手段，将丙二烯氧化物环化酶编码基因aoc转化喜树，对喜树碱合成途径上多个基因进行调控，获得喜树碱高产的喜树愈伤组织。目前尚未发现转化aoc基因提高喜树愈伤组织中喜树碱含量的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种提高喜树愈伤组织中喜树碱含量的方法，特别是一种采用转化丙二稀氧化物环化酶基因(allene oxide cyclase，aoc)提高喜树愈伤组织中喜树碱含量的方法。

本发明涉及的关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、生物碱提取及含量测定、半定量RT-PCR分析用于本发明，建立了提高喜树愈伤组织生物碱含量的方法，为喜树愈伤组织大规模工厂化生产奠定坚实的基础。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明从喜树中克隆aoc基因，构建含aoc基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将aoc基因导入喜树细胞并再生出愈伤组织；PCR和半定量RT-PCR检测外源目的基因aoc的整合和表达情况，高效液相色谱(HPLC)测定喜树愈伤组织中喜树碱含量，筛选喜树碱含量提高的转基因喜树愈伤组织。

本发明包括如下具体步骤：

(1)采用基因克隆方法获得喜树关键酶基因aoc；

(2)把aoc基因可操作性地连于表达调控序列，形成含aoc基因的植物表达载体；

(3)将含aoc基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化喜树的含aoc基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

(4)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化喜树细胞，获得经PCR检测的转基因愈伤组织；

(5)半定量RT-PCR测定喜树愈伤组织中aoc基因的表达；

(6)对获得的转基因愈伤组织中喜树碱含量进行HPLC测定，筛选喜树碱含量显著提高的转基因喜树愈伤组织。

本发明中，所述的经PCR检测的转基因愈伤组织是指，分别设计合成aoc基因的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性组织即为转基因喜树愈伤组织。

所述的对获得的转基因愈伤组织中喜树碱含量进行HPLC测定，方法为：色谱柱为Diamonsil C-18柱，流动相为乙腈∶水，乙腈∶水的体积比为4∶6，柱温25℃，流速0.8mL/min，进样量10μL。喜树碱含量根据峰面积由标准品曲线换算。

所述的半定量RT-PCR测定喜树愈伤组织中aoc基因的表达，方法为：设计合成aoc基因和看家基因18S rRNA的引物，进行半定量RT-PCR扩增，用相对定量法分析基因相对表达量。

与现有技术相比，本发明的采用转aoc基因提高喜树愈伤组织喜树碱含量的方法：采用基因工程方法，将茉莉酸合成途径关键酶基因aoc导入喜树愈伤组织中，获得了喜树碱含量显著提高的喜树愈伤组织，且转基因喜树愈伤中喜树碱含量均高于非转基因喜树愈伤。其中，转基因喜树愈伤中喜树碱含量最高达3.9310mg/g干重，而非转基因喜树愈伤中几乎检测不到喜树碱含量。这对解决喜树碱药源匮乏、满足医药工业大规模工厂化生产需要具有重要意义。

所述的根癌农杆菌的公开方式为：市场有公开出售的生物材料，可以从多家公司如澳大利亚CAMBIA公司(CAMBIA，GPO Box 3200，Canberra，ACT 2601，Australia。商品名称：根癌农杆菌菌株如EHA105，商品编号：Gambar 1)购得。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1喜树aoc基因的克隆

1.组织分离

将喜树种子用75％(V/V)酒精浸泡1分钟，再用0.1％(V/V)HgCl₂浸泡5分钟，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog，1962)固体培养基中，25℃、12h/12h光照培养，即可获得喜树无菌苗，待苗长至5cm左右后，切取叶片和茎段用于RNA提取。

2.RNA的分离

称取0.5g所述的喜树无菌试管苗，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有1mL CTAB缓冲液[3％CTAB(W/V)，3％PVP(W/V)(Mw 40000)，25mM EDTA，2.0M NaCl，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.5g/L spermidine和0.1％DEPC(V/V)]的1.5mL Eppendorf管中，充分振荡后，于室温下放置5min，加200μL氯仿，用力振荡15sec，室温放置2-3min后，于4℃、12,000g离心15min；将上清液(约600μL)吸入干净的1.5mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温下放置10min后，于4℃、12,000g离心10min；弃上清，加1mL 75％乙醇清洗，振荡后，于4℃、7,500g离心5min；室温干燥15-20min后溶于适量(50μL)RNAase-free水中；用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.基因克隆

将所获的喜树总RNA通过反转录酶XL(AMV)反转录获得第一链cDNA，根据所述喜树aoc基因的编码序列(序列表中的序列1)，设计扩增出完整编码框的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海英骏生物技术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank中所报道的喜树aoc基因的编码序列(序列表中的序列1)一致。

本实施例采用基因克隆方法从喜树中获得序列正确的喜树茉莉酸生物合成关键酶基因aoc，为通过转aoc基因提高喜树愈伤组织中喜树碱含量提供了一个重要关键酶基因。

实施例2 构建含aoc基因的植物表达载体pCAMBIA1304::p35S-aoc-nos

以pCAMBIA1304为表达载体，用实施例1中aoc基因替换其上的gfp+gus基因。具体地，Spe I/BstE II双酶切pMDT-simple+aoc和pCAMBIA1304，回收aoc和pCAMBIA1304大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。结果表明，aoc基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIA1304中，从而获得含aoc基因的植物表达载体pCAMBIA1304::p35S-aoc-nos。

本实施例将喜树茉莉酸生物合成途径关键酶基因aoc可操作性地连于表达调控序列，形成含aoc基因的植物表达载体，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高喜树愈伤组织中喜树碱的含量。

实施例3获得含aoc基因植物表达载体根癌农杆菌工程菌

将实施例2中含aoc基因的植物表达载体转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar 1)，并进行PCR验证。具体地，首先制备感受态根癌农杆菌(如EHA105)：培养根癌农杆菌至菌液O.D₆₀₀＝0.5，将菌液冰浴30min后，取菌于1.5ml Eppendorf管中，于4℃5000rpm离心5min，去上清；用抽滤灭菌的0.1M CaCl₂(预冷)400μl悬浮菌体(用移液枪轻轻打匀)后于冰上放置30min，5000rpm离心5min，去上清，用100μl预冷的0.1MCaCl₂悬浮菌体后于4℃保存10h备用。然后，采用以下方法获得含aoc基因的植物表达载体(pCAMBIA1304::p35S-aoc-nos)的根癌农杆菌工程菌株：取一管100μl的感受态，加10μl质粒DNA(pCAMBIA1304::p35S-aoc-nos)，轻轻混匀后，于冰上放置5min和液氮中放置8min后，放入37℃水浴中热激5min；加入800μl无抗生素的YEB液体培养基，轻轻混匀；振荡培养活化(28℃，200rpm)4h后，于室温离心(4000rpm)10min，去上清，余下200μl菌液重悬菌体混匀；将混匀的200μl重悬活化菌液均匀涂布到加相应抗生素[卡那霉素(Kan)100μg/ml+链霉素(Str)25μg/ml+利福平(Rif)40μg/ml]的YEB固体培养基平板上，于28℃培养箱中倒置培养2天后，挑选抗性单菌落在含相应抗生素的YEB液体培养基中培养。菌液达到一定浓度后做目的基因aoc的PCR检测。结果表明，含aoc基因植物表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。

实施例4

1.根癌农杆菌介导aoc基因转化喜树

1.1.农杆菌的培养

挑取含所述aoc基因植物表达载体的根癌农杆菌工程菌单菌落于培养基[YEB液体培养基+链霉素(Str)25μg/ml+卡那霉素(Kan)100μg/ml+利福平(Rif)40μg/ml]中在28℃摇床上180rpm振荡过夜，第二天当菌液浓度达到OD₆₀₀＝0.5时，5000rpm离心10分钟后倒掉上层培养液，重悬沉淀在底部的农杆菌，加入100μM乙酰丁香酮，在28℃摇床(180rpm)上活化2小时后用于转化喜树外植体。

1.2.农杆菌与外植体的共培养

将喜树种子用75％(V/V)酒精消毒1分钟，再用0.1％(V/V)HgCl₂浸泡消毒5分钟，无菌水冲洗3-4次后，用剪刀把种胚剪出伤口，放进上述菌液中浸泡5分钟，把菌液倒掉，用无菌吸水纸吸干胚上多余的菌液，置于共培养培养基(MS+5mg/LNAA+0.5mg/L 6-BA+0.3mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶)上于25℃暗培养3天，使农杆菌充分侵染喜树幼胚。以浸泡在不带有根癌农杆菌的幼胚外植体为对照。

1.3.愈伤组织的诱导和继代培养

共培养后，把胚外植体转接到恢复培养基(MS+5mg/L NAA+0.5mg/L6-BA+0.3mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶+250mg/L羧苄霉素)上进行愈伤组织诱导和脱菌培养，于25℃暗培养4周后转接到筛选培养基(MS+5mg/LNAA+0.5mg/L 6-BA+0.3mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶+250mg/L羧苄霉素+25mg/L潮霉素)上进行抗性愈伤组织的筛选培养，将起源于不同细胞的每个愈伤组织作为一个无性系，接种于继代培养基(MS+5mg/L NAA+0.5mg/L6-BA+0.3mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶+25mg/L潮霉素)上继代筛选，每四周继代培养一次。

2.转基因喜树愈伤组织的PCR检测

首先采用常规CTAB(Cetyltrimethyl Ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化胺)方法提取转基因喜树潮霉素抗性愈伤组织的DNA，然后，根据目的基因所在表达盒pCAMBIA1304::p35S-aoc-nos序列p35s和aoc分别设计正向引物T35SF和反向引物TAOCR，用PCR方法对转基因喜树抗性愈伤组织中的目的基因aoc进行检测。PCR反应条件为：94℃变性5min→30个循环(94℃ 50sec→58℃ 50sec→72℃ 1min)→72℃ 6min。结果表明，利用所设计的PCR特异引物扩增转基因喜树愈伤组织DNA，能扩增出与预期结果一致的特异目的片段(0.5kb)，而以非转化喜树基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。说明aoc基因已经整合到喜树基因组中。

本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化喜树的含aoc基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化喜树细胞，获得经PCR检测的转基因愈伤组织。转基因喜树愈伤组织的获得为筛选获得喜树碱含量提高的喜树愈伤组织提供了直接素材。

实施例5半定量RT-PCR检测转基因喜树愈伤组织中aoc基因的表达

1.引物的设计和合成

设计合成aoc基因和看家基因18S rRNA的引物，进行半定量RT-PCR扩增，PCR产物凝胶电泳后与对照愈伤组织对比其表达量。

2.RNA的提取

参照实施例1中所述方法，从喜树愈伤组织中提取RNA，用DNaseI除去RNA中基因组DNA，用反转录酶XL(AMV)进行第一链cDNA的合成，再以第一链cDNA为模板进行半定量RT-PCR。

3.半定量RT-PCR检测看家基因18S rRNA基因的表达

为调整各样品间在RNA抽提和逆转录过程中反应效率的差异，检测目的基因表达量的同时需检测看家基因18S rRNA基因的表达。

4.半定量RT-PCR检测转基因喜树愈伤组织中aoc基因的表达

用非转化普通愈伤作对照，用半定量RT-PCR测定aoc基因的表达量。半定量RT-PCR反应条件为：50℃ 30min→94℃ 2min→22个循环(94℃ 30sec→60℃30sec→72℃ 60sec)。结果表明，在相同的总RNA量和18s rRNA基因表达水平下，相比未转化的愈伤组织，转基因愈伤组织中的aoc基因转录水平有明显升高，表明目的基因aoc的转入显著提高了喜树愈伤中的aoc的表达量。

实施例6利用HPLC测定转基因喜树愈伤组织中喜树碱含量

1.HPLC条件及系统适用性以及标准溶液的配制

HPLC：采用高效液相色谱仪(日本岛津HPLC-4A)，积分仪3395，监测器SPD-10A。喜树碱标准品(SIGMA)。乙腈为HPLC级；水为超纯水。色谱柱为Diamonsil C18柱(5μm，200×4.5mm)。流动相为乙腈∶水，乙腈∶水的体积比为4∶6，柱温25℃，流速0.8mL/min，进样量10μL，压力7.8Mpa，灵敏度(AUFS＝1.0)。

精密称取喜树碱标准品(Sigma公司)用甲醇溶解并稀释至浓度为0.4ng/μL，0.8ng/μL，4ng/μL，8ng/μL，保存于-20℃备用。

2.标准曲线的制作

将所述标准品溶液在相应色谱条件下进样，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品浓度(X，ng/L)进行回归分析。喜树碱标准品的log-log线性回归方程分别为：

Y＝0.0153X+0.0935

R²＝0.9945

3.样品的制备和喜树碱含量的测定

将愈伤组织置于烘箱中60℃干燥至恒重。每次称取研碎的愈伤组织0.2g进行定量分析。用8ml 95％乙醇50℃超声30分钟后，冷却至室温，吸取提取液，12500转/分钟离心10分钟，吸取上清液，12500转/分钟再离心10分钟，吸取上清液，取10μl上样，用HPLC法测量喜树碱的含量。

分别吸取所述对照品溶液和供试样品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，记录各组分峰面积，代入线性回归方程，计算即得样品中喜树碱含量。

在本发明中转aoc基因显著提高喜树愈伤组织中喜树碱含量。结果表明转基因愈伤组织中喜树碱含量比对照均有较大增加，其中非转基因对照愈伤组织中几乎检测不到喜树碱(痕量)，是由于对照愈伤中喜树碱含量太低，达不到最低检测范围；而转aoc基因的转基因愈伤组织中喜树碱含量最高为3.9310mg/g干重，最低为1.0028mg/g干重。

本实施例采用HPLC法测定了转基因喜树愈伤组织中喜树碱含量。采用转aoc基因的代谢工程策略获得了喜树碱含量提高的喜树愈伤组织，为规模化生产喜树碱并最终解决生物碱匮乏提供了一种方法。

本发明涉及的序列表：

<110>复旦大学

<120>转aoc基因提高喜树愈伤组织中喜树碱含量的方法

<160>1

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>2622

<212>DNA

<213>喜树(Camptotheca acuminata Decaisne)

<400>1

1   GATTCACCCA TTACATCCAT CCTCACCAAA CTTTTTACTT TTTCTCCTCA GACTTCAGAG

61  CACTTCCAAT AATGGCTGCT TCATCAACTT CTTCTCTCAG AACCATCTCT TCCTCTGTAA

121 AGCTACCAAC TGCCACCGCC ATCACTTCAC CTGCCCAGAA ACTCACACAC TTCAAGCTCT

181 CCAACCCCTT CGTCTCCCAA AACCTCAGAC TCACCACCAC AGCTGCCCCT TCCAGAATAT

241 CATTCACATG CAAGTGCCAA AGCAGCACAT CAGATTCTTC AAGACCCAGT AAAGTTCAAG

301 AACTGCACGT CTATGAGATC AACGAACGAG ACCGTGGAAG CCCAGCTTAT CTCAGGCTCA

361 GCCAGAAATC TGTCAATTCC CTCGGCGATC TTGTCCCTTT CAGCAACAAA ATCTATAGCG

421 GATGTCTGAA GAAGCGATTG GGAGTAACGG CCGGAATATG CGTTCTGATC CGGAACGTGC

481 CGGAGAAGAA AGGTGACGTG TACGAGGCGA TCTACAGCTT CTACTTCGGA GACTACGGTC

541 ACATAGCGGT GCAGGGAGCG TATTTGACCC ACCAGGACAC GTATCTAGCT GTGACTGGTG

601 GATCGGGCAT CTTCGAGGGG GTGTACGGTT CCGTGAAGCT GCACCAGATT GTGTTCCCCT

661 TCAAGTTACT GTACACTTTT TACTTGAAGG GTATACCGGA TCTGCCGGAG GAGTTGCTAG

721 ATACACCGGT CCATCCGTCG CCCACGGTGG AGCCGTCGCC CGAGGCCAAG GCGTGTGAAC

781 CTGGCGCCAC TCTTCCTAAC TTCACTGACT GAGGATGCTC GAGAATGATG ATGGTCAAAA

841  AACTGCACTT TAATTATGAC ACTTCTGTAA TATTGTGGCT GCGTTTTCTT TTCTTTTCTC

901  TTTTTTTATG GTGGCGCCGG CGGAGTGGTG GAGGAGGTTT TTTTTTGGGT TGGAGTCGTT

961  CAATTTGGAG GCAATTTTTA GTGCATTGAG AGGCCCACTT CACCACTTGA TAGAATGAGC

1021 TGTCGAAACT ATATACATAT GTATGTAAAA TGGCATATTT TTCAGGGCAT TACATTTGGA

1081 TTTCAAGTTA TTGCATATTA TTATGTTTGG ACTAAAAAAA AAAAAAAAAA GTACTAGTCG

1141 ACGCGTGGCC

Claims (5)

1.一种采用转喜树aoc基因提高喜树愈伤组织中喜树碱含量的方法，其特征在于，从喜树中克隆丙二烯氧化物环化酶AOC基因，构建含aoc基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将aoc基因导入喜树幼胚并诱导出愈伤组织，PCR和半定量RT-PCR检测外源目的基因aoc的整合和表达情况，利用高效液相色谱法测定喜树愈伤组织中喜树碱的含量，筛选喜树碱含量提高的转基因喜树愈伤组织。

2.根据权利要求1所述的采用转aoc基因提高喜树愈伤组织中喜树碱含量的方法，其特征是，包括如下具体步骤：

(1)采用基因克隆方法获得喜树关键酶基因aoc；

(2)把aoc基因可操作性地连于表达调控序列，形成含aoc基因的植物表达载体；

(3)将含aoc基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化喜树的含aoc基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

(4)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化喜树幼胚，获得经PCR检测的转基因愈伤组织；

(5)半定量RT-PCR测定喜树愈伤组织中aoc基因的表达；

(6)对获得的转基因愈伤组织中生物碱含量进行高效液相色谱检测仪测定，筛选喜树碱含量提高的转基因喜树愈伤组织。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的经PCR检测的转基因愈伤组织，其中：设计合成aoc基因的引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性愈伤组织即为转基因喜树愈伤组织。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的对获得的转基因愈伤组织中生物碱含量进行高效液相色谱法检测器测定，其中：色谱柱为Diamonsil C18柱，流动相为乙腈∶水，乙腈∶水的体积比为4∶6，柱温25℃，流速0.8mL/min，进样量10μL，压力7.8Mpa，喜树碱含量根据峰面积由标准品曲线换算。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的半定量RT-PCR测定喜树愈伤组织中aoc基因的表达，通过下述步骤：设计合成aoc基因和看家基因18S rRNA的引物，进行半定量RT-PCR扩增，用相对定量法分析基因相对表达量。