CN113416239A - 一个参与阳春砂乙酸龙脑酯合成调控的转录因子AvbHLH3及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个参与阳春砂乙酸龙脑酯合成调控的转录因子AvbHLH3及其应用。本发明提供了一个参与阳春砂乙酸龙脑酯合成调控的转录因子AvbHLH3，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。本发明中，所述的阳春砂转录因子AvbHLH3能与萜类合酶基因AvBPPS启动子区G‑box(CACGTG)位点结合，激活AvBPPS基因的表达，进而促进阳春砂乙酸龙脑酯的生物合成。采用遗传转化技术过量表达阳春砂转录因子AvbHLH3基因可以显著增加阳春砂挥发油中乙酸龙脑酯的含量。由此表明，所述的AvbHLH3能显著促进阳春砂挥发油中乙酸龙脑酯的生物合成，提升阳春砂挥发油的药用品质。

Description

一个参与阳春砂乙酸龙脑酯合成调控的转录因子AvbHLH3及 其应用

技术领域：

本发明属于药用植物基因工程技术领域，具体涉及参与阳春砂乙酸龙脑酯生物合成调控的转录因子AvbHLH3及其相关材料与应用。

背景技术：

阳春砂(Amomum villosum)，为中草药砂仁的药用植物，以广东阳春市为道地产区。阳春砂富含萜类挥发油，尤其是乙酸龙脑酯(bornyl acetate)、龙脑(borneol)和樟脑(camphor)，收录于《中华人民共和国药典》的各个版本中，并以乙酸龙脑酯作为砂仁质量评价的标准。现代医学研究表明，乙酸龙脑酯具有止泻、镇痛、抗氧化、抗炎和抗癌功效(李晓光,叶富强,徐鸿华.砂仁挥发油中乙酸龙脑酯的药理作用研究[J].华西药学杂志,2001,16(5):356-358；李丽丽,田文仓,刘茵,等.砂仁中化学成分及其药理作用的研究进展[J].现代生物医学进展,2018,18(22):4390-4396)。因此，鉴别参与乙酸龙脑酯生物合成调控的转录因子具有重要的药用前景。

乙酸龙脑酯，属于单萜烯醇酯，具有强烈的芳香气息。挥发性乙酸龙脑酯的生物合成主要由萜类合酶(Terpene synthetase,TPS)催化生成，TPS家族成员目前已在拟南芥、水稻、番茄、铁皮石斛、葡萄、小苍兰等多个物种中有研究(Aubourg S,Lecharny A,BohlmannJ.Genomic analysis of the terpenoid synthase(AtTPS)gene family of Arabidopsisthaliana[J].Mol.Genet.Genomics.2002,267(6):730-745；Yu Z,Zhao C,Zhang G,etal.Genome-wide identification and expression profile of TPS gene family inDendrobium officinale and the role of DoTPS10 in linalool biosynthesis[J].Int.J.Mol.Sci.2020,21:5419；Zhou F,Pichersky E.The complete functionalcharacterisation of the terpene synthase family in tomato[J].New Phytol.2020,226:1341-1360)。TPS基因表达水平受bHLH、MYB、WRKY、AP2/ERF、NAC等家族转录因子调控(Hong,GJ,Xue XY,Mao YB,et al.Arabidopsis MYC2 interacts with DELLA proteinsin regulating sesquiterpene synthase gene expression[J].Plant Cell.2012,24:2635-2648；Xu J,van Herwijnen ZO,

DB,et al.SlMYC1 regulates type VIglandular trichome formation and terpene biosynthesis in tomato glandularcells[J].Plant Cell.2018,30:2988-3005；Yang Z,Li Y,Gao F,et al.MYB21 interactswith MYC2 to control the expression of terpene synthase genes in flowers ofFreesia hybrida and Arabidopsis thaliana[J].J.Exp.Bot.2020,71:4140-4158)，转录因子可以通过与TPS基因的启动子上的顺式作用元件相互结合，进而调控TPS基因的表达水平(Lai X,Stigliani A,Vachon G,et al.Building transcription factor bindingsite models to understand gene regulation in plants[J].Mol.Plant.2019,12:743-763)。目前，转录因子调控单萜类芳香物质生物合成的研究尚不多见，主要集中在双子叶模式植物拟南芥和番茄中，受茉莉酸响应的转录因子AtMYC2上调AtTPS11和AtTPS21基因表达，进而促进倍半萜化合物(α-律草烯、β-石竹烯和罗汉柏烯)积累(Hong,GJ,Xue XY,MaoYB,et al.Arabidopsis MYC2 interacts with DELLA proteins in regulatingsesquiterpene synthase gene expression[J].Plant Cell.2012,24:2635-2648)。番茄SlMYC1正调控茎和叶毛状体中单萜化合物的积累，但负调控茎毛状体中倍半萜的积累，SlMYC1和SlWRKY73可以激活番茄芳樟醇合酶SlTPS5表达，SlMYC1与SlEOT1也可协同激活SlTPS5的表达水平，调控萜类物质合成(Xu J,van Herwijnen ZO,

DB,et al.SlMYC1regulates type VI glandular trichome formation and terpene biosynthesis intomato glandular cells[J].Plant Cell.2018,30(12):2988-3005)。迄今，阳春砂乙酸龙脑酯生物合成的上游转录因子尚不清楚，还未鉴定出调控乙酸龙脑酯生物合成的转录因子。

发明内容：

本发明的目的在于：提供一个参与阳春砂乙酸龙脑酯生物合成调控的转录因子AvbHLH3，转录因子AvbHLH3能够促进乙酸龙脑酯的生物合成。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一个参与阳春砂乙酸龙脑酯生物合成调控的转录因子AvbHLH3，所述AvbHLH3具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了上述阳春砂转录因子AvbHLH3编码的蛋白质，所述蛋白质具有如SEQID NO.4所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种含有上述阳春砂转录因子AvbHLH3的重组载体，所述重组载体为pCAMBIA3300-AvbHLH3。

本发明还提供了一种含有所述重组载体的重组微生物，所述微生物是农杆菌GV3101(pSoup-p19)菌株，所述重组载体为pCAMBIA3300-AvbHLH3。

本发明的另一个目的是提供上述阳春砂转录因子AvbHLH3在促进阳春砂中乙酸龙脑酯的生物合成中的应用。

本发明的再一个目的是提供上述阳春砂转录因子AvbHLH3在促进萜类合酶基因AvBPPS表达中的应用。

本发明的又一个目的是提供上述阳春砂转录因子AvbHLH3在阳春砂改良育种中的应用，所述应用优选为阳春砂转录因子AvbHLH3在阳春砂挥发油品质改善的基因工程育种中的应用。

本发明提供了一个参与阳春砂乙酸龙脑酯合成调控的转录因子AvbHLH3，属于药用植物基因工程技术领域，所述的阳春砂AvbHLH3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明中，所述的阳春砂转录因子AvbHLH3能与萜类合酶基因AvBPPS启动子区G-box(CACGTG)位点结合，激活AvBPPS基因的表达，进而促进阳春砂乙酸龙脑酯的生物合成。经过验证分析，在阳春砂不同部位中，转录因子AvbHLH3的基因表达量与AvBPPS基因的表达量、乙酸龙脑酯含量呈明显的正相关。采用遗传转化技术过量表达阳春砂转录因子AvbHLH3基因可以显著增加阳春砂挥发油中乙酸龙脑酯的含量。由此表明，所述的AvbHLH3能显著促进阳春砂挥发油中乙酸龙脑酯的生物合成，提升阳春砂挥发油的药用品质。

附图说明：

图1为阳春砂AvbHLH3基因扩增电泳图。左边为核酸分子量标准，条带自上而下依次为2000、1500、1000、750、500、250、100bp；右边表示AvbHLH3基因。

图2为阳春砂转录因子AvbHLH3蛋白二级结构。蓝色表示α-螺旋，红色表示延伸主链，绿色表示β-转角，紫色表示无规卷曲。

图3为阳春砂转录因子AvbHLH3蛋白三级结构。

图4为AvbHLH3与已报道拟南芥bHLH家族成员遗传进化树分析。AvbHLH3聚类于IIId亚家族，与拟南芥AtbHLH3蛋白亲缘关系最近。

图5为阳春砂AvbHLH3和AvBPPS基因在不同部位的表达量，不同部位包括根(Root)、茎(Stem)、叶(Leaf)、花(Flower)和果实(Fruit)；每组数据的bar表示±标准误差(n≥10)，统计分析为不同部位之间的比较，采用新复极差法进行多重比较，与单因素方差分析，p<0.05差异有统计学意义。

图6为阳春砂乙酸龙脑酯在不同部位的含量，不同部位包括根(Root)、茎(Stem)、叶(Leaf)、花(Flower)和果实(Fruit)；每组数据的bar表示±标准误差(n≥10)，统计分析为不同部位之间的比较，采用新复极差法进行多重比较，与单因素方差分析，p<0.05差异有统计学意义。图7为GC-MS分析中乙酸龙脑酯标准品的质谱图。

图8为阳春砂转录因子AvbHLH3的亚细胞定位。黄色为黄色荧光蛋白YFP信号，红色为叶绿体自发荧光信号。

图9为所用的植物双元表达载体pCABIA3300。NCBI登陆号为KP795973。

图10为阳春砂AtbHLH3超表达载体构建的示意图。

图11为过表达AtbHLH3基因上调AtBPPS基因的表达，并促进阳春砂挥发油中的乙酸龙脑酯含量增加；每组数据的bar表示±标准误差(n≥10)，统计分析为处理组与对照组的比较，采用t检验法进行多重比较，与单因素方差分析，p<0.05差异有统计学意义。

图12为酵母单杂交与双荧光素酶系统表明转录因子AtbHLH3通过G-box与AtBPPS启动子结合，并激活AtBPPS基因的表达。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

下列实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产品生产厂商的使用说明。

实施例中所用阳春砂(Amomum villosum)栽种于中国科学院华南植物园种植基地(N23°10′,E113°21′；中国广州)；野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)源自哥伦比亚生态型(Columbia,Col-0)；多糖多酚植物RNA提取试剂盒购于华越洋生物科技有限公司(货号:0416-50)；反转录酶M-MLV试剂盒购于Promega公司(货号:M1701)；大肠杆菌DH 5α购自上海唯地生物技术有限公司(货号:DL1001)；HiPure Gel Pure Micro Kit购自广州美基科技有限公司(货号:D2110-02)；2×Hieff

PCR Master Mix购自YEASEN公司(货号:10136ES03)；

HD Cloning Kit购自Takara公司(货号:639648)；pMD18-T Vector购自Takara公司(货号:D101A)；SYBR Premix Ex Taq^TM Kit购自Takara公司(货号:DRR420A)；TaKaRa LA

购自Takara公司(货号:RR52A)；

ReporterAssay System试剂盒(Promega公司,货号:E1910)；LB、MS、SD培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

实施例1阳春砂转录因子AvbHLH3基因克隆及其生物信息学分析

(1)阳春砂果实总RNA的提取及cDNA第一条链的合成

取刚收获的100mg阳春砂果实，在液氮下研磨成粉。采用多糖多酚植物RNA提取试剂盒(华越洋生物科技有限公司,货号:0416-50)提取阳春砂果实总RNA。采用NanoDrop^TM2000c超微量分光光度计(Thermo Scientific公司,美国威斯康星州)和1.0％琼脂糖凝胶电泳仪(Biorad公司,美国加利福尼亚州)测定总RNA的含量和纯度。取2μg已纯化的阳春砂果实总RNA，根据反转录酶M-MLV试剂盒(Promega公司,货号:M1701)的使用说明书，进行cDNA第一条链的合成，将反应产物稀释到所需浓度，-80℃冰箱保存。

(2)阳春砂转录因子AvbHLH3基因的扩增及序列分析

以上述获得的阳春砂果实cDNA为模板，采用Primer Premier 5.0(PremierBiosoft公司,美国加利福尼亚州)设计阳春砂转录因子AvbHLH3基因相应上游引物SEQ IDNO.2和下游引物SEQ ID NO.3，运用2×Hieff

PCR Master Mix(YEASEN公司,货号:10136ES03)进行PCR扩增获得阳春砂AvbHLH3基因序列，具体如SEQ ID NO.1所示。PCR反应体系：模板1.0μL，2×Hieff

PCR Master Mix 12.5μL，上游引物1.25μL，下游引物1.25μL，灭菌ddH₂O补足至总体积25μL。PCR反应程序：98℃预变性3min，随后进行35个循环反应(98℃10s,60℃30s,72℃1min)，72℃终延伸5min。PCR产物采用1.0％琼脂糖凝胶电泳仪(Biorad,美国加利福尼亚州)检测，并使用HiPure Gel Pure Micro Kit(广州美基科技有限公司,货号:D2110-02)回收目的片段，连接到pMD18-T Vector(Takara公司,货号:D101A)，连接产物采用热激法转化至大肠杆菌DH 5α(上海唯地生物技术有限公司,货号:DL1001)，涂布于含有100μg·mL^-1氨苄抗生素的LB平板上，37℃过夜。挑取单菌落为模板，以上述上、下游序列为引物，进行菌落PCR验证，阳性克隆送至北京擎科新业生物技术有限公司(广州分公司)进行菌液测序。获得阳春砂AvbHLH3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

阳春砂转录因子AvbHLH3开放阅读框(Open reading frame)为1818bp(图1)，编码605个氨基酸(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)，预测的蛋白分子量大小为66.52kDa，理论等电点(Theoretical pI)为6.14，脂肪族氨基酸指数(Aliphatic index)为78.88，亲水性平均系数(Grand average of hydropathicity)为-0.468，不稳定指数(instabilityindex)为50.47。阳春砂AvbHLH3蛋白的N端含有核定位信号NLS，C端含有保守的bHLH结构域。

通过生物学软件SOPM分析表明，阳春砂AvbHLH3蛋白二级结构包含38.35％的α-螺旋(Alpha helix)，7.11％的β-转角(Beta turn)，38.18％的无规卷曲(Random coil)，和16.36％的延伸主链(Extended strand)(图2)。根据SWISS-MODEL软件推测得到阳春砂AvbHLH3蛋白的三级结构如图3所示。

进一步系统进化分析显示，AvbHLH3属于bHLH家族成员，聚类于IIId亚家族，与拟南芥AtbHLH3蛋白亲缘关系最近(图4)。

实施例2阳春砂AvbHLH3、AvBPPS基因表达模式分析

收集阳春砂的不同组织(根、茎、叶、花、果实)，参照实施例1-(1)方法进行总RNA提取及其逆转录反应。实时荧光定量PCR反应根据AvbHLH3基因分别设计上游引物(SEQ IDNO.5)和下游引物(SEQ ID NO.6)，根据AvBPPS基因分别设计上游引物(SEQ ID NO.7)和下游引物(SEQ ID NO.8)，采用SYBR Premix Ex Taq^TM Kit(Takara公司,货号:DRR420A)进行实时荧光定量PCR扩增。反应程序为95℃变性2min，随后进行40个循环反应(95℃15s,60℃1min)。反应在

480Instrument实时荧光定量PCR(罗氏诊断公司,德国曼海姆)运行后得到数据，运用2^-ΔΔCT方法计算各个样品的相对表达量数据。内参为阳春砂β-actin基因，上游引物如SEQ ID NO.9所示，下游引物如SEQ ID NO.10所示。

结果表明，阳春砂AvbHLH3基因在阳春砂的根、茎、叶、花和果实中均有表达，尤其在果实中表达最高。类似的，阳春砂萜类合酶基因AvBPPS也在阳春砂的根、茎、叶、花和果实中均有表达，尤其在果实中表达最高(图5)。在阳春砂的不同组织中，AvbHLH3的表达量与AvBPPS的表达量呈现明显的正相关(R²＝0.93,p<0.01)，因此，阳春砂AvbHLH3与乙酸龙脑酯的生物合成密切相关。

实施例3阳春砂挥发油中乙酸龙脑酯含量分析

阳春砂挥发油中乙酸龙脑酯含量测定按照《中华人民共和国药典》砂仁项下进行，将200mg阳春砂根、茎、叶、花和果实分别在液氮下研磨成粉，加入正己烷1.5mL，冰水浴中超声处理30min，随后置于55℃水浴1h。10000×g离心10min，并吸取上清液转移至1.5mL样品瓶中，用于检测。

通过装有HP5-MS石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm,美国Supelco公司)的气相色谱-质谱检测器(GC-MS,QP2010SE,日本岛津公司)进行测定分析。使用氦气作为载气，流速为1mL min^-1。进样口温度为230℃，采用10：1分流模式。GC温度从35℃开始保持5min，以12℃min^-1升温至300℃，保持5min。质谱检测采用全扫描模式，扫描范围为40到600m/z。采用质谱库NIST-8(NIST/EPA/NIH,美国)和乙酸龙脑酯标准品(Sigma-Aldrich公司,货号:W216003)进行物质鉴别。

结果发现，乙酸龙脑酯在阳春砂的根、茎、叶、花和果实中含量明显不同，在果实挥发油中的乙酸龙脑酯含量最高(图6,7)。这与转录因子AvbHLH3基因的表达量呈显著正相关(R²＝0.94,p<0.01)，同时与萜类合酶基因AvBPPS的表达量呈显著正相关(R²＝0.92,p<0.01)。因此，在阳春砂的不同组织中，AvbHLH3与乙酸龙脑酯的差异积累密切相关。

实施例5阳春砂转录因子AvbHLH3定位于细胞核中

(1)YFP-AvbHLH3载体构建

依据引物对SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12，利用PCR技术扩增获得去除终止密码子的AvbHLH3，PCR体系及反应程序与实施例1-(2)一致。将亚细胞定位载体pSAT6-NYFP-N1在Nco I位点酶切后，采用

HD Cloning Kit试剂盒连接亚细胞定位载体和转录因子AvbHLH3，阳性克隆通过测序鉴定。

(2)PEG介导的拟南芥叶片原生质体瞬时表达AvbHLH3

配制原生质体酶解液(1.5％Cellulose R10,0.3％Macerozyme,0.1M MES,20mMKCl,0.4M Mannitol,pH 5.7)，55℃水浴10min，倒入培养皿中，自然冷却至室温后，每10mL原生质体酶解液加入100μL 1M CaCl₂和100μL 10％BSA。选择生长状态良好、叶龄为3-4周的拟南芥叶片，用透明胶带撕掉下表皮后放到含上述原生质体酶解液的培养皿中，恒温培养箱中22℃光照条件下50rpm，3h。用去掉尖头的1mL枪头，将含有原生质体的酶解液转移到15mL圆底离心管中，4℃100×g离心3min，缓慢地吸掉上清液，重复2-3次。用4-5mL W5solution(154Mm NaCl,125mM CaCl₂,5mM KCl,0.03％MES,5mM葡萄糖,pH 5.7)沿着管壁缓慢加入，轻轻晃动摇匀，清洗沉淀的原生质体，4℃100×g离心3min，缓慢地吸掉上清。加入2mL W5 solution，冰上静置30min，4℃100×g离心3min，弃上清，加入2mL MMG solution(15mM MgCl₂,0.1％MES,0.4Mannitol,pH 5.7)，轻轻重悬，冰上备用。在1.5mL离心管中依次加入AvbHLH3质粒10μg，拟南芥原生质体200μL，PEG Solution(40％PEG4000,0.2Mannitol,0.1M CaCl₂)210μL，W5 solution 840μL，上下颠倒混匀。4℃100×g离心2min，弃上清，重复一次。加入200μL W5 solution，立即混匀，用锡纸包裹，黑暗条件下22℃平放16h。采用Leica TCS SP8 STED 3×microscope(德国徕卡公司)激光共聚焦扫描显微镜观察黄色荧光蛋白。

根据pLoc-mPlant亚细胞定位预测软件，阳春砂AvbHLH3蛋白预测定位于细胞核中。实验验证表明，阳春砂AvbHLH3蛋白确实定位于细胞核中(图8)。

实施例4在阳春砂叶片中过表达AvbHLH3促进乙酸龙脑酯的生成

(1)阳春砂转录因子AvbHLH3超表达载体的构建

根据转录因子AvbHLH3的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，分别在BamH I和Nco I酶切位点设计上游引物(SEQ ID NO.13)和下游引物(SEQ ID NO.14)。以阳春砂果实cDNA为模板，高保真扩增获得AvbHLH3序列，同时用BamH I和Nco I双酶切表达载体pCAMBIA3300(图9)，采用

HD Cloning Kit试剂盒(Takara公司,货号:639648)构建AvbHLH3超表达载体，将此植物重组表达载体命名为pCAMBIA3300-AvbHLH3(图10)。

(2)重组质粒pCAMBIA3300-AvbHLH3转化到农杆菌GV3101(pSoup-p19)

采用热激法将pCAMBIA3300-AvbHLH3转化到农杆菌GV3101(pSoup-p19)中，具体操作步骤如下：1μg重组质粒pCAMBIA3300-AvbHLH3与100μL农杆菌GV3101(pSoup-p19)感受态细胞混匀，冰上放置5min，液氮速冻5min，迅速转到37℃水浴保温5min，之后冰上放置5min。加入700μL不含抗生素的LB培养基，在28℃摇床上，100rpm转速中培养2-3h。将培养物涂布到25mL LB平板(培养基中含50mg·mL^-1卡那霉素)。将平板倒置放在28℃的培养箱中培养，直至菌落长出(约2天)，挑取阳性克隆进行后续实验。

(3)阳春砂叶片中瞬时过表达AvbHLH3

挑取含有pCAMBIA3300-AvbHLH3的阳性克隆于100mL LB液体培养基中(含50mg·mL^-1卡那霉素)，28℃、180rpm振荡培养过夜(约16h)，至OD₆₀₀＝0.6～0.8。室温5000×g离心5min收集菌液。用100mL渗透缓冲液(0.2mM乙酰丁香酮,10mM MgCl₂,10mM MES,pH 5.7)重悬沉淀的农杆菌，室温5000×g离心5min，弃上清，用渗透缓冲液调节OD₆₀₀≈0.6，25℃室温避光静置活化2h。选择阳春砂幼嫩叶片(自顶端向下第3～5叶)，用1mL注射器吸取活化菌液注射到叶背中，直至菌液刚好渗出为止。在23±2℃组培室黑暗培养24h后，在光照条件下培养2d，采用半定量PCR法筛选阳性植株用于后续实验。以相同位置阳春砂幼嫩叶片(自顶端向下第3～5叶)作为对照。

结果表明，与对照相(Mock)比较，过表达AvbHLH3的阳春砂叶片(OE-AvBHLH3)中，萜类合酶基因AvBPPS的表达量上调了6.37倍，挥发油中的乙酸龙脑酯含量增加了2.35倍(图11)。因此，阳春砂AvbHLH3可以通过转录激活萜类合酶基因AvBPPS的表达，进而增加挥发油中的乙酸龙脑酯的积累。

实施例6 AvbHLH3通过G-box与AvBPPS启动子相结合，并激活AvBPPS表达

(1)JG4-5-AvbHLH3重组载体构建

依据引物对SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，利用PCR技术扩增获得去除终止密码子的AvbHLH3，PCR体系及反应程序与实施例1-(2)一致。将JG4-5载体在EcoR I和Xho I位点双酶切，采用

HD Cloning Kit试剂盒连接JG4-5和AvbHLH3，获得JG4-5-AvbHLH3重组载体，阳性克隆通过测序鉴定。

(2)pLACzi-AvBPPSp重组载体构建

依据引物对SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18，利用PCR技术扩增获得含EcoR I和XhoI双酶切位点的AvBPPSp序列(AvBPPS基因启动子，即AvBPPSp的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示)，PCR体系及反应程序与实施例1-(2)一致。将pLACzi载体在EcoR I和Xho I位点双酶切，采用

HD Cloning Kit试剂盒连接pLACzi和AvBPPSp，获得pLACzi-AvBPPSp重组载体，具体操作方法详见说明书，阳性克隆通过测序鉴定。

(3)EGY48酵母转化及结合验证

取100μL冰上融化的EGY48感受态细胞(上海唯地生物技术有限公司,货号:YC1030)，加入5μg JG4-5-AvbHLH3重组质粒，5μg pLACzi-AvBPPSp重组质粒，10μL CarrierDNA，500μL PEG/LiAc，混匀，30℃水浴30min(期间混匀6-8次)。转移至42℃水浴15min(期间混匀6-8次)。5000×g离心1min，弃上清，400μL ddH₂O重悬，5000×g离心1min，弃上清。50μLddH₂O重悬，涂板至SD/-Trp/-Ura/-Ade板中，29℃培养48-96h。

(4)pGreen II 62-SK-AvbHLH3重组载体构建

依据引物对SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20，利用PCR技术扩增获得去除终止密码子的AvbHLH3，PCR体系及反应程序与实施例1-(2)一致。将Effecter载体pGreen II 62-SK在BamH I和Hind III位点双酶切，采用

HD Cloning Kit试剂盒连接pGreen II62-SK和转录因子AvbHLH3，获得pGreen II 62-SK-AvbHLH3重组载体，阳性克隆通过测序鉴定。

(5)pGreen II 0800-AvBPPSp重组载体构建

根据铁皮石斛基因组数据，挖掘AvBPPS基因的启动子序列(AvBPPSp)，设计上游引物SEQ ID NO.21和下游引物SEQ ID NO.22，以阳春砂DNA为模板，克隆得到AvBPPS的启动子序列AvBPPSp如SEQ ID NO.23所示。利用启动子在线软件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析AvBPPSp，发现在-188至-193位置存在bHLH结合位点G-box(CACGTG)。

依据引物SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25，利用PCR技术扩增获得含BamH I和HindIII双酶切位点的AvBPPSp序列，PCR体系及反应程序与实施例1-(2)一致。将Reporter载体pGreen II 0800-LUC在BamH I和Hind III位点双酶切，采用

HD Cloning Kit试剂盒连接pGreen II 0800和AvBPPSp，获得pGreen II 0800-AvBPPSp重组载体，阳性克隆通过测序鉴定。

(6)重组质粒转化到农杆菌GV3101(pSoup-p19)

采用热激法将pGreen II 62-SK-AvbHLH3和pGreen II 0800-AvBPPSp分别转化到GV3101(pSoup-p19)中，方法与实施例4-(2)一致，阳性克隆通过测序鉴定。

(7)农杆菌侵染本氏烟草叶片及LUC/REN荧光检测

配制渗透缓冲液(0.2mM乙酰丁香酮,10mM MgCl₂,10mM MES,pH 5.7)。含有pGreenII62-SK-AvbHLH3和pGreen II 0800-AvBPPSp的GV3101(pSoup-p19)农杆菌用上述渗透液悬浮后分别调整OD₆₀₀＝0.8，28℃避光静置活化2h。选取长势良好的烟草叶片，按启动子与转录因子1：9的比例，共同转化本氏烟草叶片，需做6个重复以上并做好标记，以空载为对照。16h光照/8h黑暗培养间23℃培养3天后，用

Reporter Assay System试剂盒(Promega公司,货号:E1910)检测烟草叶片中的两种荧光素酶(LUC和REN)的比值。

结果表明，在Adenine(Ade)浓度为100ng mL^-1的SD-Ade/-Trp/-Ura板上，共转pLacZi空载与JG4-5-AvbHLH3后，EGY48酵母菌未生长，而共转pLacZi-AvBPPSp(含AvBPPSp启动子的质粒)与JG4-5-AvbHLH3后，EGY48酵母菌可正常生长(图12A)。进而，将AvBPPSp序列中-188至-193区域的G-box位点突变后，重新构建pLACzi-AvBPPSpm重组载体，方法与上述实施例6-(2)一致，分析AvBPPS启动子突变后pLACzi-AvBPPSpm与JG4-5-AvbHLH3的结合情况，结果表明，共转pLACzi-AvBPPSpm与JG4-5-AvbHLH3，EGY48酵母菌未生长(图12A)，因此，AvbHLH3通过G-box(CACGTG)位点与AvBPPS相结合。

烟草叶片双荧光素酶测试结果表明，AvbHLH3能够显著激活DoTPS10启动子AvBPPS的活性，与对照空载相比较，转录激活倍数达到4.59倍(图12B)。

具体序列表信息如下：

>AvbHLH3核苷酸序列(SEQ ID NO.1)

ATGGCGGTGGCTGAGATTTGGTCCGACGAGGACCGGAAAATGGCGATCGCAGTGCTCGGACGGGAGGCGTTCGAGTACATCCGCGCTCGCCATGTGGCTTCCTTCGACGGGCAACTCACCGCCGTCGGCGTCGGCGGCGCGGATCTCCAGACCAAGCTCCAGGACTTCGTCGAGAAACCGCCTTCGGCAGGTGGCGGTTGGGCCTACGCCATATTCTGGCAGATAGCGCGGTCTGCTTCCGGGGATCTCGTCCTCGGTTGGGGAGACGGCCACTGCCGCGAGCTGGGCGATGGAGAGGATGCCGGCGGCGATCCGGTAGGCGGTGGGAGCCAGAAGATGCGGAAGCGGGTGCTCGAGCGGCTCCATGCGCTATCCGGGGGGTCGGAAGATGAGAATTACGCGCTCCGGCTTGACCGTATCACGGGCGCGGAGATTTACTTCCTTGCGTCCATGTACTTCTCGTTCCCTAAAGGCAAGGATGCTCCAGGAAGGGCGCTTGCTTCAGAGAAGCACATATGGATATCTGAGGCGGAATTGAGGTCGCCCGGATGCTCCAATTACTGCGTGCGTGCGCATCTCGCGAGGTCGGCGGGGTTCCGCACCATCGTCTTCGTGCCGTGTGATGCAGGCGTTCTGGAATTGGGATCGGTGAATGCGTTGTCAGAGAGTTACGAGGCGCTACAGATGATCAGATCCATCTTCGGTCAGGGCTACGTGAAGGCGACTACGGTGATCGGGGAAAAGACAGACGAAAACGTTGATCCAACTTTTGCTTCCTGCGCTGGTACAGGCAATCAGGTCGCCGAGTTTCCGAAGATATTTGGGAAGGATTTGAGCATTAGCCGGTCCAACGTCAACGAAAGGAACCCGAGCCTGAAGAAAGATCTGCTTCCAATTGGTATAATAGCAGAGCACGGCGATCGCCGTCCAAAGAGCCACCCTTTCGACAACGGTGCTACTGTGTTTCCATGGAATCAAAGCGACTCCATTAACTCTCTTCAGCAGATATTGTGTAAAGGATCACCATCTATTCGACAAATTGACGGAGTCATCGGTGGTGACTCGCCGCTCAACCAACTCCCACAGAAGCAGCAGCATCCACTGCTGCAAAAGCAGCACCAGCAACTGCATTCACGCCCACTGCCACCGTCGAGCCAAATTGATTTCAGCACAGGGGCGTTGGCAAATGCTCCTTCTACTAGCCTATTTACCGACCGTTCTCGGGCAGCTGACTCTGAGCTCTCTGACGTCGAGCTTCCGTCTAAAGAAGACAAAGCAGGCACAATGGAAGAGCGCAGACCAAGAAAGAGGGGTCGGAAGCCAGCAAACGGCAGGGAAGAGCCGCTGAACCACGTGGAAGCTGAGCGCCAGAGAAGGGAGAAACTTAACCAGAAGTTTTACGCCTTGAGAGCTGTGGTGCCTAACATCTCGAAGATGGACAAGGCCTCCCTGCTCGGGGATGCCATATCTTACATCACTGAGCTCCAGAAGAAACTCAAGGAGATGGAGGCAGAGAGGGAGACGTGGGGTGATCCATCATTCATGGACTACAAACATCAGCAGCCTCATTGTCCCGAGGTTGATATCCAATCAGCCCTGGATGAGGTATTTGTTCAAGTGAGTTGCCCTCTAGAGAAGCACCCTGTCTCCAAGGTCATTCAAATTTTCAGAGATTCACAGATCGATGTGGTGGACTCCAAGGTTTCTGCTTCTTCTGACACCGTCCTTCATACTTTCATAGTGAAGTCCCCTGGAACTGAGCAACTCACCAAGGAGAAGTTAATGGCTGCTCTAACCCATGAATTGAGCCATGCATGA

AvbHLH3核苷酸序列扩增引物

上游引物(SEQ ID NO.2)

ATGGCGGTGGCTGAGATT

下游引物(SEQ ID NO.3)

TGCATGGCTCAATTCATGG

>AvbHLH3氨基酸序列(SEQ ID NO.4)

MAVAEIWSDEDRKMAIAVLGREAFEYIRARHVASFDGQLTAVGVGGADLQTKLQDFVEKPPSAGGGWAYAIFWQIARSASGDLVLGWGDGHCRELGDGEDAGGDPVGGGSQKMRKRVLERLHALSGGSEDENYALRLDRITGAEIYFLASMYFSFPKGKDAPGRALASEKHIWISEAELRSPGCSNYCVRAHLARSAGFRTIVFVPCDAGVLELGSVNALSESYEALQMIRSIFGQGYVKATTVIGEKTDENVDPTFASCAGTGNQVAEFPKIFGKDLSISRSNVNERNPSLKKDLLPIGIIAEHGDRRPKSHPFDNGATVFPWNQSDSINSLQQILCKGSPSIRQIDGVIGGDSPLNQLPQKQQHPLLQKQHQQLHSRPLPPSSQIDFSTGALANAPSTSLFTDRSRAADSELSDVELPSKEDKAGTMEERRPRKRGRKPANGREEPLNHVEAERQRREKLNQKFYALRAVVPNISKMDKASLLGDAISYITELQKKLKEMEAERETWGDPSFMDYKHQQPHCPEVDIQSALDEVFVQVSCPLEKHPVSKV

IQIFRDSQIDVVDSKVSASSDTVLHTFIVKSPGTEQLTKEKLMAALTHELSHA

AvbHLH3所采用的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)引物

上游引物(SEQ ID NO.5):

GGGTCGGAAGATGAGAATTACG

下游引物(SEQ ID NO.6):

TGGAGCATCCTTGCCTTTAG

AvBPPS所采用的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)引物

上游引物(SEQ ID NO.7):

CGTCGACAGATGGGACTTAAC

下游引物(SEQ ID NO.8):

CATCACCCGGTAACCTTCTTC

内参基因β-actin所采用的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)引物

上游引物(SEQ ID NO.9):

GTTCTTAGTGGCGGTTCAA

下游引物(SEQ ID NO.10):

AGCAGGACCAGATTCTTCAT

YFP-AvbHLH3载体构建所用引物

上游引物(SEQ ID NO.11):

ATTTACGAACGATAGCCATGGCTATGGCGGTGGCTGAGATT

下游引物(SEQ ID NO.12):

AGATCTGAGTCCGGACCATGGTTGCATGGCTCAATTCATGG

重组质粒pCAMBIA3300-AvbHLH3构建所用引物

上游引物(SEQ ID NO.13):

CGGTACCCGGGGATCCATGGCGGTGGCTGAGATTTG

下游引物(SEQ ID NO.14):

CCCTTGCTCACCATGGTGCATGGCTCAATTCATGGG

JG4-5-AvbHLH3重组载体构建所用引物

上游引物(SEQ ID NO.15):

TGCCTCTCCCGAATTCATGGCGGTGGCTGAGATTTG

下游引物(SEQ ID NO.16):

TCCAAAGCTTCTCGAGTGCATGGCTCAATTCATGGG

pLACzi-AvBPPSp重组载体构建所用引物

上游引物(SEQ ID NO.17):

TGAAAAGCTTGAATTCATGGCGGTGGCTGAGATTTG

下游引物(SEQ ID NO.18):

GAGCACATGCCTCGAGTGCATGGCTCAATTCATGGG

pGreen II 62-SK-AvbHLH3重组载体构建所用引物

上游引物(SEQ ID NO.19):

TAGAACTAGTGGATCCATGGCGGTGGCTGAGATTTG

下游引物(SEQ ID NO.20):

CGGTATCGATAAGCTTTGCATGGCTCAATTCATGGG

AvBPPS基因启动子序列扩增所用引物

上游引物(SEQ ID NO.21):

AATTTAATGACAGAGTTG

下游引物(SEQ ID NO.22):

ACCTTCTTCAGACACCCG

>AvBPPS基因启动子(即AvBPPSp)序列(SEQ ID NO.23)

AATTTAATGACAGAGTTGACTGATTTTACTCCACAATTCCAGAAGATAAAAACAAACACAATCTTGCAAACAGATAAGCGCCAAATTATAGTTGGCCACGTCACGGAGAATCTACGGATTCCTCCTGCTCCGGCGGATGCAGCGCTTTGTAAGTCGCGTATCCGGACGCCGCTGGCGCCTTATCCGTCGCCCCGTCTGCCACCGCCCAAGCGTCCTTCTTTTCCGTCTCCAGCTCCTCCGCAGGGAGGCCACAGCCGCAGGGGTCGTATTGTGCGTTGGGACACACGGGCTTCGGCAGCTTCAAGAACCGCTCGCAGTCTGCGGCCGACCGCTGTCCCGGCAATCCCGGAATACAGTTCTTCTTCACGTGCAACACATGGCATTTGATCAGCTCGACGCAGCTCTTCCCCACCGACGTGAAGTAGTTGTCGGAGAGCGAGAGGTTCACCAGGTTGCCGCCTTTCATGGATTTCGCCAGTCGGCAGACGGCATCAGGCACCTCGCCGGAGAGAAAGTTTCCGGCGAGATTGAGCTGCTCCACCTTCTTCAGACACCCG

pGreen II 0800-AvBPPSp重组载体构建所用引物

上游引物(SEQ ID NO.24):

CGGTATCGATAAGCTTAATTTAATGACAGAGTTGACTGATT

下游引物(SEQ ID NO.25):

TAGAACTAGTGGATCCCGGGTGTCTGAAGAAGGTGGA

序列表

<110> 中国科学院华南植物园

<120> 一个参与阳春砂乙酸龙脑酯合成调控的转录因子AvbHLH3及其应用

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1818

<212> DNA

<213> 阳春砂(Amomum villosum)

<400> 1

atggcggtgg ctgagatttg gtccgacgag gaccggaaaa tggcgatcgc agtgctcgga 60

cgggaggcgt tcgagtacat ccgcgctcgc catgtggctt ccttcgacgg gcaactcacc 120

gccgtcggcg tcggcggcgc ggatctccag accaagctcc aggacttcgt cgagaaaccg 180

ccttcggcag gtggcggttg ggcctacgcc atattctggc agatagcgcg gtctgcttcc 240

ggggatctcg tcctcggttg gggagacggc cactgccgcg agctgggcga tggagaggat 300

gccggcggcg atccggtagg cggtgggagc cagaagatgc ggaagcgggt gctcgagcgg 360

ctccatgcgc tatccggggg gtcggaagat gagaattacg cgctccggct tgaccgtatc 420

acgggcgcgg agatttactt ccttgcgtcc atgtacttct cgttccctaa aggcaaggat 480

gctccaggaa gggcgcttgc ttcagagaag cacatatgga tatctgaggc ggaattgagg 540

tcgcccggat gctccaatta ctgcgtgcgt gcgcatctcg cgaggtcggc ggggttccgc 600

accatcgtct tcgtgccgtg tgatgcaggc gttctggaat tgggatcggt gaatgcgttg 660

tcagagagtt acgaggcgct acagatgatc agatccatct tcggtcaggg ctacgtgaag 720

gcgactacgg tgatcgggga aaagacagac gaaaacgttg atccaacttt tgcttcctgc 780

gctggtacag gcaatcaggt cgccgagttt ccgaagatat ttgggaagga tttgagcatt 840

agccggtcca acgtcaacga aaggaacccg agcctgaaga aagatctgct tccaattggt 900

ataatagcag agcacggcga tcgccgtcca aagagccacc ctttcgacaa cggtgctact 960

gtgtttccat ggaatcaaag cgactccatt aactctcttc agcagatatt gtgtaaagga 1020

tcaccatcta ttcgacaaat tgacggagtc atcggtggtg actcgccgct caaccaactc 1080

ccacagaagc agcagcatcc actgctgcaa aagcagcacc agcaactgca ttcacgccca 1140

ctgccaccgt cgagccaaat tgatttcagc acaggggcgt tggcaaatgc tccttctact 1200

agcctattta ccgaccgttc tcgggcagct gactctgagc tctctgacgt cgagcttccg 1260

tctaaagaag acaaagcagg cacaatggaa gagcgcagac caagaaagag gggtcggaag 1320

ccagcaaacg gcagggaaga gccgctgaac cacgtggaag ctgagcgcca gagaagggag 1380

aaacttaacc agaagtttta cgccttgaga gctgtggtgc ctaacatctc gaagatggac 1440

aaggcctccc tgctcgggga tgccatatct tacatcactg agctccagaa gaaactcaag 1500

gagatggagg cagagaggga gacgtggggt gatccatcat tcatggacta caaacatcag 1560

cagcctcatt gtcccgaggt tgatatccaa tcagccctgg atgaggtatt tgttcaagtg 1620

agttgccctc tagagaagca ccctgtctcc aaggtcattc aaattttcag agattcacag 1680

atcgatgtgg tggactccaa ggtttctgct tcttctgaca ccgtccttca tactttcata 1740

gtgaagtccc ctggaactga gcaactcacc aaggagaagt taatggctgc tctaacccat 1800

gaattgagcc atgcatga 1818

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcggtgg ctgagatt 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcatggctc aattcatgg 19

<210> 4

<211> 605

<212> PRT

<213> 阳春砂(Amomum villosum)

<400> 4

Met Ala Val Ala Glu Ile Trp Ser Asp Glu Asp Arg Lys Met Ala Ile

1 5 10 15

Ala Val Leu Gly Arg Glu Ala Phe Glu Tyr Ile Arg Ala Arg His Val

20 25 30

Ala Ser Phe Asp Gly Gln Leu Thr Ala Val Gly Val Gly Gly Ala Asp

35 40 45

Leu Gln Thr Lys Leu Gln Asp Phe Val Glu Lys Pro Pro Ser Ala Gly

50 55 60

Gly Gly Trp Ala Tyr Ala Ile Phe Trp Gln Ile Ala Arg Ser Ala Ser

65 70 75 80

Gly Asp Leu Val Leu Gly Trp Gly Asp Gly His Cys Arg Glu Leu Gly

85 90 95

Asp Gly Glu Asp Ala Gly Gly Asp Pro Val Gly Gly Gly Ser Gln Lys

100 105 110

Met Arg Lys Arg Val Leu Glu Arg Leu His Ala Leu Ser Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Asp Glu Asn Tyr Ala Leu Arg Leu Asp Arg Ile Thr Gly Ala Glu

130 135 140

Ile Tyr Phe Leu Ala Ser Met Tyr Phe Ser Phe Pro Lys Gly Lys Asp

145 150 155 160

Ala Pro Gly Arg Ala Leu Ala Ser Glu Lys His Ile Trp Ile Ser Glu

165 170 175

Ala Glu Leu Arg Ser Pro Gly Cys Ser Asn Tyr Cys Val Arg Ala His

180 185 190

Leu Ala Arg Ser Ala Gly Phe Arg Thr Ile Val Phe Val Pro Cys Asp

195 200 205

Ala Gly Val Leu Glu Leu Gly Ser Val Asn Ala Leu Ser Glu Ser Tyr

210 215 220

Glu Ala Leu Gln Met Ile Arg Ser Ile Phe Gly Gln Gly Tyr Val Lys

225 230 235 240

Ala Thr Thr Val Ile Gly Glu Lys Thr Asp Glu Asn Val Asp Pro Thr

245 250 255

Phe Ala Ser Cys Ala Gly Thr Gly Asn Gln Val Ala Glu Phe Pro Lys

260 265 270

Ile Phe Gly Lys Asp Leu Ser Ile Ser Arg Ser Asn Val Asn Glu Arg

275 280 285

Asn Pro Ser Leu Lys Lys Asp Leu Leu Pro Ile Gly Ile Ile Ala Glu

290 295 300

His Gly Asp Arg Arg Pro Lys Ser His Pro Phe Asp Asn Gly Ala Thr

305 310 315 320

Val Phe Pro Trp Asn Gln Ser Asp Ser Ile Asn Ser Leu Gln Gln Ile

325 330 335

Leu Cys Lys Gly Ser Pro Ser Ile Arg Gln Ile Asp Gly Val Ile Gly

340 345 350

Gly Asp Ser Pro Leu Asn Gln Leu Pro Gln Lys Gln Gln His Pro Leu

355 360 365

Leu Gln Lys Gln His Gln Gln Leu His Ser Arg Pro Leu Pro Pro Ser

370 375 380

Ser Gln Ile Asp Phe Ser Thr Gly Ala Leu Ala Asn Ala Pro Ser Thr

385 390 395 400

Ser Leu Phe Thr Asp Arg Ser Arg Ala Ala Asp Ser Glu Leu Ser Asp

405 410 415

Val Glu Leu Pro Ser Lys Glu Asp Lys Ala Gly Thr Met Glu Glu Arg

420 425 430

Arg Pro Arg Lys Arg Gly Arg Lys Pro Ala Asn Gly Arg Glu Glu Pro

435 440 445

Leu Asn His Val Glu Ala Glu Arg Gln Arg Arg Glu Lys Leu Asn Gln

450 455 460

Lys Phe Tyr Ala Leu Arg Ala Val Val Pro Asn Ile Ser Lys Met Asp

465 470 475 480

Lys Ala Ser Leu Leu Gly Asp Ala Ile Ser Tyr Ile Thr Glu Leu Gln

485 490 495

Lys Lys Leu Lys Glu Met Glu Ala Glu Arg Glu Thr Trp Gly Asp Pro

500 505 510

Ser Phe Met Asp Tyr Lys His Gln Gln Pro His Cys Pro Glu Val Asp

515 520 525

Ile Gln Ser Ala Leu Asp Glu Val Phe Val Gln Val Ser Cys Pro Leu

530 535 540

Glu Lys His Pro Val Ser Lys Val Ile Gln Ile Phe Arg Asp Ser Gln

545 550 555 560

Ile Asp Val Val Asp Ser Lys Val Ser Ala Ser Ser Asp Thr Val Leu

565 570 575

His Thr Phe Ile Val Lys Ser Pro Gly Thr Glu Gln Leu Thr Lys Glu

580 585 590

Lys Leu Met Ala Ala Leu Thr His Glu Leu Ser His Ala

595 600 605

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gggtcggaag atgagaatta cg 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggagcatcc ttgcctttag 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgtcgacaga tgggacttaa c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

catcacccgg taaccttctt c 21

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gttcttagtg gcggttcaa 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agcaggacca gattcttcat 20

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atttacgaac gatagccatg gctatggcgg tggctgagat t 41

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agatctgagt ccggaccatg gttgcatggc tcaattcatg g 41

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cggtacccgg ggatccatgg cggtggctga gatttg 36

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cccttgctca ccatggtgca tggctcaatt catggg 36

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgcctctccc gaattcatgg cggtggctga gatttg 36

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tccaaagctt ctcgagtgca tggctcaatt catggg 36

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgaaaagctt gaattcatgg cggtggctga gatttg 36

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gagcacatgc ctcgagtgca tggctcaatt catggg 36

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tagaactagt ggatccatgg cggtggctga gatttg 36

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cggtatcgat aagctttgca tggctcaatt catggg 36

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aatttaatga cagagttg 18

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

accttcttca gacacccg 18

<210> 23

<211> 557

<212> DNA

<213> 阳春砂(Amomum villosum)

<400> 23

aatttaatga cagagttgac tgattttact ccacaattcc agaagataaa aacaaacaca 60

atcttgcaaa cagataagcg ccaaattata gttggccacg tcacggagaa tctacggatt 120

cctcctgctc cggcggatgc agcgctttgt aagtcgcgta tccggacgcc gctggcgcct 180

tatccgtcgc cccgtctgcc accgcccaag cgtccttctt ttccgtctcc agctcctccg 240

cagggaggcc acagccgcag gggtcgtatt gtgcgttggg acacacgggc ttcggcagct 300

tcaagaaccg ctcgcagtct gcggccgacc gctgtcccgg caatcccgga atacagttct 360

tcttcacgtg caacacatgg catttgatca gctcgacgca gctcttcccc accgacgtga 420

agtagttgtc ggagagcgag aggttcacca ggttgccgcc tttcatggat ttcgccagtc 480

ggcagacggc atcaggcacc tcgccggaga gaaagtttcc ggcgagattg agctgctcca 540

ccttcttcag acacccg 557

<210> 24

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cggtatcgat aagcttaatt taatgacaga gttgactgat t 41

<210> 25

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tagaactagt ggatcccggg tgtctgaaga aggtgga 37

Claims (10)

1.一个参与阳春砂乙酸龙脑酯生物合成调控的转录因子AvbHLH3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.编码权利要求1所述的转录因子AvbHLH3蛋白的参与阳春砂乙酸龙脑酯生物合成调控的转录因子AvbHLH3。

3.根据权利要求2所述的参与阳春砂乙酸龙脑酯生物合成调控的转录因子AvbHLH3，其特征在于，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

4.一种含有权利要求2或3所述的转录因子AvbHLH3的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述的载体为pCAMBIA3300。

6.一种含有权利要求2或3所述的转录因子AvbHLH3的重组载体的重组微生物。

7.根据权利要求6所述的微生物，其特征在于，所述微生物是农杆菌GV3101(pSoup-p19)菌株。

8.权利要求2或3所述的转录因子AvbHLH3在促进阳春砂中乙酸龙脑酯的生物合成中的应用。

9.权利要求2或3所述的转录因子AvbHLH3在促进萜类合酶基因AvBPPS表达中的应用。

10.权利要求2或3所述的转录因子AvbHLH3在阳春砂改良育种中的应用，所述应用为转录因子AvbHLH3在阳春砂挥发油品质改善的基因工程育种中的应用。

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