KR100952959B1

KR100952959B1 - 병풀 모상근으로부터 아시아티코사이드의 생산 방법

Info

Publication number: KR100952959B1
Application number: KR1020080003812A
Authority: KR
Inventors: 김옥태; 황백; 이현용; 방경환; 김영창; 현동윤; 차선우; 성낙술
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2008-01-14
Filing date: 2008-01-14
Publication date: 2010-04-15
Also published as: KR20090078050A

Abstract

본 발명은 병풀의 유용물질인 아시아티코사이드가 합성되지 않는 모상근으로부터 그 물질을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다. 본 발명에서 병풀의 잎절편체를 이용하여 고효율의 모상근 유도방법과 유도된 모상근 생장은 다른 기관을 배양하는 것 보다 우수하나 아시아티코사이드가 생합성 되지 않는 단점을 극복하기위해 메틸자스모네이트란 유인제를 처리에 의해 모상근으로부터 아시아티코사이드을 고함량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

병풀, 모상근, 아시아티코사이드

Description

병풀 모상근으로부터 아시아티코사이드의 생산 방법{A method of asiaticoside production from Centella asiatica (L.) Urban hairy roots}

본 발명은 병풀로부터 모상근을 효율적으로 유도함으로써 병풀의 유용물질인 아시아티코사이드가 합성되지 않는 모상근으로부터 그 물질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 병풀 조직을 아그로박테리움으로 처리하여 모상근을 유도하여 생장이 우수한 라인을 선발한 후 이들 배양체에 메틸자스모네이트를 일정기간 처리함으로써 아시아티코사이드 함량을 증가시키는 방법이다.

병풀[Centella asiatica (L.) Urban]은 산형과에 속하는 다년생 포복성 초본으로, 센텔라사포닌, 아시아티코사이드, 마데카소사이드, 세폴코사이드 등과 같은 유용한 약리성분을 함유하고 있으며, 그 중 주요 생리활성을 보이는 아시아티코사이드는 항염증 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

국내에서 의약품, 화장품, 기능성 식품 등의 분야에서 병풀을 사용하고 있지만 자생지가 제한되어 있으며, 번식 또한 활발하지 못하여 자생상태에서 채취하여 이용하는 데는 근본적으로 제한되어 있어 국외로부터 전량수입에 의존하는 실정이다.

기존에는 대량 증식 방법으로써, 측아의 미세번식과 배 발생 및 체세포 캘러스 배양을 통한 병풀 재분화 방법이 확립되었다. 또한, 병물 식물체를 아그로박테리움 리조제네스로 형질전환 시켜 성장 속도가 빠른 모상근을 유도하였으나, 형질전환된 이들 모상근에는 아시아티코사이드의 량이 야생에 서식하는 병풀에 비해 낮은 수준이라고 보고되어 병풀 식물체의 유용물질인 아시아티코사이드 생산에 있어서 유용한 방법이 되지 못하고 있다(Beak, 1997, 전남대 박사학위논문). 모상근 배양은 다른 식물조직의 배양체 생장보다 훨씬 빠르기 때문에 유용물질 생산을 위한 재료로써 사용되어 왔다. 아시아티코사이드 생산을 위한 병풀로부터 모상근 유도는 수행되었지만(Aziz et al. 2007 Biolgia Plantarum 51:34-42) 모상근을 생산하는데 있어 효율이 낮을 뿐만 아니라 아시아티코사이드와 같은 트리터르펜 화합물의 생산능은 잎의 합성량의 1/12 수준이어서 활용가치가 없었다.

최근 아시아티코사이드 합성에 관여하는 유전자들이 클로닝 되어 병풀의 트리터르펜 생합성 연구가 활발히 수행되어 왔다(Kim et al. 2005a, Mol. Cells, 19:294-299; 2005b J. Plant Biol, 48:263-269; 2005c Biotechnol. Bioprocess Eng, 10:16-22; 2005d Plant Cell Rep. 24:304-311). 아시아티코사이드의 전구체를 합성하는 CabAS(C. asiatica beta-amyrin synthase) 유전자가 클로닝 및 기능이 규명 되어 트리터르펜 생합성 메카니즘 연구에 활용되고 있다.

병풀에 관한 기존 특허로는 병풀식물체 배양방법으로 전초(whole plant)를 액체배지에서 배양한 후 메틸자스모네이트를 처리하여 아시아티코사이드를 증가시키는 방법(대한민국 등록특허 0449810)이 있지만, 이들 전초배양은 모상근의 배양 보다는 생장속도가 낮은 단점이 있다. 모상근과 같이 배양속도가 빠르며 유용물질인 아시아티코사이드가 고함유된 제조방법이 요구되고 있다. 또한, 병풀로부터 모상근을 유도하기 위한 고효율의 형질전환 방법은 현재까지 제공되고 있지 않아 유용유전자 도입을 위한 체계적이고 고효율적인 모상근 유도 방법이 요구되고 있다.

본 발명은 병풀의 모상근을 유도하기 위해 잎 절편체를 이용하여 아그로박테리움으로 감염시켜 고효율의 모상근을 생산하는 방법과 모상근과 같이 배양 생산성이 높은 배양체를 생산하고, 모상근으로부터 고함량의 아시아티코사이드를 생산하기 위해 메틸자시모네이트를 처리함으로써 병풀 모상근 배양의 기술적 단점을 극복하여 병풀 모상근으로부터 아시아티코사이드의 생산 방법을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 병풀 잎 절편체를 이용하여 아그로박테리움으로 감염시킴으로써 고효율의 형질전환체인 병풀 모상근을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 형질전환체를 액체 배양배지에서 현탁배양 또는 공기주입식 생물반응기를 이용하여 배양하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 본 발명의 목적은 병풀의 유용물질인 아시아티코사이드가 합성되지 않는 모상근으로부터 아시아티코사이드를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 아그로박테리움 균주로 감염시킨 병풀의 잎 절편체를 항생제가 포함된 1/2 MS(Murashige and Skoog) 고체배지에서 7 ~ 14일간 암배양한 후, 1/2 MS 고체배지에서 계대배양하여 모상근의 형질전환체를 유도하는 것을 특징으로 하는 병풀 모상근의 유도 방법에 관한 것이다.

상기 아그로박테리움 균주는 식물체 선발 마커(marker)로써 하이그로마이신 포스포트랜스퍼아제(hygromycin phosphotransferase; hpt) 저항성 유전자를 삽입한 pCAMBIA 1302 벡터 포함하는 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes) R1000 균주(대전 유진텍에서 분양)를 이용하였다.

본 발명에서 형질전환의 효율을 보다 상승시키기 위하여 병풀의 잎과 엽병 연결부위 중 잎 쪽의 절단면을 절편체로 사용하여 상기 아그로박테리움 균주로 감염시킨다. 더욱 상세하게는 형질전환을 통해 모상근을 유도하기 위하여 잎의 중간부위의 절단면(도 1의 A 부위), 잎과 엽병 연결부위 중 잎 쪽의 절단면(도 1의 B 부위), 잎과 엽병의 연결부위 중 엽병 쪽의 절단면(도 1의 C 부위) 및 엽병의 끝부분(도 1의 D 부위)을 절단한 부위를 대상으로 형질전환율을 조사한 결과 잎과 밑선 양쪽을 절단한 부위의 절편체에서 가장 많은 항생제 저항성 뿌리가 발생되었다.

상기와 같이 병풀의 모상근을 유도하기 위해서 형질전환율이 뛰어난 잎 절편체 부위를 선별하였고, 아그로박테리움 균주를 사용하여 잎 절편체에 감염시킬 때는 균 감염의 효율을 높이기 위하여 20 ~ 50분 동안 1/2 MS(Murashige and Skoog) 액체배지에서 배양하였다. 그 후, 항생제가 포함된 1/2 MS(3% sucrose, 0.8% agarose) 고체배지에서 7 ~ 14일간 암배양한 후, 1/2 MS 고체배지에서 계대배양하 여 모상근의 형질전환체를 유도하였다. 암배양을 할 때에는 항생제로써, 30 ~ 60 uM 아세토실린곤을 1/2 MS 고체배지에 첨가하여 19 ± 2℃를 유지하여 아그로박테리움 균주와 공동배양한 후, 멸균수로 3 ~ 8번 반복하여 균을 세척하였다. 또한, 계대배양을 할 때에는 항생제로써, 200 ~ 400 mg/L의 세포탁심을 1/2 MS 고체배지에 첨가하여 매 2 ~ 3주마다 배지를 교체하며 모상근을 유도하였다.

본 발명은 형질전환체를 액체 배양배지에서 현탁배양 또는 공기주입식 생물반응기를 이용하여 배양하는 방법에 관한 것이다. 항생제 배지에서 계대배양하여 생장한 형질전환체는 선별하여 액체 배양배지에서 현탁배양 또는 공기주입식 생물반응기를 이용하여 배양할 수 있다. 본 발명에서는 1/2 MS 고체배지에서 선별된 형질전환체를 1/2 MS 액체배지로 옮겨서 배양하는데, 액체 배양배지에서 현택 배양을 하면 고체배지에서 배양할 때보다 형질전환체의 생장 속도가 월등히 우수하여 대량 생산이 가능한 장점이 있기 때문이다. 상기의 동일 배양배지를 공기주입식 생물반응기에서 암조건 하에 형질전환체를 배양한 경우에도 어떠한 생리장애 없이 생장하여 대량배양의 가능성을 보여주고 있다.

또한 본 발명은 상기의 형질전환된 병풀 모상근 유도 방법에 의한 병풀 모상근에 아시아티코사이드 생산을 유인하는 유인제를 처리하여 아시아티코사이드의 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 병풀 모상근으로부터 아시아티코사이드의 생산 방법에 관한 것이다.

상기 계대배양을 할 때에는 항생제로써, 200 ~ 400 mg/L의 세포탁심과 10 ~ 20 mg/L의 하이그로마이신을 1/2 MS 고체배지에 첨가하여 매 2 ~ 3주마다 계대배양 하였다. 이렇게 처리하여 형질전환된 모상근을 선별한 후, 유인제로써 메틸자스모네이트, 효모추출물, 키토산, 옥신 및 사이토키닌에서 선택되는 1종 이상을 혼합하여 사용하여 병풀 모상근으로부터 아시아티코사이드를 생산하였다. 더욱 바람직하게는 선별된 모상근의 생장이 지수기에 도달 했을 때 유인제를 처리하며, 유인제로써는 메틸자스모네이트를 0.01 ~ 1 mM을 첨가하여 1 ~ 4주간 처리하는 것이 바람직하다.

본 발명은 아그로박테리움을 이용해서 병풀 모상근을 보다 손쉽게 유도할 수 있는 방법을 개발한 것이며 이후에 유용한 유전자를 삽입하기 위해 활용될 수 있으며, 우수한 생장을 보이지만 아시아티코사이드와 같은 트리터르펜계 화합물 생산이 낮은 모상근에 메틸자스모네이트를 처리하여 이들 화합물이 높은 함량으로 생산하는 방법을 제공하여 톤 단위의 탱크배양 시 해외 수입에 의존하는 병풀을 생명공학을 이용함으로써 외화 절감효과가 가능하다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.

[실시예 1]

병풀 신초의 절편체로부터 모상근을 유도하기 위해 하기 도 1에 표현된 사진과 같이 각각의 절편을 이용하여 아그로박테리움 리조제네스를 감염시킨다. 이 때 상기에서 균 감염의 효율을 높이기 위해 감염 후 40분 동안 1/2 MS 액체배지에서 배양하였으며, 1/2 MS 배지(3% 수크로즈, 0.8% 아가로즈)에 50 μM 아세토실린곤을 첨가하여 19℃ 암상태에서 공동 배양을 7일간 수행 후 멸균수로 5번 반복하여 균을 세척하였다. 1/2MS 배지에 300 mg/L 세포탁심을 넣고, 매 3주마다 새로운 배지에 옮겨 모상근을 유도하였고, 유도된 모상근은 상기의 같은 배지에 300 mg/L 세포탁심, 15 mg/L 하이그로마이신을 첨가하여 형질전환된 모상근만을 선발 배양하였다. 그 결과 하기 도 1에 표시한 바와 같이, B부분에서 모상근유도 및 형질전환효율이 높았으며 각 절편체 부위에 따른 형질전환효율을 비교한 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 또한, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 아그로박테리움 균주와 절편체를 감염시킨 후 균과 함께 공동배양한 기간을 7일간 수행 했을 때 형질전환효율이 가장 높았다. 따라서 절편체를 잎의 B부위를 사용하여, 공동배양을 7일간 수행했을 때 모상근을 유도하는데 가장 높은 효율이 나타나는 것을 확인하였다.

표 1. 병풀 모상근 최적 유도를 위한 절편체 종류

표 2. 병풀 모상근 최적 유도를 위한 공동배양 기간

[실시예 2]

상기 실시예 1에서 유도된 병풀 모상근은 여러 계대배양을 통해 생장이 안정된 라인을 선별하였고, 40 mg/L의 고농도 하이그로마이신이 첨가된 배지에서도 정상적으로 생장하는 것을 확인하였으며 그 결과를 하기 도 2a에 나타내었다. 상기 형질전환체의 형질전환 유무를 확인하기 위하여 pCAMBIA 1302 벡터 내에 삽입되어 있는 GFP(green fluorescence protein) 발현을 확인하였다. 이를 위해 GFP 필터(480/40 ㎚ excitation filter)를 사용하여 형광 현미경(Leica MZ6 stereo fluorescence microscope)을 통해 관찰하였다. 하기 도 2b에 보여주는 결과에서처 럼 병풀 식물체의 모상근 끝부분에서 GFP로 발현됨을 확인하였다.

또한, 병풀 모상근을 100 mL 삼각플라스크에 3% 수크로즈가 포함된 1/2 MS 액체배지(30 mL)에서 배양한 결과, 하기 도 3에 나타낸 바와 같이 생장 속도가 우수하였다.

[실시예 3]

상기 실시예 1에 따른 형질전환된 개체들을 대상으로 실제로 외래 유전자가 삽입되어 있는지를 확인하였다. 이를 위해 추정의 모상근으로부터 지노믹 DNA(genomic DNA)를 추출하고 이 DNA를 주형으로 하이그로마이신 포스포트랜스퍼아제 저항성 유전자(hpt), 아그로박테리움으로 형질전환 시 같이 도입되는 T-DNA의 rolB 유전자 및 아그박테리움의 생존, 즉 오염을 검사하기 위해 virC 유전자 증폭을 위한 프라이머를 아래와 같이 제작하여 Ex-Taq DNA polymerase(Takara)를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR) 분석을 수행하였다.

1) hpt 확인용 프라이머 세트

순방향 프라이머 : 5'- GCCTGACCTATTGCATCTCC- 3' (서열번호 1)

역방향 프라이머 : 5'- TTCTACACAGCCATCGGTCC- 3' (서열번호 2)

2) rolB 확인용 프라이머 세트

순방향 프라이머 : 5'- CTTATGACAAACTCATAGATAAAGGTTG- 3' (서열번호 3)

역방향 프라이머 : 5'- TCGTAACTATCCAACTCACATCAC- 3' (서열번호 4)

3) virC 확인용 프라이머 세트

순방향 프라이머 : 5'- ATCATTTGTAGCGACT- 3' (서열번호 5)

역방향 프라이머 : 5'- AGCTCAAACCTGCTTC- 3' (서열번호 6)

하기 도 4에서와 같이 대조구인 병풀의 잎의 DNA를 주형으로 사용했을 때 hpt, rolB 및 virC 유전자의 증폭된 밴드가 나타나지 않은 반면 추정의 모상근으로부터 hpt(713bp)와 rolB(858bp) 유전자는 증폭됨을 알 수 있었다. 아그로박테리움에서 나타나는 virC(730bp) 유전자 증폭은 모상근에서 증폭되지 않아 아그로박테리움의 오염은 발생하지 않았음을 알 수 있었다. 따라서 하이그로마이신 저항성 모상근은 형질전환이 성공적으로 이루어졌음을 나타내고 있다.

[실시예 4]

상기 실시예 3에서 중합효소연쇄반응 분석을 통해 hpt 유전자가 도입된 개체를 대상으로 더욱더 상세하게 분석하기 위해 써던블롯(Southern blot) 분석을 수행하였다. 모상근으로부터 추출한 각각의 지노믹 DNA를 HindIII 제한효소로 절단한 후, 0.8% 아가로스젤에서 전기영동하고 나일론 멤브레인(nylon membrane)에 전이시켰다. 아그로박테리움에서 준비된 플라스미드 DNA(plasmid DNA)를 주형으로 하이그로마이신 포스포트랜스퍼아제 저항성 유전자(hpt)를 증폭하여 다이옥시 닌(dioxigenin)으로 표지한 탐침(probe)으로 혼성화 하여 분석하였다. 그 결과를 하기 도 5에 도시한 바와 같이 세 개의 병풀의 모상근에 도입시킨 하이그로마이신 포스포트랜스퍼아제 저항성 유전자(hpt)가 각각 다른 밴드로 존재 하였으며, 이 유전자가 형질전환체인 T(Transgenic plant)1, T6, 및 T7 개체에서 각각 2개, 1개, 및 3개 카피로 병풀 게놈에 삽입됨을 확인할 수 있어 형질전환된 병풀 모상근임을 확인하였다.

[실시예 5]

병풀의 잎 절편체로부터 유도된 모상근을 액체에서 배양 후 생장이 멈추는 시기인 지수기에 유인제인 0.1 mM 메틸자스모네이트를 처리하여 7일간 배양하였다.

상기 유인제를 처리하여 배양한 모상근의 아시아티코사이드의 함량을 분석하기 위하여 -50℃에서 동결건조 시켰다. 시료의 0.1 g을 막자사발로 분쇄한 후 Bonfill et al. (2006, Biomed Chromatogr 20:151-153) 방법으로 추출하였다. 추출물 20 ㎕를 Capcell-pak C18 UG 컬럼을 이용하여 아세토니트릴(acetonitrile)과 물 혼합 조건(ACN: 0-40분, 20-100%), 용매 유속속도 1 mL/min, 컬럼온도 30℃, UV 파장 214 ㎚ 조건하에서 HPLC(High Performance Liquid Chromatography, Agilent 1100 series) 분석을 수행하였다. 대조군으로써, 표준품의 아시아티코사이드의 정체(retention) 시간은 하기 도 6a에 나타낸 바와 같이 14.75분으로 나타났다. 형질전환이 확인된 모상근을 대상으로 아시아티코사이드 함량을 측정한 결과는 하기 도 6b에 나타낸 바와 같이 이 화합물은 거의 합성되지 않은 반면, 메틸자스모네이트를 3주간 처리한 경우에는 하기 도 6c에 나타낸 바와 같이 7.12 mg/g(건조시료)의 높은 함량을 나타내었다. 또한, 유인제 처리에 의한 아시아티코사이드 고생산을 확인하기 위해 아시아티코사이드 표준품과 유인제처리 추출물 시료를 1:1 비율로 혼합하여 공동 주입한 결과 하기 도 6d에 나타낸 바와 같이 아시아티코사이드 함량만 증가하는 결과를 보여주어, 메틸자스모네이트 처리에 의해 아시아티코사이드가 높은 함량으로 합성되는 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 6]

메틸자스모네이트가 병풀 모상근 내에서 아시아티코사이드 생산에 미치는 효과를 분자생물학적 방법으로 조사하였다. Total RNA는 Trisol(Introgen) 시약을 이용하여 추출하였으며 1 ㎕의 total RNA를 주형으로 사용하여 아시아티코사이드 전구체인 베타아미린을 합성하는 CabAS 유전자(GenBank 등록번호 AY520818)의 프라이머를 아래와 같이 제작하여 AccessQuik RT-PCR system 키트를 이용하여 역전사 중합효소연쇄반응(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction; RT-PCR) 분석을 수행하였다.

1) CabAS 유전자 발현 확인용 프라이머 세트

순방향 프라이머 : 5'- TGCACAGCATCAATAATAGCAGCT- 3' (서열번호 7)

역방향 프라이머 : 5'- TCAATTGGAGAGCCACAAGCGTTT- 3' (서열번호 8)

2) Actin 유전자 발현 확인용 프라이머 세트

순방향 프라이머 : 5'- GATGACATGGAAAAGATTTGGCATC- 3' (서열번호 9)

역방향 프라이머 : 5'- TGTTGTACGACCACTAGCATACAGG- 3' (서열번호 10)

하기 도 7a에 나타낸 바와 같이 유인제인 0.1 mM 메틸자스모네이트로 처리 후 CabAs 유전자의 발현은 유인제를 처리하지 않은 대조구에서는 거의 발현되지 않은 반면 유인제 처리 12시간 후부터 강하게 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 하기 도 7b에 나타낸 바와 같이 아시아티코사이드 함량 또한 점차적으로 증가하다가 처리 3주에서 가장 높은 함량을 보여주고 있다. 이로써 분자생물학적 분석 방법과 HPLC 분석방법을 통해서 메틸자스모네이트 처리는 병풀의 모상근으로부터 고함량의 아시아티코사이드를 생산하는 것으로 입증되었다.

도 1은 본 발명에 있어서 아그로박테리움 리조지니스(Agrobacterium rhizogenes)을 이용하여 모상근을 유도하는데 있어 사용된 신초의 절편체들의 부위를 보여주는 사진이다.

도 2는 본 발명에 있어서 아그로박테리움 리조니스으로 형질전환 시킨 병풀 모상근(a)이며 이들 모상근에서 형광단백질(b)을 관찰한 사진이다.

도 3은 본 발명에 있어서 병풀 모상근을 1/2 MS 액체배지에서 4주간 배양한 사진이다.

도 4는 본 발명에 있어서 병풀 모상근에 외래유전자 도입을 확인하기 위해 중합효소연쇄반응 분석을 수행한 사진으로써,

M; 표준마커

P; 포지티브 컨트롤(Positive control)

T1; 형질전환체 1(Transgenic plant)

T2; 형질전환체 2(Transgenic plant)

T3; 형질전환체 3(Transgenic plant)

T4; 형질전환체 4(Transgenic plant)

T5; 형질전환체 5(Transgenic plant)

T6; 형질전환체 6(Transgenic plant)

T7; 형질전환체 7(Transgenic plant)

N; 네가티브 컨트롤(Negative control)

도 5는 본 발명에 있어서 병풀 모상근을 써던블롯 분석한 사진이다.

도 6은 본 발명에 있어서 아시아티코사이드(asiaticoside)를 HPLC(High performance liquid chromatogram) 분석한 그래프이다.

도 7은 본 발명에 있어서 병풀 모상근에 아시아티코사이드 전구물질인 베타아미린(β-amyrin)을 합성하는 CabAS(Centella asiatica β-amyrin synthase) 유전자의 시간별 발현 양상(도 7a)과 아시아티코사이드 함량을 분석한 그래프(도 7b)이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> A method of asiaticoside production from Centella asiatica (L.) Urban hairy roots <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hpt-forward primer <400> 1 gcctgaccta ttgcatctcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hpt-reverse primer <400> 2 ttctacacag ccatcggtcc 20 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rolB-forward primer <400> 3 cttatgacaa actcatagat aaaggttg 28 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rolB-reverse primer <400> 4 tcgtaactat ccaactcaca tcac 24 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> virC-forward primer <400> 5 atcatttgta gcgact 16 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> virC-reverse primer <400> 6 agctcaaacc tgcttc 16 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CabAS-forward primer <400> 7 tgcacagcat caataatagc agct 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CabAS-reverse primer <400> 8 tcaattggag agccacaagc gttt 24 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin-forward primer <400> 9 gatgacatgg aaaagatttg gcatc 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin-reverse primer <400> 10 tgttgtacga ccactagcat acagg 25

Claims

아그로박테리움 균주로 감염시킨 병풀의 잎 절편체를 항생제가 포함된 1/2 MS(Murashige and Skoog) 고체배지에서 7 ~ 14일간 암배양한 후, 1/2 MS 고체배지에서 계대배양하여 모상근의 형질전환체를 유도하는 것을 특징으로 하는 병풀 모상근의 유도 방법.
제 1항에 있어서,

상기 잎 절편체는 병풀의 잎과 엽병의 연결부위 중 잎 쪽의 절단면을 특징으로 하는 병풀 모상근의 유도 방법.
삭제
제 1항에 따른 방법에 의해 유도되어 형질전환된 병풀 모상근에 아시아티코사이드 생산을 유인하는 유인제를 처리하여 아시아티코사이드의 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 병풀 모상근으로부터 아시아티코사이드의 생산 방법.
제 4항에 있어서,

상기 유인제는 메틸자스모네이트, 하이드록시에틸자스모네이트, 효모추출물, 키토산, 옥신 및 사이토키닌에서 선택되는 1종 이상을 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 하는 병풀 모상근으로부터 아시아티코사이드의 생산 방법.
제 5항에 있어서,

상기 메틸자스모네이트는 모상근의 생장이 지수기에 도달 했을 때 0.01 ~ 1 mM을 첨가하여 1 ~ 4주간 처리하는 것을 특징으로 하는 병풀 모상근으로부터 아시아티코사이드의 생산 방법.