KR100449810B1 - 병풀 식물체의 배양방법 - Google Patents

병풀 식물체의 배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뿌리 및 줄기, 잎을 포함하는 병풀 식물체(whole plant)를 빛이 투과될 수 있는 용기에 넣고 액상의 배지에 접종하여 배양되도록 하는 병풀 식물체의 배양방법을 제공하기 위한 것으로, 본 발명은 병풀 식물체를 액상의 배지에 키우므로써 병풀 식물체의 대량생산의 길을 열었고, 적당한 물리적인 환경조건과 배양배지의 주요 성분을 조정하고 마데카소사이드와 아시아티코사이드의 함량을 향상시키기 위한 물질들을 배지에 첨가주므로써 유용한 성분을 다량 함유할 수 있도록 하는 병풀 식물체 제조방법을 제공할 수 있는 매우 유용한 발명인 것이다.

Description

병풀 식물체의 배양방법{A method of culture in vitro of Centella asiatica (L.) Urban whole plant}
본 발명은 병풀 식물체의 배양방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 병풀에 마데카소사이드와 아시아티코사이드를 높은 농도로 함유하게 하고 또한 대량으로 병풀을 배양할 수 있도록 하는 병풀 식물체의 배양방법에 관한 것이다.
병풀(Centella asiatica(L.) Urban)은 쌍떡잎식물 이판화군 산형화목 미나리과의 여러해살이풀로, 상기 병풀의 추출물인 아시아티코사이드(asiaticoside), 마데카소사이드(madecassoside), 아시아틱 액시드(asiatic acid) 및 마데카식 액시드(madecassic acid) 등과 같은 매우 유용한 약리성분을 함유하고 있어 피부 질환 및 상처 치료에 탁월하고 항치매, 천식, 두통, 임질, 매독, 피부병, 나병, 위장병 등에 효과가 있어 질병 치료제의 원료로 사용되고 있다.
특히 현재 시판되고 있는 피부 질환 치료제 마데카솔은 주성분으로 아시아티코사이드 (40%), 아시아틱 액시드 (28%)와 마데카식 액시드 (28%)로 이루어져 있는데 그 중 항염증 성분인 아시아티코사이드가 주된 생리 활성 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.
그러나 병풀은 주로 고온 다습한 곳에서 자생하기 때문에 국내에서는 난대지방에 속하는 제주도 및 남부 지방의 섬 외에는 극히 제한되어 자생될 뿐이어서 국내에서는 자생상태에서 채취하여 이를 치료약의 재료로 이용하는데는 한계가 있으며, 또한 급속한 산업화에 따른 환경오염과 국토개발에 의한 서식지의 훼손으로 인하여 식물의 자생지와 집단 및 개체 수 감소가 현저하여 이들의 채집을 더욱 어렵게 하고 있어 지금은 거의 전량을 수입에 의존하고 있다.
더구나 병풀은 포복경을 통한 측생장을 하기 때문에 토지 단위 면적당 병풀 생산량이 저조하여 자생상태에서 배양하기에는 매우 비경제적인 폐단을 갖는 것이다.
이처럼 병풀 식물체내에 상기에서 언급한 유용물질의 합성량은 저조하기 때문에 인공적 합성이 필요하나 구조가 복잡하고 합성하는데 비용이 많이 들고 어렵기 때문에 식물체내 고합성을 위한 다양한 연구가 진행되고 있다.
또한 병풀 식물체를 아그로박테리움 리조지니스로 형질전환시켜 성장이 매우 빠른 모상근으로 유도하는 방법과 세포배양하는 방법 등을 이용하기도 하였으나, 전자는 병풀 조직내 유용물질인 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량이 매우 저조한 단점과 후자는 생산성이 너무 낮은 단점을 갖는 것이어서 모두 병풀 식물체의 재배에 있어서 유용한 방법이 되지 못한다.
따라서 본 발명은 국내 자생지역에서 채집이 어렵고 국외 수입에 의존하는 병풀 식물체를 기내로 옮겨 무균적으로 배양할 수 있도록 하되, 상기 병풀 식물체 내에 유용한 물질인 마데카소사이드와 아시아티코사이드의 함량을 향상시킬 수 있도록 하고, 대량생산을 가능하게 하는 병풀 식물체의 배양방법을 제공하기 위한 것이다.
도 1 - 본 발명에 있어서 병풀 식물체를 같은 조건하에서 5주간 배양한 사진도.
도 2 - 본 발명에 있어서 여러 종류의 액체배지에서 배양했을 때 병풀의 생장률과 마데카소사이드와 아시아티코사이드 생산률을 나타낸 그래프도.
도 3 - 본 발명에 있어서 호르몬이 없는 B5 액체배지에서 배양할 때 초기의 당(슈크로즈)농도가 병풀의 생장과 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량에 미치는 영향을 나타낸 그래프도.
도 4 - 본 발명에 있어서 동일한 B5 기본 액체배지에 병풀 식물체를 5주간 배양하였을 때 온도가 생장과 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량에 미치는 영향을 나타낸 그래프도.
도 5 - 본 발명에 있어서 호르몬이 없는 B5 액체배지의 구성 성분 중 KNO3가 병풀 식물체의 성장과 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량에 미치는 영향을 나타낸 그래프도.
도 6 - 본 발명에 있어서 호르몬이 없는 B5 액체배지의 구성 성분 중 NaH2PO2가 병풀 식물체의 성장과 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량에 미치는 영향을 나타낸 그래프도.
도 7 - 본 발명에 있어서 호르몬이 없는 B5 액체배지의 구성 성분 중 CaCl2가 병풀 식물체의 성장과 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량에 미치는 영향을 나타낸 그래프도.
도 8 - 본 발명에 있어서 호르몬이 없는 B5 액체배지의 구성 성분 중 MgSO4가 병풀 식물체의 성장과 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량에 미치는 영향을 나타낸 그래프도.
도 9 - 본 발명에 있어서 B5 액체배지에서 병풀 식물체의 성장 및 마데카소사이드와 아시아티코사이드 미치는 TDZ(1,2,3-thiadiazol-5-yl urea, thidiazuron)의 효과를 나타낸 그래프도.
도 10 - 본 발명에 있어서 B5 액체배지에서 병풀 식물체의 성장 및 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량에 미치는 오옥신(IAA, IBA, NAA, 2,4-D)들의 효과를 나타낸 그래프도.
도 11 - 본 발명에 있어서 B5 액체배지에서 병풀 식물체의 성장 및 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량에 미치는 유인제(elicitor)들의 결과를 도시한 그래프도.
도 12 - 본 발명에 있어서 pH가 병풀 식물체의 성장 및 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량에 미치는 결과를 도시한 그래프도.
도 13 - 본 발명에 있어서 빛의 양이 병풀 식물체의 성장 및 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량에 미치는 결과를 도시한 그래프도.
도 14 - 본 발명에 있어서 병풀 식물체에 마데카소사이드와 아시아티코사이드를 HPLC (High performance liquid chromatogram) 분석한 그래프도.
이와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 빛이 투과될 수 있는 용기에 마데카소사이드와 아시아티코사이드의 함량을 향상시키기 위한 물질이 첨가된 배지를 분주한 다음 상기 배지에 뿌리 및 줄기, 잎을 포함하는 병풀 식물체를 접종하여 병풀 식물체가 배양되도록 하였다.
상기 병풀 식물체를 배양하기 위한 용기로는 공기주입형 생물반응기 또는 배양병을 사용하였으며, 상기 용기는 반드시 빛이 투과될 수 있어야 하며, 유리 또는 플라스틱으로 제조되어진다. 또한 상기 병풀 식물체는 채취한 후 살균 처리과정을 거쳐 시험관에 무균 배양 중인 것을 사용하였으며, 병풀의 생장과 마데카소사이드와 아시아티코사이드(이하 유용물질이라 한다)의 함유량을 고려한 결과 B5배지가 가장 바람직하였다.
본 발명은 다음 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명될 것이나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
실시예 1
상기 병풀 식물체를 배양하기 위한 용기로는 빛이 투과되는 배양병 2개를 사용하였으며, 상기 병풀 식물체는 채취한 후 살균 처리과정을 거쳐 시험관에 무균 배양 중인 동일한 성장정도의 것을 사용하였다. 이때 상기 용기에 고체배지와 액체배지를 분주한 다음 상기 병풀식물체를 접종하여 5주간 같은 조건하에서 배양하였다. 그 결과 도1에 표현된 사진과 같이 왼쪽의 고체 배지보다 오른쪽 액체배지에서 배양된 경우 2배 이상의 빠른 생장을 보였다.
실시예 2
기존의 공기주입형(air-bubble type)의 생물반응기 (bioreactor)에서 병풀 식물체의 대량배양을 시도하되 상기 병풀의 배양을 위한 배지는 B5 액체배지(3% sucrose, pH 5.8)를 사용하였으며, 상기 배지에 뿌리, 줄기 및 잎을 포함하는 병풀 식물체를 접종시키고 상기 용기 내의 환경조건을 공기유출속도는 0.5 ℓ/min, 온도는 25℃, 광조건하에 16/8 h 광주기의 배양조건으로 10주간 배양하여 생장률을 조사하였다.
상기 병풀 식물체의 배양결과 초기 접종량에 비해 약 353배가 증가하였으며, 따라서 배양조건만 잘 갖춰주면 기존의 발효 시스템 하에서도 병풀 식물체의 대량생산이 가능함을 확인할 수 있었다.
또한 생물반응기에서 10주 배양후 병풀 일부를 분리하여 기외 조건으로 옮겨 활착을 유도한 결과 아무 손상 없이 쉽게 순화하였다.
실시예 3
마데카소사이드와 아시아티코사이드를 최대한 함유할 수 있고 병풀의 생장에도 가장 적합한 배지를 찾고자 다량무기영양성분의 양을 각각 0.5X, 1X, 2X 및 3X 농도로 조정한 MS, B5 및 RCM과 같은 액체배지(슈크로즈 3%, 30 mℓ)에 병풀식물체를 접종하여 배양하였다.
다음 배양 5주 후에 각각의 배지에서 생장한 병풀식물체들은 여과지를 사용하여 습기를 충분히 제거한 다음 생중량을 측정하였으며, 12시간 동결건조한 다음 건중량을 측정하였다. 건조된 시료는 -20 ℃ 냉동실에 보관하였으며 트리터르펜 글라이코사이드 (triterpene glycosides)중 마데카소사이드와 아시아티코사이드의 정량분석을 수행하였고, 그 결과 도 2에 도시된 바와같이 다량무기영양성분의 양이 1X농도인 B5 액체배지에서 마데카소사이드와 아시아티코사이드 생산성이 가장 우수하였으며, 또한 생장성도 양호하였다.
실시예 4
B5 액체배지를 기본배지로 설정하고 슈크로즈 농도는 3%, 4%, 5%, 6% 및 7% (pH 5.8)로, pH는 4, 5, 5.7, 6.5 및 8로 조정하여 병풀식물체를 접종한 다음, 25±1℃, 광조건 (50 μmol m-2s-1) 및 광주기 16/8 h 명암주기로 5주간 진탕 (100 rpm) 배양하였고, 온도에 대한 실험은 B5배지(3% 슈크로즈, pH 5.8)로 25℃ 와 30℃의 두 가지 온도에서 상기조건과 동일하게 수행하였다. 배양한 병풀식물체는 동결건조한 뒤 생중량과 건조량을 측정하였고 건조된 시료는 -20℃ 냉동실에 보관하였으며, 마데카소사이드와 아시아티코사이드를 정량분석을 수행하였다.
상기 병풀 식물체의 적정배양조건을 조사한 결과, 도 3에 도시한 바와같이 슈크로즈(탄소원) 2 ~ 7%에서 생장 및 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함유량이 최적으로 나타났다.
각각의 온도, 25℃와 30℃ 배양한 결과 생장률에는 큰 차이를 보이지 않았으며 도 4에 도시한 바와같이 25℃에서는 30 ℃ 보다 아시아티코사이드 함량이 높았으며, 30℃에서는 25℃보다 마데카소사이드 함량이 높은 것으로 나타났다.
실시예 5
병풀식물체의 성장에 필요한 원소 중 B5 배지의 주요 질소원으로 KNO3을 각각 0, 5, 25, 50 및 100 mM 농도로 조정하고 생장 및 triterpene glycosides 함량을 측정하였다. 상기 결과는 도 5에 나타내었다. 다음 B5 배지에 주요 인산염원으로 NaH2PO4를 각각 0, 0.2, 1, 5 및 10 mM 농도로 조정하고 생장 및 triterpene glycosides 함량을 측정하였다. 상기 결과는 도 6에 나타내었으며, B5 배지에 주요 칼슘원으로 CaCl2를 각각 0, 0.2, 1, 10 및 50 mM 농도로 조정하고 생장 및 triterpene glycosides 함량을 측정하였다. 상기 결과는 도 7에 나타내었다. 또 B5 배지에 주요 마그네슘원으로 MgSO4를 각각 0, 0.2, 1, 10 및 50 mM 농도로 조정하고 생장 및 triterpene glycosides 함량을 측정하였으며, 결과는 도 8에 나타내었다.
이처럼 배지의 주요성분을 조사한 결과 이들의 첨가량은 도5 ~ 도8에 표현된 바와같이 KNO35~50 mM, NaH2PO4는 0.01~10 mM, CaCl2는 0.2~50 mM, MgSO4는 0.1~50 mM 농도로 첨가하는게 적당하였으며, KNO325mM, NaH2PO4는 0.2mM, CaCl2는 0.2mM, MgSO4는 5mM 농도조건에서 각각 최적의 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함유량을 갖는 것이다.
실시예 6
외재(外在) 호르몬이 마데카소사이드와 아시아티코사이드 생산성에 미치는 효과를 조사하기 위해서 병풀 식물체에 오옥신으로는 β-인돌아세트산 (IAA), 인돌뷰티릭액시드 (IBA), α-나프탈렌아세트산 (NAA) 및 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)를 각각 0.01 mg/ℓ의 농도로 첨가하여 배양하였으며, 그 결과 오옥신들 중 인돌뷰티릭액시드가 첨가된 조건에서 배양된 병풀 식물체 생장에 가장 우수하였으나 모든 오옥신들은 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량에 영향을 주지 않았다.
시토키닌의 경우 벤질아미노퓨린 (BA), 키네틴 (Kinetin), 지아틴 (Zeatin)과 티디아주론 (thidiazuron)을 각각 0.01 mg/ℓ 첨가하여 배양 5주 후 생중량과 동결건조 뒤 건중량을 측정하였고, 필요한 경우 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량을 측정한 결과 티디아주론이 첨가된 배양조건에서 가장 우수하였으며 그 다음으로 벤질아미노퓨린 첨가구에서 우수하였다.
그 결과 도 9에 도시한 바와같이 오옥신의 양은 0.1 mg/ℓ이 적당하며 보다 바람직하게는 0.001~0.1 mg/ℓ이다. 시토키닌의 양은 1 mg/ℓ가 바람직하며 보다 바람직한 양은 0.001~1 mg/ℓ 농도가 가장 바람직하다.
병풀의 생장 촉진효과를 살펴보기 위하여 티디아주론의 최적농도별 생장조건을 측정하기 위해 0.005, 0.01, 0.025, 0.05 및 0.1 mg/ℓ 농도로 첨가하여 생중량 및 건조량과 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량을 측정하였으며, 이를 도 10에 도시하였다. 그 결과 티디아주론이 0.01~0.1 mg/L가 첨가된 처리구에서 유용물질 함량이 증가하였다.
실시예 7
유인제 (elicitor)가 병풀 지상부 조직내 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량에 미치는 효과를 조사하기 위하여 유인제로서 각각의 효모추출물 (0, 0.1, 0.2, 0.4 및 0.8 g/ℓ)농도와 각각의 메틸자스모네이트 (0, 0.01, 0.1, 1 및 3 mM)농도로 B5 액체배지(슈크로즈 3%, pH 5.8)에 첨가하였다. 5주간 B5 액체배지에서 배양한 병풀 식물체를 접종 재료로 사용하였으며 유인제가 첨가된 배지에서 7일간 배양 후 병풀 지상부 조직에 포함되어 있는 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량 측정을 수행하였다. 그 결과 도 11의 a)도에 도시한 바와같이 메틸자스모네이트는 0.1 mM이 첨가된 상태의 배양조건에서 최적의 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량을 나타내었고, b)도에 도시한 바와같이 0.1g/ℓ 효모추출물이 첨가된 상태의 배양조건에서 최적의 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량을 나타내었다.
또한 키토산은 50, 100, 500 및 3000 ㎕/ℓ 농도로 B5 배지에 첨가하였고 멸균전 pH 5.8, 슈크로즈 3%로 조정하여 멸균 후 접종하여 5주간 배양후 병풀 식물체의 성장 및 식물체 조직에 마데카소사이드와 아시아티코사이드 함량을 조사한 결과 c)도에 도시한 바와같이100 ㎕/ℓ에서 최대 생장률 및 함량을 나타내었다.
실시예 8
본 발명에 있어서 B5 액체배지를 기본배지로 설정하고 pH는 4, 5, 5.7, 6.5 및 8로 조정하여 병풀식물체를 접종하여 25±1oC, 광조건 (50 μmol m-2s-1) 및 광주기 16/8 h 명암주기로 5주간 진탕 (100 rpm)배양하였다. 그 결과 pH 5에서 가장 좋은 생장률을 보였고, pH가 5.7 일 때부터 점차 감소하는 경향을 보였다. 함량은 pH 6.5 일 때 마데카소사이드가 건중량당 6.62 mg이고, 아시아티코사이드는 6.89 mg로 나타나 pH 4 일 때 보다 약 3.2배 증가하는 것으로 나타났다. 따라서, 도 12에 도시한 바와 같이 pH범위를 5.0~8.0에서 병풀 식물체를 배양하는 것이 바람직하였다.
실시예 9
병풀 식물체는 빛의 양에 따라 유용물질의 함유량에 변화가 있는지를 살펴보기 위하여 빛이 없는 암실에서와 빛의 양(4500, 5000, 7000lx)을 점차 높여 3단계에서 실험한 결과 기내에 사용하는 빛은 한계가 있기 때문에 자연광을 고려해 볼때 형광램프의 광도가 7,000 lx에서 가장 높은 함량을 나타내었다. 상기 결과를 고려해 볼때 기내에서 병풀식물체 배양에 있어서 1,000~7,000 lux의 범위에서 배양하는 것이 바람직하다. 이를 도 13에 도시하였다.
실시예 10
본 발명 각 실시예에 있어서 상기 마데카소사이드와 아시아티코사이드의 추출은 각각의 마쇄된 병풀식물체 건조 분말 100 mg을 5 mℓ의 70% ethanol에 넣고 20분간 초음파처리로 추출하였고, 추출액은 Whatman (No. 1, 70 mmΦ)여과지로 여과한 다음 회전증발기에서 농축하였다. 농축액은 petroleum ether로 재 용해시켜 수층만을 수집하고 -5℃ acetone을 첨가하여 섞은 후 수층만을 수집하여 질소가스를 사용해서 농축하였으며, 농축액은 1 mℓ methanol에 재용해시켜 그 중 10 ㎕를 HPLC 시료로 사용하였다. HPLC 분석을 위한 장치로는 Waters사의 injector (600), detector (486 Tunable absorbance), integrator (Autochro - WIN, Younglin)를 사용하였으며, μ-Bondapak C18 column (10 ㎛, 3.9 mm × 300 mm)을 사용하여 26 ℃에서 분석하였다. 용매로는 methanol : water (60 : 40, v/v)를 사용하여 유속 0.8 mℓ/min로 하여 214 nm에서의 자외흡광도로 화합물을 검출하였다.
이처럼 본 발명은 병풀 식물체를 액상의 배지에 키우므로써 병풀 식물체의 대량생산의 길을 열었고, 적당한 물리적인 환경조건과 배양배지의 주요 성분을 조정하고 마데카소사이드와 아시아티코사이드의 함량을 향상시키기 위한 물질들을 배지에 첨가주므로써 유용한 성분을 다량 함유할 수 있도록 하는 병풀 식물체 제조방법을 제공할 수 있는 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (8)

  1. 뿌리 및 줄기, 잎을 포함하는 병풀 식물체(whole plant)를 빛이 투과될 수 있는 공기주입형 생물반응기 또는 배양병 중 어느 하나의 선택된 용기에 넣고, 오옥신, 시토키닌, 효모추출물, 메틸자스모네이트, 키토산 중 1종 또는 1종이상을 선택적으로 혼합하여 사용한 액상의 배지에 접종하여 배양되도록 함을 특징으로 하는 병풀 식물체의 배양방법.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서 상기 공기주입형 생물반응기의 온도는 20~30℃, 광조건하에 16/8 h 광주기의 환경조건을 갖도록 구성되어짐을 특징으로 하는 병풀 식물체의 배양방법.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서 상기 배지에 KNO3, NaH2PO4, CaCl2, MgSO4중 1종 또는 1종이상을 첨가함을 특징으로 하는 병풀 식물체의 배양방법.
  6. 제 1항에 있어서 상기 배지에는 탄소원인 슈크로즈가 2~7%의 농도로 첨가되어짐을 특징으로 하는 병풀 식물체의 배양방법.
  7. 제 1항에 있어서 상기 배지의 pH는 5 ~ 8의 범위임을 특징으로 하는 병풀 식물체의 배양방법.
  8. 제 1항에 있어서 상기 빛의 양은 1,000~7,000의 범위임을 특징으로 하는 병풀 식물체의 배양방법.
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