KR20090122822A - 뿌리 특이 발현 프로모터ｆ - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식물체 내에 외래 유용유전자의 발현 장소를 뿌리 부분으로 제한하여 발현시키는 뿌리 특이 발현 프로모터에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 서열번호:1로 구성되는 뿌리 특이 발현 프로모터, 서열번호:2로 구성되는 올리고 누클레오티드 및 서열번호:3으로 구성되는 올리고누클레오티드로 이루어지는 상기 뿌리 특이 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머, 상기 서열번호:1의 프로모터 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터 pBGWFS7-PAtF10Ext 및 상기 발현벡터 pBGWFS7-PAtF10Ext 으로 형질전환된 식물세포에 관한 것이다.
뿌리특이, 프로모터, 애기장대, 조직특이, 형질전환체

Description

뿌리 특이 발현 프로모터Ｆ {A ROOT-SPECIFIC PROMOTER F}
작물분자육종은 모든 종(種)의 유전자를 재료로 사용할 수 있으며 기존의 게놈 단위로만 가능하던 육종기술을 유전자 단위로 끌어내려 무한대의 육종 효과를 미세하게 조절할 수 있다는 측면에서 차세대 농업을 이끌어 갈 핵심적인 기술이다.
이러한 작물분자육종은 기술의 효과를 극대화시키려면 여러 가지 식물의 유전자를 대표할 수 있는 많은 유전자 데이터의 축적이 선행되어야 하고, 다양한 작물의 형질전환 시스템이 구축되어야 하며, 외부에서 삽입된 유전자의 발현을 조절할 수 있는 다양한 프로모터의 개발이 선행되어져야 한다.
본 발명은 식물체 내에 외래 유용유전자의 발현 장소를 뿌리 부분으로 제한하여 발현시키는 뿌리 특이 발현 프로모터에 관한 것으로서 식물 형질전환체 개발시 외래유전자를 뿌리 조직에서만 발현시키고자 할 때 유용한 AtF10Ext 프로모터를 제공하고자 한다.
외래 유전자의 발현을 식물체의 특별한 조직에만 국한시켜 형질전환 목적을 달성하는데 이용되는 공지된 프로모터들은 그 기능에 따라서 다음과 같이 분류할 수 있다.
첫째로 뿌리 특이 발현 프로모터이다. 아직 상용화된 사례는 없으나 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS)와 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제(ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터 가 뿌리에서 특이 발현을 유도하며 당근, 무에서 뿌리 특이적 일시적 발현을 유도함을 확인하여 특허 등록받은바 있고(대한민국 등록번호 제 10-0604186호, 제 10-0604191호)된 바 있고 최근 애기장대 유래 익스텐신 유전자의 프로모터가 뿌리특이적으로 발현함을 확인하여 특허 등록을 받았다. (대한민국 등록번호 제 10-0790809호). 이들 프로모터는 식량이나 식품, 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 뿌리작물에서 농업적 형질 개량이나 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용이 기대될 수 있다.
둘째로, 종자 특이적 프로모터를 들 수 있다. 대표적인 예로서 벼 주요 저장 단백질 유전자의 프로모터들로서 황금쌀(golden rice) 개발에 사용된 벼 글루테린(glutelin) 프로모터가 현재까지 외떡잎 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는 경우에 많이 사용되고 있고, 쌍떡잎 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는 콩 유래 렉틴(lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀(napin) 프로모터 및 애기장대의 종자에서 감마 토코페롤 메틸기 전이효소(γ-tocopherol methyl transferase:γ-TMT) 유전자 발현을 유도함으로써 비타민 E 생성을 증진시킨 연구에 사용된 당근 유래 DC-3 프로모터 등을 들 수 있으며 본 연구팀에 의해 들깨 유래 올레오신(oleosin) 프로모터의 종자 특이발현 유도를 확인하여 특허 등 록받은 사례가 있다.(대한민국 등록번호 제 10-0685520호) 상기 종자 특이적 프로모터들은 주로 종자 자체가 식량이나 식품 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 주로 사용되고 있다.
셋째로 전신발현 유도 프로모터를 들 수 있다. 식물 전신발현 유도 프로모터로는 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터가 대표적인 쌍떡잎식물용 프로모터로 사용되고 있으며, 벼 등의 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴(actin) 및 옥수수 유비퀴틴(ubiquithin) 유전자 프로모터들이 주로 이용되어 왔으며, 최근 벼 시토크롬 C유전자(OsOc1)의 프로모터가 국내 연구진에 의해 개발되어 사용 중에 있다(대한민국 등록번호 제 10-0429335호). 이들은 식물형질전환 기본 운반체 내에 선발마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하기 위해 이미 내재되어 있으며, 연구적인 측면에서 목적하는 유전자의 식물체내 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 프로모터들이다.
넷째로, 잎 등의 기타 조직 특이 프로모터를 들 수 있다. 잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼와 옥수수 유래의 알비씨에스 (rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 아그로박테리움 유래의 식물 뿌리 발현을 유도하는 RolD 프로모터, 감자 유래 괴경 특이 발현 유도 파타틴 (patatin) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스 (PDS: phytoene synthase) 프로모터, 그리고, 그 기능이 배추 꽃의 화분 특이적임이 확인된 배추 유래 oleosin 프로모터 등이 포함되며 본 연구소의 연구팀에 의해 꽃의 웅성기관 약의 융단조직 특이 BcA9 프로모터 (대한민국 등록번호 제 10-0435143호)를 세포에 독성을 갖는 Bt 단백질 유전자의 발현을 유도케 함으로써 웅성불임 작물을 개발하여 특허 등록한 사례가 있다.
그 외에도 다양한 목적에 따른 다양한 식물 유래의 식물체 각 조직에 대하여 많은 수의 프로모터들이 보고되었고 현재에도 계속 개발이 진행 중이지만, 상용화 되었거나 식물 연구자들 사이에 범용되는 프로모터의 종류는 이상에서 언급된 경우에 대부분 속하며, 개발자의 의도에 따라서 보다 정밀하게 유전자 발현의 장소를 조절할 수 있는 새로운 프로모터들이 앞으로도 계속 개발될 필요가 있다.
본 발명은 개발자의 의도에 따라서 보다 정밀하게 유전자 발현의 장소를 조절할수 있는 새로운 프로모터 개발의 필요성에 의하여 수행된 것으로서, 본 발명은 유용 유전자 및 마커 또는 리포터 유전자의 발현을 유도하거나 농업적 특성을 개량하고자 할 때 사용가능한 신규 뿌리 발현 프로모터, 상기 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 및 상기 프로모터를 포함하는 발현벡터를 제공하고자 한다. 또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 식물세포를 제공하고자 한다.
본 발명은 식물체 내에 외래 유용유전자의 발현 장소를 뿌리 부분으로 제한하여 발현시키는 뿌리 특이 발현 프로모터에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는,
본 발명의 신규한 뿌리 특이적 프로모터(PAtF10Ext)는 서열번호:1의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은, 서열번호:2의 염기서열로 구성되는 올리고 누클레오티드 및 서열번호:3의 염기서열로 구성되는 올리고누클레오티드로 이루어지는 상기 뿌리 특이 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머에 그 특징이 있다.
또한 본 발명은, 발현벡터 pBGWFS7-PAtF10Ext 및 상기 발현벡터 pBGWFS7-PAtF10Ext으로 형질전환된 식물세포가 상기 서열번호:1의 프로모터 염기서열을 포함하는 것에 그 특징이 있다.
본 발명에 의한 뿌리 특이 발현 프로모터를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 식물세포는 유전공학적 방법으로 도입된 외래 유전자를 뿌리 조직에 제한적으로 발현을 유도하였다. 식물 생육에 영향을 주지 않고, 그 발현을 뿌리에 국한시키는 효과가 있기 때문에 형질전환 저장뿌리 조직에서 유용 단백질을 대량으로 생산하고자 할 때, 혹은 형질전환체를 이용한 저장뿌리 조직의 대사 조절 및 기능성 물질 생산 등에 효과적으로 이용될 수 있다.
본 발명의 신규한 뿌리 특이적 프로모터(PAtF10Ext)는 서열번호:1의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 한다.
상기 뿌리 특이적 프로모터는 상기 서열번호:1뿐만 아니라 상기 서열번호:1의 일부 염기가 치환, 결실 또는 부가된 변형서열로서 뿌리 특이적 프로모터 활성을 나타내는 염기서열을 포함한다.
본 발명의 상기 신규한 뿌리 특이적 프로모터는 종래 확인되지 않은 유전자로서 염기서열에 의한 상동성 분석 결과 애기장대에서 분리된 프롤린이 풍부한 익스텐신 유사 단백질과 일부 상동성을 가진 유전자의 프로모터이다. 익스텐신 단백질은 세포벽의 주요 구성성분으로 식물의 발달과 밀접하게 연관되어 발현이 조절되며 애기장대의 익스텐신1번 유전자의 과발현은 병원균의 침입에 저항성을 야기 했음이 보고되기도 하였다.
상기 애기장대의 F10Ext 프로모터 영역은 유전자 코딩 부위의 상류 1,935 bp에 해당한다.
또한, 본 발명은 상기 뿌리 특이 발현 프로모터를 증폭하기 위한 32bp의 순방향과 역방향 프라이머로 구성되며, 서열번호:2의 염기서열로 구성되는 올리고누클레오티드 및 서열번호:3의 염기서열로 구성되는 올리고누클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 한 쌍의 프라이머를 제공한다. 상기 프라이머는 당업자에게 공지된 올리고누클레오티드의 합성 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 상업적으로 합성하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 상기 프라이머는 프라이머를 구성하는 개별 염기서열의 일부에 변이가 일어난 변형서열을 포함할 수 있다. 상기 변형서열은 변이가 이루어진 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행한 결과와 미변형서열로 이루어진 프라이머(서열번호:2 및 서열번호:3)를 사용하여 PCR을 수행한 결과가 실질적으로 동일한 범위 내에서의 결실, 치환 또는 부가된 서열을 의미한다.
또한, 본 발명은 서열번호:1로 구성되는 프로모터 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터 PAtF10Ext(이하, pBGWFS7-PAtF10Ext이라 함)를 제공한다. 상기 발현벡터 pBGWFS7-PAtF10Ext는 농업생명공학연구원에 유전자 수탁 번호 KACC 95078P 로 2008 년 4월 2일에 기탁되었다.
상기 발현벡터 pBGWFS7-PAtF10Ext에는 본 발명의 서열번호:1의 염기서열로 구성되는 프로모터, 제초제 저항성 유전자인 Bar 및 리포터 유전자인 Egfp:gus가 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호:1의 프로모터 염기서열을 포함하는 발현벡터 pBGWFS7-PAtF10Ext로 형질전환된 것을 특징으로 하는 식물세포를 제공한다.
상기 프로모터를 이용하여 형질전환시킬수 있는 식물세포로는 애기장대 및 유사 쌍떡잎식물이나, 여기에 한정되지 않고, 뿌리로 이용될 수 있는 것이면 어떠한 식물 세포라도 적용 가능하다.
본 발명의 뿌리 특이적 프로모터 사용시 뿌리 병 방제를 위한 내병성 유전자의 뿌리 발현을 통해 화학적 방제의 감소 효과를 기대할 수 있고 한편 뿌리를 섭취하는 뿌리작물, 무, 고구마, 인삼, 당근 등에서 특정 유용 단백질의 뿌리 발현 등을 유도할 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 이해될 수 있다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 한편, 하기 실시예들에서 특별히 언급되지 않은 일반적으로 사용된 DNA 실험방법들은 Sambrook 등의 “ Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, second edition, 1989”를 참조하였다.
[ 실시예 ]
1. 애기장대 프로모터 PAtF10Ext의확보
애기장대 프로모터 PAtF10Ext를 확보하기 위하여 애기장대 게놈 염기서열 (http://www.tigr.org/tdb/e2k1/ath1/, At1g23720)에 근거하여, 애기장대로부터 분리한 게노믹 DNA로부터 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아 측이 특이적으로 가지고 있는 재조합 핵산서열 부위를 일부 포함하면서 PAtF10Ext 프로모터를 특이적으로 증폭할 수 있도록 순방향 프라이머 (F10Ext B1:5'-AAAAAGCAGGCT ATCGTTCTCAAAATGATGCT-3', 서열번호:2)와 역방향 프라이머 (F10Ext B2:5'-AGAAAGCTGGGT GGCCATGATAATAAAACCAA-3', 서열번호:3)를 제작하였다. 애기장대 생태형 Columbia-0의 잎으로부터 게놈 DNA를 추출한 다음 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하여 F10Ext 프로모터 약 1.9kb (서열번호:1)를 분리하였다. 이 때 95℃에서 10분간 변성 후, 94℃에서 1분간 반응 후 55℃에서 1분간 어닐링반응, 68℃에서 2분간의 중합반응의 일련의 반응을 30회 실시한 후 68℃에서 10분간 중합반응과 같은 PCR 조건으로 PCR을 수행하였다.
2. 형질전환용 플라스미드 제작
위에서 분리한 F10Ext 프로모터를 애기장대에 형질전환 시키기 위해 벨기에의 겐트대학으로부터 구입한 게이트웨이 운반체 pBGWFS7을 이용하여 F10Ext 프로모터 기능 분석용 운반체를 제작하였다. 증폭된 PCR 산물들은 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리아측 특이 재조합 핵산서열 부위 전체를 포함하는 어댑터 프라이머 B1(5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3', 서열번호:4)과 B2(5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3', 서열번호:5)를 사용하여 각각 재 PCR되었다. 2차로 PCR된 산물들은 박테리아가 박테리오파지에 감염될 때 박테리오파지 측 특이 재조합 핵산서열 부위를 포함하는 pDONR221 벡터와 BP 재조합반응을 거쳐 pDONR-PAtF10Ext 중간 클로닝 벡터가 제작되었다. 서브 클로닝된 이 운반체는 최종 식물형질전환 운반체를 제작하기 위해 Egfp 와 Gus 유전자가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 pBGWFS7 벡터와 다시 LR 재조합 반응을 거쳐 최종적인 pBGWFS7-PAtF10Ext 운반체가 완성되었다. 이 때, 기본 운반체(binary vector)로 사용된 pBGWFS7는 미생물 선발을 위한 스펙티노마이신 (spectinomycin) 저항성 유전자를 가지며, 식물체 선발인자로 제초제 저항성 Bar유전자를 포함하고 있다. 도 1은 플라스미드 pBGWFS7-PAtF10Ext의 유전자지도의 모식도이다.
제작된 형질전환용 운반체는 액체질소를 이용한 직접적인 아그로박테리아 형질전환 방법 (Holster 등의 freeze-thaw method, 1978)에 따라 아그로박테리아 튜메파시엔스 균주 GV3101에 형질전환 시킨 후, An 등의 알카리 방법 (alkaline lysis)에 근거한 아그로박테리아 급속 선발 (quick-screen)을 이용하여 아그로박테리아 내 도입을 확인하였다.
3. 식물 재료 및 애기장대 형질전환
파종한 후 22℃ 배양기 (16시간 낮/8시간 밤)에서 약 4주간 생육된 애기장대 (Arabidopsis thaliana ecotype Columbia-0) 식물체의 일차 추대를 제거하여 최소한 3 ~ 4개의 이차 추대를 유도한 후, 식물 형질전환 운반체가 보유된 아그로박테리아 배양액에 5% 수크로즈(sucrose)와 250ppm 트윈-20(tween 20)이 함유되도록 희 석한 후 현탁액을 꽃봉우리에 분사하여 아그로박테리아를 감염시킨다. 충분한 습도와 암 조건을 유지한 상태로 하룻밤동안 배양한 후 22℃ 배양기 (16시간 낮/8시간 밤)에서 4 ~ 5일간 배양시키고 상기와 동일한 방법으로 반복한 후 22℃ 배양기 (16시간 낮/8시간 밤)에서 꼬투리 조직(silique)이 갈색으로 완전히 성숙할 때까지 약 3 ~ 5주간 생육 시킨 후 채종하였다. 채종된 종자는 다시 파종하여 생육 10일째 일차, 17일째 이차로 0.3% 바스타를 살포함으로써 T1세대의 형질전환체를 선발하였다. T1 형질전환 식물체는 22℃ 배양기 (16시간 낮/8시간 밤)에서 꼬투리 조직(silique)이 갈색으로 완전히 성숙할 때까지 약 2달간 생육 시킨 후 T2 종자를 채종하였다.
4. GUS 청색발색 반응 분석
PAtF10Ext 형질전환 T2 종자를 일부는 물에서 발아시켜 7일째에 일부는 상토에 파종하여 생육 10일째 1차, 17일째 2차로 0.3% 바스타를 살포하여 생존한 형질전환 애기장대 식물체의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 및 꼬투리등 여러 조직으로부터 생육 단계별로 청색발색 유전자(GUS)의 발현을 관찰하였다. 대조구로는 비형질전환 애기장대 Columbia-0와 P35S 프로모터 형질전환된 애기장대를 발아시켜 사용하였다. 청색발색 유전자의 발현여부를 관찰하기 위해 유묘나 각종 조직을 GUS-assay buffer [X-gluc(cyclohexyl ammonium salt) 20mM, NaH2PO4 H2O 100mM, NaEDTA 10mM, Triton X-100 0.1%, pH7.5]에 침지하고 37℃에서 하룻밤 처리 후, 버퍼용액 을 버리고 물로 닦아준 후 70중량% 에탄올에 침지하고 37℃에서 1시간에 한번씩 클로로필 (chlorophyll)이 완전 제거될 때까지 반복하여 갈아주었다. 식물체는 입체현미경으로 관찰하였으며 도 2는 청색발색 유전자의 발현을 관찰한 것이다. 발아 7일째의 유묘단계부터 PAtF10Ext 형질전환 애기장대는 뿌리에 GUS 청색발색이 관찰된 반면, 비형질전환 애기장대에서는 GUS 청색발색이 전혀 보이지 않았고, P35S 프로모터 형질전환 애기장대는 GUS 청색발색이 전신 식물체에서 관찰되었다. PAtF10Ext 형질전환 애기장대의 경우 식물성체의 여러 조직, 즉 잎, 줄기, 꽃, 꼬투리에서도 청색발색은 관찰되지 않았으나 뿌리에서만 관찰되므로 PAtF10Ext는 뿌리에서 특이적으로 발현하는 것으로 보인다.
5. GUS 청색발색 정량 분석
PAtF10Ext의 GUS 청색발색 발현량을 조사하기 위해 PAtF10Ext로 형질전환된 애기장대 T2세대 2계통 과 대조구로 비형질전환 애기장대의 잎, 뿌리, 줄기와 꽃에서 전체 단백질을 각각 분리하였다. 전체 단백질을 분리하기 위해 액체질소를 이용하여 막자사발로 분쇄한 약 50mg의 조직별 시료를 1.5ml 튜브에 옮긴 다음 각 튜브에 100 ㎕의 단백질 추출 완충액 (50mM 인산 나트륨(sodium phosphate), pH 7.0, 10mM 디티오스레이톨(Dithiothreitol, DTT), 1mM EDTA이나트륨(disodium EDTA), 0.1% SDS(sodium dodecyl sulfate), 0.1% triton X-100)을 넣고 격렬하게 혼합하였다. 혼합액은 4℃, 15,000rpm에서 5분 동안 원심분리하고 상등액을 새 튜브에 옮긴 후 이 중 50㎕를 취하여 37℃로 맞춰진 50㎕의 분석용액( 1.2mM MUGluc(4-methylumbelliferyl β-glucuronide) , 10.0mM β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 의 1x 반응 버퍼(1x Reaction buffer), FluorAce β-glucuronidase reporter assay kit, Bio-Rad)과 혼합하고, 이를 37℃ 물수조에서 30분간 반응시켰다. 그리고 1x 정지 버퍼(1x Stop buffer)를 각 샘플에 100㎕씩 잘 섞어주고 형광광도계(여기 필터 355nm, 방출 필터 460nm)를 이용하여 GUS활성을 정량하였다. 도 3은 애기장대 프로모터 PAtF10Ext가 발현하는 애기장대의 뿌리 및 기타 조직에서 전체 단백질을 추출하고 청색발색 단백질의 발현을 정량하여 양성대조구인 비 형질전환 애기장대에서의 청색발색 단백질의 발현과 비교한 것이다.
6. RT - PCR 반응에 의한 PAtF10Ext 의 뿌리 발현양상
PAtF10Ext의 발현양상을 조사하기 위해 PAtF10Ext로 형질전환된 애기장대 T2세대 2계통 과 대조구로 P35S 형질전환된 애기장대와 비형질전환 애기장대의 잎, 뿌리, 줄기와 꽃에서 전체 RNA를 각각 분리하였다. 전체 RNA 분리과정을 상세히 설명하면, 약 1g의 각 시료를 액체질소를 이용하여 막자사발로 분쇄하여 2 ml 튜브에 옮긴 다음 각 튜브에 500 ㎕의 RNA 추출 완충액 (50mM 아세트산 나트륨(sodium acetate) pH 5.5, 150mM LiCl, 5mM EDTA, 0.5% SDS(sodium dodecyl sulfate))과 500㎕ 페놀을 넣고 혼합한다. 혼합액을 65℃에서 10분 동안 처리한 후 상온에서 15분 동안 교반기 (rotary shaker)를 이용해 섞어주었다. 4℃ 에서 원심분리(10000rpm, 10분)한 후 상등액 층을 조심스럽게 새 튜브에 옮기고, 클로로포름 500㎕를 첨가하여 잘 섞어준 후 다시 원심분리 하여 상등액을 취한다. 여기에 0.6배 부피의 8M 리튬 크로라이드 (LiCl)를 첨가한 후 -20℃에 2시간 이상 보관하였다. 4℃, 12,000rpm에서 20분간 원심분리 후 RNA 침전물을 4M LiCl와 80% 에탄올로 각각 한차례씩 씻어준 후 수득한 최종 RNA 침전물을 50㎕의 증류수에 녹였다. RNA 용출액은 자외선 흡광도 분석기 (UV spectrophotometer)를 이용하여 A260/A280를 측정하여 정량하였다. 역전사효소 이용 핵산중합효소반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)은 추출한 전체 RNA 약 1㎍을 주형으로 50uM 올리고 dT 프라이머를 이용해 50℃에서 50분, 85℃에서 5분 처리 후 얼음에서 식힌 후 여기에 다시 RNase H 를 1㎕를 첨가하고 37℃에서 20분간 처리하여 cDNA를 합성(10X RT buffer, 25mM MgCl2, 0.1M DTT, RNase OUT, SuperScriptTM RT) 하였고, 합성된 cDNA를 주형으로 청색발색 유전자 GUS 특이 프라이머 세트, 즉 서열번호:6(5'-ACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGC-3')의 GUS-F 프라이머와 서열번호:7(5'-CTCCCTGCTGCGGTTTTTCA-3')의 GUS-R 프라이머 세트와 사용된 RNA의 상대적인 량이 균일함을 증명하기 위한 애기장대 연장요소 (EF-1α: elongation factor-1α) 프라이머 세트인 서열번호:8(5'-GTTTCACATTAACATTGTGGTCATT-3')의 EF1α-F 프라이머와 서열번호:9(5'-GAGGTACCAGTAATCATGTTCTTG-3')의 EF1α-R 프라이머를 이용하여 94℃에서 5분간 변성 후, 94 ℃에서 30초간 반응 후 55 ℃에서 30초간 어닐링반응, 72 ℃에서 30초간의 중합반응의 일련의 반응을 25회 실시한 후 72 ℃에서 7분간의 확 장반응으로 각각의 PCR을 수행하였다. 역전사 PCR 반응의 결과, PAtF10Ext 형질전환 애기장대의 뿌리에서 청색발색 단백질 유전자 GUS의 전사체가 뚜렷이 검출된 반면 잎, 줄기, 꽃, 꼬투리 등 타조직에서는 검출되지 않았다. 전신발현인 P35S는 뿌리를 포함한 모든 조직에서 GUS가 검출되었다. 한편 애기장대 연장요소 EF1α는 사용된 RNA의 농도가 상대적으로 균일함을 증명하였다.
도 1은 플라스미드 pBGWFS7-PAtF10Ext 유전자지도의 모식도이다.
<도면 부호의 설명>
LB - Left border (좌측면)
Tnos - nos 터미네이터
Bar - 제초제저항성 유전자
Pnos - nos 프로모터
attB1 - Gateway cloning에 사용되는 어댑터 염기서열 B1
PAtF10Ext - 본 발명의 애기장대 뿌리특이 프로모터
attB2 - Gateway cloning에 사용되는 어댑터 염기서열 B2
P35S - 꽃양배추바이러스 35S 프로모터
EGfp - 녹색형광단백질(green fluorescent protein) 유전자
Gus - 청색발색(β-glucuronidase) 유전자
T35S - 꽃양배추바이러스 35S 터미네이터
RB - Right border (우측면)
SpR - 스펙티노마이신 저항성 유전자
도 2는 pBGWFS7-PAtF10Ext로 형질전환된 애기장대의 유묘 및 성체에서 청색발색 유전자의 발현을 관찰한 사진이다.
<도면 부호의 설명>
Seedlings (water) : 물에서 발아시킨 지 7일된 유묘
Seedlings (soil) : 상토에서 발아한 유묘(5주째)
Mature plant : 유묘관찰 후 약 3주 뒤 식물성체의 잎, 꽃, 줄기, 꼬투리, 뿌리 등 전 조직을 보여줌
pBGWFS7-PAtF10Ext : pBGWFS7-PAtF10Ext로 형질전환된 애기장대, 유묘와 성체 모두 뿌리 특이적으로 발현함
Col-0 : 비 형질전환 애기장대, 비 발현 대조구
pBGWFS7-P35S : pBGWFS7-P35S로 형질전환 된 애기장대, 전신발현 대조구임
도 3은 본 발명의 애기장대 프로모터 PAtF10Ext가 발현하는 애기장대의 뿌리 및 기타 조직에서 전체 단백질을 추출하고 청색발색 단백질의 발현을 정량하여 양성대조구인 비 형질전환 애기장대에서의 청색발색 단백질의 발현과 비교한 그래프이다.
<도면 부호의 설명>
Col-0 : 비 형질전환 애기장대
F10Ext : PAtF10Ext로 형질전환된 애기장대
도 4는 본 발명의 애기장대 프로모터 PAtF10Ext가 발현하는 애기장대의 뿌리 및 기타 조직에서 전체 RNA를 추출하고 역전사 반응 후 청색발색 단백질 유전자 GUS와 양성 대조구로 애기장대 내재유전자인 elongation factor 1α 유전자를 각각 특이적으로 증폭하는 프라이머로 증폭된 유전자 밴드를 보여주는 전기영동 사진이다.
<도면 부호의 설명>
GUS : 청색발색(β-glucuronidase) 유전자
EF1α : 애기장대 내재유전자인 연장요소(elongation factor) 1α
F10Ext : PAtF10Ext로 형질전환된 애기장대
Col-0 : 비형질전환 애기장대
P35S : P35S로 형질전환된 애기장대
M : 100bp ladder DNA 마커
L : 잎
F : 꽃
St : 줄기
R : 뿌리
Si : 꼬투리
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> A ROOT-SPECIFIC PROMOTER F <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1935 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atcgttctca aaatgatgct gaaacaagga atacaatctt ctaaagaggc taagagtttg 60 ttgaaaaaac ctccaactca aagagcacag gaaaccgaag aaaacccaaa cgaaagacaa 120 agcccaacaa ctaaaagtaa aataaagaga gtccaatatg agatgatagt atagaagtgg 180 gaaaatgatt ttttccccta ttttggcaaa gaaaataaaa agccttaatc gtcctttgtg 240 gcaagcaaaa ataatttttg ttttttccct tgacttcaaa ttgttgtgaa tctttaaaga 300 taacataatc atgtctttat gtgtaaagta actgaccata tttaactggt catttgaaaa 360 ttatatttaa ctatatcaga aacaatcata taggcaatta tattagaaaa acaattcttg 420 ttgtttagaa gttaaaagtt tagaatgaaa aaaaaataaa tatatatata tatatataac 480 aataattatt gtacaattat atttccaaat agacaactat attaacaaat actcatcgtt 540 gttacatttt tttctttaaa agaatataaa ttggagtcaa tttaaacatg aataactttc 600 tttttaacgt ctatctagaa atcaagaata cgaagagtac atgatacaaa caaagtacga 660 atcaaatcaa taaacaaagt ttagtaaaat ttgaaaaaac aacggacgca gatctacatt 720 ttcaagggaa gcaagtctat aaacaaagtt agtaacgcca attgccccca tgcggcatca 780 ctttgccaag ccccaattta gttcattcaa cattttatac tgatccgtcc gaaagaaata 840 caaatgaggc ggcaaaaaat cgacgttaat tacaagtacg attgaagccg gatacaccag 900 acattttaga acagagactg ctaataatca ttgcatcttc ttctctgaat aactattttc 960 ttactattat tgtttattgt cccagatata aacatctaaa ttttgaatga gtttatcatt 1020 ctatttttca ccttattatt aaaaaggtta ttttctatta cattcgcggc aatattcgaa 1080 agcaaaacaa ctattctaat atgatttttt tttggacaat tttatgttcg ttatggcata 1140 tcaattcata ttttcatgta gttaactatt tctatacata gaaacgtgat tctattatgt 1200 cccattatag atagttgaca actttttgta agcaaaagaa aaaaatgatg aaattatcag 1260 attgactgta tatgttaaaa acttaattgg atttttcttt atcatactta cttaaatttg 1320 atatagaaaa caaaaagaat caaaagaagc aaaagtgaag gagagacatc acatgtgatt 1380 tatgcatgta gaaactttta acctgggtaa tcttgttatg agaacattca tctctgttag 1440 tatcaatcat agagaaccaa taagaattta gaaatacgag catagaataa ttatttggtt 1500 tctaagtttg aaaatttcca ctagctactt tctccatcaa aaacaaatag ttagaagaag 1560 aagaaacaaa ataattggct cgttgacaaa ataattgaac aatgatatgc atttttcttc 1620 acgaacttga gaatatacaa atgcaaattg gatagttgac atttgatgca cgttcttgca 1680 cgttaccttt cgtggtagtt tggcgcagac aagctttcac gattactgag atgtaagcaa 1740 aacaaaaaga agaagatggt aaaaccaaat gctatataaa gccatgcaca ggtaatgtag 1800 aatgacaaaa caaagcaaac aacaaaacca acgcagtgag gcgttggaca agcaatcaaa 1860 ataagaatga tatcttctcc agggatgggg cgttctgccc atcttgttta tgctcttggt 1920 tttattatca tggcc 1935 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F10Ext B1 <400> 2 aaaaagcagg ctatcgttct caaaatgatg ct 32 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F10Ext B2 <400> 3 agaaagctgg gtggccatga taataaaacc aa 32 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adapter primer B1 <400> 4 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adapter primer B2 <400> 5 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUS-F primer <400> 6 acctgcgtca atgtaatgtt ctgc 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUS-R primer <400> 7 ctccctgctg cggtttttca 20 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a-F primer <400> 8 gtttcacatt aacattgtgg tcatt 25 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a-R primer <400> 9 gaggtaccag taatcatgtt cttg 24

Claims (4)

  1. 서열번호:1의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 뿌리 특이적 프로모터.
  2. 서열번호:2의 염기서열로 구성되는 올리고누클레오티드 및 서열번호:3의 염기서열로 구성되는 올리고누클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제 1 항의 뿌리 특이적 프로모터 증폭용 프라이머.
  3. 서열번호:1의 프로모터 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터 pBGWFS7-PAtF10Ext(KACC 95078P).
  4. 제 3 항의 발현벡터 pBGWFS7-PAtF10Ext(KACC 95078P)로 형질전환된 것을 특징으로 하는 식물세포.
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