CN116590291A - 一种烟草烟碱合成相关环状rna nrc1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种烟草烟碱合成相关环状RNA NRC1及其应用。本发明的烟草烟碱合成相关环状RNA NRC1的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本发明通过病毒诱导的基因沉默的技术，抑制环状RNA NRC1的表达，成功构建环状RNA NRC1的转基因沉默植株。经检测证明，环状RNA NRC1的转基因沉默植株中烟碱以及多种生物碱含量明显降低，说明环状RNA NRC1与烟草中烟碱生物合成密切相关，为培育新的低烟碱的植物新品种奠定基础。

Description

一种烟草烟碱合成相关环状RNA NRC1及其应用

技术领域

本发明涉及一种烟草烟碱合成相关环状RNA NRC1及其应用，属于烟草基因工程技术领域。

背景技术

烟草(Nicotiana tabacum L.)是重要的经济作物，也是自然界生物量最大的植物之一，具有极大的挖掘利用潜力。然而，烟草中的高烟碱含量在相当程度上限制了烟草的多用途开发利用。烟碱是普遍存在于烟草中的一类生物碱，其含量占烟草中总生物碱的95％以上。烟碱由鸟氨酸和精氨酸在根中合成，然后在叶片中积累。在过去的几十年里，许多与烟碱生物合成相关的基因已经被识别出来，包括两个转录因子家族：APETALA2(AP2)/乙烯响应因子(ERF)和MYC2-like basic helix-Loop-helix(bHLH)。进一步的研究表明，MYC2a/b可以与NtJAZ1形成核复合体，调节茉莉酸诱导的烟碱合成通路。最近的一项研究发现，另一个转录因子NtMYB305a可以与NtPMT1a的茉莉酸响应GAG区域结合，进而作为启动子调节烟碱的生物合成。此外，一些miRNAs也可以调节烟碱的生物合成。研究表明烟草miRNA nta-eTMX27可以调控QPT2基因，进而影响烟草中的烟碱含量，从而验证了miRNA在烟碱生物合成中的作用。

circRNA是新发现的一种非编码RNA，是继miRNA、lincRNA及piRNA后非编码RNA家族的新成员之一。由于环状RNA缺少5'-帽子端及3'-polyA尾巴，且呈闭合环状结构，使其能够耐受核酸外切酶的降解，因此具有高度保守性。近年来，大量研究表明：环状RNA可以通过吸附相应的小RNA调节其下游基因的表达；另外环状RNA还能与RNA结合蛋白相结合参与基因的转录及转录后调控。同时，环状RNA的环状结构大大提高了其稳定性，且存在组织及疾病特异性，因此越来越多研究认为环状RNA可作为疾病潜在的生物学标志物。

相比之下，植物中环状RNA的研究，特别是其机制的研究还处于起步阶段。研究发现和动物circRNA相比，植物circRNA有着一些独特特征，包括在应激反应中的功能、表达模式的变化和新的生物发生过程。circRNA是植物中重要的调控因子之一，参与植物的许多生物过程，包括胁迫反应、表达模式的变化等。然而，关于植物circRNA的机制研究仍然非常罕见，它们可能在产生和功能上都具有一些特殊的特性。目前，circRNA作为一种特殊的调控分子，其是否参与烟碱等次生代谢产物的合成却鲜有报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的第一个目的是提供一种烟草烟碱合成相关环状RNANRC1，通过实验证明环状RNA NRC1与烟草烟碱及多种生物碱的生物合成高度相关。

本发明的第二个目的是提供烟草烟碱合成相关环状RNA NRC1在获得低烟碱烟草品种中的应用，通过病毒诱导的基因沉默技术，构建环状RNA NRC1沉默的烟草植株，经检测烟碱以及多种生物碱含量明显降低。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种烟草烟碱合成相关环状RNA NRC1，所述环状RNA NRC1的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

本发明通过circRNA-Seq测序首次鉴定出环状RNA NRC1，通过抑制其表达，降低烟草中烟碱的含量，对于培育低烟碱含量的烟草品种具有重要意义。

具体地，所述环状RNA NRC1的结构由如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列转录后形成的首尾相连的封闭环状RNA结构。

一种烟草烟碱合成相关环状RNA NRC1在获得低烟碱烟草品种中的应用，通过抑制环状RNA NRC1的表达，降低烟草中的烟碱，获得低烟碱烟草品种。

本发明通过病毒诱导的基因沉默技术，成功构建环状RNA NRC1沉默的烟草植株，通过检测证明环状RNA NRC1沉默后，烟草植株中烟碱及多种生物碱的含量显著降低，为培育新的低烟碱的植物新品种奠定基础。

优选地，所述抑制环状RNA NRC1的表达是构建沉默NRC1的病毒诱导的基因沉默载体，对烟草环状RNA NRC1进行沉默。

进一步优选地，病毒诱导的基因沉默载体的构建方法如下：将PCR扩增获得的引导序列与TRV载体连接，筛选、测序鉴定。

病毒诱导的基因沉默的作用机制与另一种常用的基因沉默技术——RNA干扰(RNAi)相比，具有快速、高效、通量高等优点。

进一步优选地，所述PCR扩增的引物序列为：

NRC1-F：5’-TCGACGACAAGACCCTGCAGGAGATGTGACTTGTAAGGCGACGAT-3’；NRC1-R：5’-TGAGGAGAAGAGCCCTGCAGGGCTAAGACCAGACCTAAATTCCC-3’。

优选地，所述低烟碱的烟草品种通过以下方法获得：将病毒诱导的基因沉默载体转化农杆菌作为侵染液，再转化烟草，最后筛选鉴定，进而获得烟碱含量下降的烟草品种。

本发明通过real-time PCR检测，发现烟草环状RNA NRC1在烟草各个组织中都表达，且在烟草叶、花和根中表达相对较高。为进一步确认该环状RNA的功能，通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)的技术，构建了沉默NRC1的VIGS载体，转化后成功获得了抑制NRC1表达的转基因沉默植株。检测结果表明，相比对照植株，转基因沉默植株中叶片烟碱以及多种生物碱含量明显降低，降低了至少30％，说明环状RNA NRC1与烟草烟碱的生物合成高度相关，为培育新的低烟碱的植物新品种奠定基础。

附图说明

图1为本发明实验例1、2中环状RNA NRC1的鉴定和验证(a.PCR扩增结果，设计Convergent引物和Divergent引物分别从栽培烟草红花大金元叶片和花的cDNA和基因组DNA扩增circRNA NRC1线性序列和接头处环状序列的结果；b.Sanger测序结果，红色箭头表示首尾节点处序列；c.circRNA NRC1在组织叶、根、茎、花、和芽中qRT-PCR结果，1和2分别表示2个不同的采样时期，1代表打顶前，2代表打顶后，蓝色表示不加RNase R外切酶，红色表示加入RNAse R外切酶)；

图2为本发明实验例3中野生型和NRC1沉默植株根中NRC1表达值以及多种生物碱含量(红色表示野生型，蓝色表示NRC1沉默植株)；

图3为本发明实验例3中野生型和NRC1沉默植株叶中NRC1表达值以及多种生物碱含量(红色表示野生型，蓝色表示NRC1沉默植株)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明之外，各实施例、实验例及对比例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。

生物材料：

烟草材料：本氏烟草(Nicotiana benthamiana)，一种商品化烟草品种；

骨架载体：TRV，购自中国质粒载体菌细胞基因保藏中心；

基因测序及引物合成，由上海生工提供完成。

实验试剂：

LA Taq酶、PstI限制性内切酶，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒和In-Fusion一步法克隆试剂盒，购自Takara公司；RNA提取试剂盒，购自于GeneAnswer公司；反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒，购自全式金生物公司；circRNA反转录试剂盒、circRNA qRT-PCR试剂盒，购自吉塞生物公司；蛋白胨、酵母提取物等，购自Oxoid公司。

部分试剂配方及配制方法简要说明如下：

LB液体培养基(1L)：10g细菌蛋白胨(bacteriological peptone)，10g氯化钠(NaCl)，5g酵母抽提物(yeast extract)，高温高压灭菌；

1M 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)储备液：ddH₂O溶解MES，过滤灭菌，-20℃储存备用；

200mM乙酰丁香酮(Acetosyringone)储备液：二甲基亚砜(DSMO)溶解乙酰丁香酮，-20℃储存备用；

MMA重悬液(1L)：10mmol/L 2-N-吗琳基乙磺酸(MES)、200μl/L乙酰丁香酮(Acetosyringone，As)和10mmol/L的MgCl₂的混合溶液，pH＝5.8。

实验仪器：

PCR仪Tgradient，Biometra公司产品；实时定量PCR仪LightCycler 96，Roche公司产品。

一种烟草烟碱合成相关环状RNA NRC1的实施例1

本实施例中的烟草烟碱合成相关环状RNA NRC1的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO1所示。所述环状RNA NRC1的结构由如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列转录后形成的首尾相连的封闭环状RNA结构。

烟草烟碱合成相关环状RNA NRC1在获得低烟碱烟草品种中的应用的实施例1

本实施例中通过抑制烟草中环状RNA NRC1的表达，进而获得烟碱含量显著降低的低烟碱烟草品种。

实验例1环状RNA NRC1的鉴定

发明人通过对烟草样品进行circRNA-Seq测序，分析鉴定出在烟草中未知的环状RNA NRC1。具体的鉴定过程如下：

本实验采用栽培烟草红花大金元作为实验材料(在中国山东青岛种植)。在三个不同的发育阶段(成熟期、打顶前24小时和打顶后24小时)，采集叶、根、茎和腋芽4个组织。花组织取的是打顶前24小时。每个样品收集三个独立的重复。样品收集后，立即将样品冷冻在液氮中，并在-80℃下储存。然后按照常规的方法提取样品的RNA，进行circRNA测序。

circRNA-Seq测序使用诺禾致源的Illumina HiSeq 2500平台，按照标准双端读取。具体地说，使用线性降解酶，以便检测非聚腺苷酸化的环状RNA。

使用Trimmomatic(v0.30)从原始测序reads中过滤含有适配器或poly-N的reads和低质量reads,在全基因组范围内识别环状RNA。过滤后的reads比对到烟草参考基因组，生成序列比对文件。然后使用CIRCexplorer2、CIRI2和find_circ识别circRNA。根据其在基因组上的位置信息，将环状RNA进一步分为“基因内环状RNA”、“与基因位置有重叠的环状RNA”和“基因间环状RNA”三种类型。使用CIRIquant对circRNA进行定量。利用tspex工具进行组织特异性表达circRNA鉴定，参数基于roku_specificity。以P≤0.05和倍数≥2作为鉴别差异表达circRNA的标准。

根据circRNA-Seq测序结果可知，NRC1位于烟草基因组染色体Nitab4.5_0000742上，开始位置是51201，结束位置是52399，在首尾处成环，如图1所示。

实验例2环状RNA NRC1成环及表达特异性的验证

结合实验例1的烟草circRNA-Seq测序结果，利用相关软件的初步预测分析，发明人初步获得了环状RNA NRC1的信息，通过PCR扩增、Sanger测序及RNA提取/RNase R外切酶消化和qRT-PCR三种方法对RNA NRC1进行验证。具体的验证过程如下：

1、PCR扩增及Sanger测序

以栽培烟草红花大金元叶片/根为样品，利用RNA提取试剂盒提取烟草叶片总RNA，直接反转录成cDNA进行PCR及Sanger测序。

设计Convergent引物和Divergent引物用于环状RNA NRC1成环验证。其中，Convergent引物(收敛引物为线性引物)作为参照，不管是线性RNA还是环状RNA均可扩增，而Divergent引物(发散引物为线性引物相反的方向)只有环状RNA可以被扩增出来。

设计扩增引物序列如下：

Convergent引物：

C-X-742-F：ACCAAGAATACAAGAGTGGAGTCAT(SEQ ID NO2所示)；

C-X-742-R：GAATCGTCGCCTTACAAGTCAC(SEQ ID NO3所示)。

Divergent引物：

CH-742-F：TGGTATGTAAATGATGGTGATAAAGTTC(SEQ ID NO4所示)；

CH-742-R：CTCTAATGACTCCACTCTTGTATTCTTG(SEQ ID NO5所示)。

收敛引物作为线性转录本的阳性对照，发散引物用于检测候选环形模板。

以上述所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增。PCR扩增，20ng cDNA或基因组DNA使用2×Phanta Master Mix(Vazyme Biotech)。

PCR反应体系：cDNA/DNA模板3μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，2×Taq HighFidelity PCR StarMix(全式金)25μL，加ddH₂O补至50μL。线性RNA扩增反应条件为95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃35s，35个循环；72℃10min，4℃保温。环状RNA扩增反应条件为95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃35s，40个循环；72℃10min，4℃保温。

PCR结束后进行1.2％凝胶电泳，结果如图1所示。由图1a中可以看出，线性序列在cDNA和gDNA下面均存在条带，而环状序列只在cDNA结果存在，从而说明该环状RNA是转录后的产物。

从凝胶中分离出预期长度116bp的环状RNA PCR产物，并使用GeneJET凝胶提取试剂盒(Invitrogen)进行纯化。纯化的PCR产物在生工生物或青岛生物科技有限公司进行Sanger测序，结果如图1所示。由图1b中可以看出，NRC1的接头成环序列真实存在，从而说明NRC1真实存在。

2、Real-time PCR

为了进一步了解NRC1在不同组织中的表达特异性，以栽培烟草红花大金元旺长期的叶/根/茎/芽/花和打顶后的叶/根/茎/芽等器官为样品，利用RNA提取试剂盒提取烟草叶片总RNA，其中一部分直接进行常规反转录，另一部分用RNase R外切酶消化处理后反转录为cDNA进行Real-time PCR。

设计qRT-PCR的circRNA收敛特异性引物为：

CH-742-6F：TCAGGTGGAGTGGTATGTAAATGATGGTGATA(SEQ ID NO6所示)；

CH-742-6R：TAAATTCCCAGCATCTTCAGAGAGTGCAAGTT(SEQ ID NO7所示)。

Real-time PCR的反应体系和反应条件为：加cDNA(RNase R处理或不加处理)3ul，上游引物1μL，下游引物1μL，2×Taq High Fidelity PCR StarMix(全式金)10μL，加ddH₂O补至20μL。线性RNA扩增反应条件为95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃35s，35个循环；72℃10min，4℃保温。环状RNA扩增反应条件为95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃35s，40个循环；72℃10min，4℃保温。

Real-time PCR结果如图1所示，由图1c中可以看出，NRC1在烟草的各个组织中都有表达，但在烟草叶、花和根部中的表达量最高。

实验例3环状RNA NRC1功能验证

本实验例为确定环状RNA NRC1在烟草中的功能，选择NRC1的部分成环核酸片段(核苷酸序列如SEQ ID NO8所示)作为引导序列，构建了沉默NRC1用的瞬时沉默用VIGS载体，并进一步转化烟草植株构建了转基因沉默植株。具体实验过程如下：

1、瞬时沉默用VIGS载体的构建

首先，设计PCR扩增用引物序列如下：

NRC1-F：5’-TCGACGACAAGACCCTGCAGGAGATGTGACTTGTAAGGCGACGAT-3’(SEQ ID NO9所示)；

NRC1-R：5’-TGAGGAGAAGAGCCCTGCAGGGCTAAGACCAGACCTAAATTCCC-3’(SEQ ID NO10所示)。

用上述引物序列进行PCR扩增(扩增长度：451bp)获得VIGS的引导序列。

PCR反应体系：cDNA模板3μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，2×Taq HighFidelity PCR StarMix(全式金)25μL，加ddH2O补至50μL。反应条件为95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，40个循环；72℃10min，4℃保温。

利用In-Fusion的法，将上述扩增的引导序列与TRV载体(50℃连接15min)连接、转化、筛选、测序验证构建获得连接正确的TRV2-NRC1载体。

2、农杆菌转化

采用冻融法，将TRV2-NRC1载体转化农杆菌GV3101后，挑取阳性单克隆菌落，液体培养后，利用菌液PCR方法验证确保目的片段转化正确，并将转化正确的菌液保存备用。

需要说明的是，作为对照，同样操作方式条件下，分别将TRV1、TRV2、TRV2-PDS(阳性对照)转化了农杆菌GV3101并制备了对照用转染菌液。

3、转染液的制备

将步骤(2)中所制备的含有TRV1、TRV2、TRV2-PDS(阳性对照)、TRV2-NRC1的农杆菌单菌落分别接入YEB(5mL)培养基中(卡那霉素，50μg/mL)，28℃、250r/min过夜振荡培养约48h。将培养液转接至50mL的YEB中，28℃过夜振荡培养；4000r/min离心8min收集农杆菌到50mL离心管中，并用含有10mmol/L 2-N-吗琳基乙磺酸(MES)、20μl/L乙酰丁香酮(Acetosyringone，As)和10mmol/L的MgCl₂的混合溶液将上述菌液的OD值调至1.0左右。

在含有TRV2、TRV2-PDS、TRV2-NRC1的农杆菌的MMA悬浮液中等体积加入含TRV1农杆菌的MMA悬浮液混匀，室温放置3～6h作为转染液。

4、烟草环状RNA NRC1沉默株制备及检测

将烟草种子(本氏烟草)播种于育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵(10cm×10cm)中，于22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等，生长4～5w，选取长势一致12盆烟草幼苗作为转化体。

转化接种时挑选长势一致的约4～5片叶子，用1mL无针头无菌注射器通过压滤法把含有不同TRV重组质粒的农杆菌悬浮液从叶片背面压入全部展开的叶片中，使菌液充满整个叶片，于22℃、75％湿度条件下进行培养。

其中，含TRV2-NRC1、TRV2-PDS阳性对照和TRV2空载体的各注射植株接种6盆。

接种2周后，通过Real-time PCR检测各处理组植株中环状RNA NRC1的表达量，具体方法同之前一样，不同之处是提取组织总RNA后，反转录时使用环状RNA反转录试剂盒(吉塞生物)，同时使用环状RNA定量酶(吉塞生物)进行Real-timePCR检测。使用UHPLC-HESI-MS/MS分析各样品植株中烟碱和其它生物碱含量。

烟碱和其它生物碱含量的检测，具体参考如下方法进行：

将冷冻干燥的烟草组织磨成均匀的粉末，并在-80℃保存。在每个样品0.3g烟粉中加入2.5mL 5％氢氧化钠溶液，15min后加入20mL 0.01％三乙胺/甲基叔丁基醚溶液，室温超声提取15min；然后6000rpm离心5min后制备2mL有机相用于GC-MS检测。使用UHPLC-HESI-MS/MS分析所有样品的烟碱、其它生物碱的含量。

对沉默植株根、叶中环状RNA NRC1表达量、烟碱和生物碱检测结果如图2和图3所示。

由图2A和3A中可以看出，沉默植株叶和根中环状RNA NRC1表达量均显著降低，表明NRC1成功被沉默，转基因沉默株构建成功。

由图2B-F中可以看出，转基因沉默植株根中多种生物碱的含量明显下降：阿魏酰腐胺降低了75％、对香豆酰酪胺降低了63％、麦思明降低了33％、2,3'-联吡啶降低了25％、烟碱降低了5％。

由图3B-F中可以看出，转基因沉默植株叶中烟碱和生物碱的含量均显著下降：阿魏酰腐胺、对香豆酰酪胺、麦思明降、2,3'-联吡啶均降低了90％以上，烟碱降低了35％。

综上所述，本发明通过对烟草进行circRNA-Seq测序，分鉴定出未知环状RNANRC1，通过验证证明其主要在烟草叶、花和根部中表达，且通过设计的分散引物和发散引物证明NRC1确实为环状RNA。进一步验证其生物学功能，构建环状RNANRC1沉默株。通过检测证明，NRC1沉默株的根和叶中，烟碱和生物碱的含量显著降低，说明环状RNA NRC1与烟草烟碱的生物合成高度相关，为烟草烟叶中烟碱含量调节，以及低烟碱品种的培育奠定技术基础。

最后说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (6)

1.一种烟草烟碱合成相关环状RNA NRC1，其特征在于：所述环状RNA NRC1的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

2.一种如权利要求1所述的烟草烟碱合成相关环状RNA NRC1在获得低烟碱烟草品种中的应用，其特征在于：通过抑制环状RNA NRC1的表达，降低烟草中的烟碱，获得低烟碱烟草品种。

3.根据权利要求2所述的烟草烟碱合成相关环状RNA NRC1在获得低烟碱烟草品种中的应用，其特征在于：所述抑制环状RNA NRC1的表达是构建沉默NRC1的病毒诱导的基因沉默载体，对烟草环状RNA NRC1进行沉默。

4.根据权利要求3所述的烟草烟碱合成相关环状RNA NRC1在获得低烟碱烟草品种中的应用，其特征在于：病毒诱导的基因沉默载体的构建方法如下：将PCR扩增获得的引导序列与TRV载体连接，筛选、测序鉴定。

5.根据权利要求4所述的烟草烟碱合成相关环状RNA NRC1在获得低烟碱烟草品种中的应用，其特征在于：所述PCR扩增的引物序列为：

NRC1-F：5’-TCGACGACAAGACCCTGCAGGAGATGTGACTTGTAAGGCGACGAT-3’；

NRC1-R：5’-TGAGGAGAAGAGCCCTGCAGGGCTAAGACCAGACCTAAATTCCC-3’。

6.根据权利要求2～5中任一项所述的烟草烟碱合成相关环状RNA NRC1在获得低烟碱烟草品种中的应用，其特征在于：所述低烟碱的烟草品种通过以下方法获得：将病毒诱导的基因沉默载体转化农杆菌作为侵染液，再转化烟草，最后筛选鉴定，进而获得烟碱含量下降的烟草品种。