CN112899288A

CN112899288A - 白花野蔷薇RmNHX2基因及其提高植物耐盐性的应用

Info

Publication number: CN112899288A
Application number: CN202110388962.9A
Authority: CN
Inventors: 罗平; 崔永一; 陈林妹; 陈雯
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2021-04-12
Filing date: 2021-04-12
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2041-04-12
Also published as: CN112899288B

Abstract

本发明公开了一种白花野蔷薇RmNHX2基因及其提高植物耐盐性的应用，包括白花野蔷薇DNA片段的分离、克隆和功能验证及应用。其中，DNA片段包含白花野蔷薇抗逆功能基因RmNHX2，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其对应的蛋白质的序列如SEQ IDNO：2所示。该基因片段能够提高植物的耐盐性。将该基因片段直接转化植物，使转基因植物耐盐能力显著增强。

Description

白花野蔷薇RmNHX2基因及其提高植物耐盐性的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种白花野蔷薇RmNHX2基因及其提高植物耐盐性的应用。

背景技术

非生物胁迫是指严重影响作物产量和品质的环境条件(如盐害、极端温度和干旱)。盐胁迫是一种主要的抑制植物生长过程和限制作物生产的胁迫，已经成为世界各地农业发展的巨大威胁(Mahajan and Tuteja.2005)。此外，施肥和灌溉可能导致土壤次生盐碱化(Zhu 2002)。此外，盐度通过渗透胁迫破坏生理生化功能，导致植物细胞和植物自身死亡，离子毒性和Na⁺和Cl^-过量引起的营养失衡(Kronzucker et al.2011)。因此，分析植物响应盐胁迫的机制，探索与耐盐相关的基因，对栽培耐盐园艺作物具有重要的理论意义和较高的实践意义。为了解决土壤盐分问题，植物发展了几种适应机制，这些机制对许多植物的生存至关重要(Yoshida et al.2014)。植物能够从其细胞、生理和生化反应中感知盐胁迫信号，传递信号，并调控相关基因的表达以响应盐胁迫(Giraud et al.2009)。例如，植物可以通过调节气孔关闭来控制水分流失，减轻盐害(Zhang et al.2019)。在过去的几十年里，人们广泛发现耐盐相关基因根据其功能可分为两类。前一组的功能是保护细胞免受盐胁迫引起的损伤(Phukan et al.2017)。第二组为转录因子(TFs)、蛋白磷酸酶和蛋白激酶，，是胁迫信号转导和胁迫响应基因激活的关键(Yu et al.2017)。随着基因工程的突飞猛进，园艺作物可以在基因水平上进步，提高抗逆性(Dong et al.2013)。因此，挖掘这些抗逆基因对提高植物耐胁迫能力具有重要意义。

植物进化出了几种防御系统以适应盐胁迫(Banjara et al.2012)。植物钠质子反向转运蛋白(NHXs)最初被证明对电中性Na⁺/H⁺交换过程有中介作用，将过量的胞浆Na⁺隔离到液泡中，并维持离子平衡(Yuan et al.2015)。据报道，拟南芥中有8个NHX(Deinlein etal.2014)。根据序列相似性和定位，拟南芥的NHXs可分为3类，分别是位于质膜AtNHX7/8、位于核内体AtNHX5/6和位于液泡膜AtNHX1/2/3/4(Bassil and Blumwald,2014)。值得注意的是，拟南芥液泡膜和质膜上定位的NHXs通过维持Na⁺/K⁺稳态对耐盐性产生重要影响(Bassilet al.2011)。最近的研究表明上述液泡膜型Na⁺/K⁺逆向转运蛋白的过表达增强植物的耐盐性(Teakle et al.2010,Zhang et al.2015)。例如，来自耐盐植物向日葵(Helianthustuberosus)的两个NHXs(HtNHX1和HtNHX2)的异源表达提高了水稻的耐盐性(Zen etal.2018)。在杜梨(Pyrus ussuriensis)中，PbrNHX2的过表达通过维持低Na⁺/K⁺比例增强了耐盐性(Dong et al.2019)。上述结果表明，NHXs蛋白对植物的耐盐性有积极的影响。白花野蔷薇(Rosa multiflora Thunb)作为现代月季(Rosa hybrida)的砧木，是一种耐盐、耐低温的重要野生资源，对其耐盐基因进行功能鉴定，对月季的遗传改良具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种白花野蔷薇RmNHX2基因及其提高植物耐盐性的应用。本发明对白花野蔷薇RmNHX2进行了分离鉴定，在烟草中过表达RmNHX2提高了耐盐性，RmNHX2基因可用于提高月季及其木本花卉耐盐基因工程。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种白花野蔷薇RmNHX2基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种上述白花野蔷薇RmNHX2基因的编码蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种用于获得上述白花野蔷薇RmNHX2基因的引物对，包括P1正向引物和P2反向引物等。P1正向引物如SEQ ID NO：3所示，P2反向引物如SEQ ID NO：4所示；利用P1正向引物和P2反向引物进行PCR扩增获得白花野蔷薇RmNHX2基因。

一种用于检测如上述白花野蔷薇RmNHX2基因在转基因植物中表达的引物对，包括P3正向引物和P4反向引物等。P3正向引物如SEQ ID NO：5所示，P4反向引物如SEQ ID NO：6所示；使用P3正向引物和P4反向引物对转化白花野蔷薇RmNHX2基因的植物进行RT-PCR扩增，检测白花野蔷薇RmNHX2基因是否在转基因植物中表达。

一种如上述白花野蔷薇RmNHX2基因在提高植物耐盐性上的应用。

进一步地，所述植物为烟草。

本发明的有益效果是：本发明包括白花野蔷薇DNA片段的分离、克隆和功能验证及应用；其中，DNA片段包含白花野蔷薇抗逆功能基因RmNHX2，该基因片段能够提高植物的耐盐性。将该基因片段直接转化植物，可使转基因植物耐盐能力显著增强。该基因通过维持离子稳态和增强活性氧清除来提高植物的耐盐性。因此，该基因在今后的观赏植物耐盐工程中具有很大的应用潜力。

附图说明

图1为本发明的超量植物表达载体pCAMBIA2300s结构示意图；

图2为本发明的超量植物表达载体pCAMBIA2300s---RmNHX2构建示意图；

图3为RmNHX2的亚细胞定位检测图；

图4为RmNHX2基因的遗传转化流程图；

图5为RmNHX2基因在转基因烟草植株中的表达量情况示意图；其中，WTt野生型烟草(作为转基因烟草的对照)，OE1、OE7和OE9为3个转基因株系；

图6为RmNHX2(OE1、OE7和OE9)转基因烟草与对照野生型烟草盐处理表型鉴定示意图；

图7为RmNHX2(OE1、OE7和OE9)转基因烟草与对照野生型烟草盐处理下叶绿素含量检测示意图；

图8为RmNHX2(OE1、OE7和OE9)转基因烟草与对照野生型烟草盐处理下活性氧检测示意图；

图9为RmNHX2(OE1、OE7和OE9)转基因烟草与对照野生型烟草盐处理下过氧根离子检测示意图；

图10为RmNHX2(OE1、OE7和OE9)转基因烟草与对照野生型烟草盐处理下根、叶片金属离子的测定示意图。

具体实施方式

本发明一种白花野蔷薇RmNHX2基因及其提高植物耐盐性的应用，包括蔷薇基因片段的分离克隆、功能验证和应用；所述的基因与植物耐盐性有关，该基因通过维持离子稳态和增强活性氧清除来提高植物的耐盐性。因此，该基因在今后的观赏植物耐盐工程中具有很大的应用潜力。

本发明提供了白花野蔷薇中表达RmNHX2的基因编码序列及其功能，具体包括：RmNHX2基因的核苷酸编码序列的克隆，表达载体构建，以及转化此基因于烟草内，进行分子鉴定和表型观察。

本发明首先从白花野蔷薇中克隆出RmNHX2功能基因。该基因片段为具有特定序列的DNA分子，其开放阅读框为1632bp。本发明分离克隆的包含有RmNHX2基因编码区的DNA片段(其中1-1632bp为CDS)如序列表SEQ ID N0：1所示，序列全长为1632bp，编码543个氨基酸。

本发明还提供了这种白花野蔷薇RmNHX2蛋白编码序列，它有543个氨基酸残基，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了用于获得白花野蔷薇样品中基因RmNHX2的一对核苷酸引物。该引物根据基因RmNHX2设计，使用该对引物对蔷薇花瓣样品cDNA进行PCR扩增可获得1632bp的基因片段。该引物对的DNA序列如下所示：

P1正向引物:5’ATGGCTTCTCATTTGGCCAT 3’(见序列表SEQ ID NO：3)

P2反向引物:5’TCATTGCCATTGAGTGTTGTTC3’(见序列表SEQ ID NO：4)。

本发明还提供了一对检测白花野蔷薇RmNHX2基因在转基因烟草中表达的核苷酸引物。该引物根据基因RmNHX2设计，使用此对引物对转化该基因的烟草样品cDNA进行RT-PCR扩增，检测该基因是否在转基因烟草中表达，可获得210bp的基因片段。该引物对的DNA序列为：

P3正向引物:5’TCCTCTGTTGTCTCGTTGAACCTTT3’(见序列表SEQ ID NO：5)

P4反向引物:5’GATGCGAACTTTTTCCTCCACTG 3’(见序列表SEQ ID NO：6)。

本发明可利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，通过直接DNA转化、电导、农杆菌介导等常规生物技术方法，将本发明提供的RmNHX2的编码基因导入植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。使用本发明的基因片段构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前面，可加上任意一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或者植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记物(例如卡那霉素或潮霉素等)。被转化的宿主是包括烟草在内的多种植物，培育耐盐性显著增强的植物种类。

实施例1：分离克隆RmNHX2基因及其超量植物表达载体构建

本发明的前期为了鉴定白花野蔷薇基因组中NHXs的存在，利用白花野蔷薇基因组数据库(http://rosa.kazusa.or.jp/)进行生物信息学分析，发现1个新的NHX基因，命名为RmNHX2。设计特异引物P1(见序列表SEQ ID NO：3)正向引物5’ATGGCTTCTCATTTGGCCATGTT3’和P2(见序列表SEQ ID NO：4)反向引物5’TCATTGCCATTGAGTGTTGTTC3’，将测序序列的1-1632bp从白花野蔷薇花瓣RNA反转录得到的cDNA中扩增出来，扩增得到的片段如序列表SEQID N0：1所示。扩增产物中的1-1632bp就是本发明的序列。

具体步骤为：

采用常用的CTAB法(参照：《植物基因工程》，王关林，方宏筠主编)从白花野蔷薇提取花瓣总RNA，具体步骤如下：

1、向离心管中加入CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液(2％(W/V)CTAB，NaCl 1.4mol/L，EDTA(乙二胺四乙酸)20mmol/L，Tris·Cl 100mmol/L，2％(W/V)pvp)和10％(V/V)的β-巯基乙醇，在水浴锅中预热。

2、将野蔷薇花瓣用液氮冷却研磨，加入提取液中，混匀，65℃水浴10分钟。

3、加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比24：1)混合液，颠倒混匀，静置10min，4℃下12000g离心10min。

4、取上清，重复步骤3。

5、取上清，加入终浓度为2mol/L的LiCl，冰浴10-12小时，12000g，4℃离心15分钟，弃上清，用75％(V/V)乙醇清洗沉淀两次，溶于适量的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水中待用。

6、以从白花野蔷薇中提取花瓣总RNA为模板，利用反转录酶(购自宝生物工程大连有限公司)将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为：65℃5min，42℃50min，70℃10min。

7、根据转录测序中的序列设计的特异引物P1(见序列表SEQ ID NO：3)5’ATGGCTTCTCATTTGGCCAT3’和P2(见序列表SEQ ID NO：4)5’TCATTGCCATTGAGTGTTGTTC3’，将RmNHX2从野蔷薇RNA反转录得到的cDNA中扩增出来。

反应条件：94℃预变性4min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，37个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物连入

18-T载体(购自宝生物工程大连有限公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因。该克隆被命名为

18-RmNHX2质粒，转化大肠杆菌感受态DH5a中。根据基因的核苷酸序列和pCAMBIA2300s酶切位点，选用BamHI和Sal1位点。得到的阳性克隆

18-RmNHX2质粒用BamHⅠ和SalⅠ双酶切，回收目的片段；同时，用同样的方法酶切携带双烟草花叶病毒启动子35S的遗传转化载体pCAMBIA2300s(该遗传转化载体来自湖北省武汉市华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室构建和赠送)。酶切完毕，用包含RmNHX2基因的酶切片段和酶切的pCAMBIA2300s(图1)载体做连接反应，转化大肠杆菌DH5α(大肠杆菌菌株购自宝生物工程大连有限公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得转化载体，将其命名为pCAMBIA2300s-RmNHX2(图2)。

实施例2：RmNHX2的亚细胞定位分析

根据基因的核苷酸序列和pHBT-GFP-NOS酶切位点，选用BamHI和Sal1位点。将测序结果正确的目的基因提取质粒作为模板，PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，37个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶试剂盒回收目的条带。回收纯化的扩增片段克隆到

18-T载体中，转化大肠杆菌感受态DH5a中。将转化后的菌液用PCR检测，PCR鉴定呈阳性的菌液送去测序，双酶切回收目的片段，经T4-DNA连接酶连接，16度过夜，转化大肠杆菌感受态DH5a，将得到的重组载体命名为pHBT-RmNHX2-GFP。

采用原生质体转化的试剂和方法，所用试剂：拟南芥原生质体酶解液：0.4M甘露醇；1％纤维素酶；0.1％离析酶；5mM MES；0.1％果胶酶。

方法：在55度水浴中加热10min，使各种蛋白酶失活，同时增强纤维素酶等的溶解性，然后冷却到室温，再加入以下两种试剂：0.15％BSA和8mM氯化钙；MaMg溶液：0.4M甘露醇；0.1％氯化镁；4mM MES；W5溶液)：154mM NaCl；125mM氯化钙；5mM KCl；2mM MES；PEGsolution(40％，v/v)。

将10μg RmNHX2-GFP质粒与100μL拟南芥原生质体(10⁵/mL)轻轻混合，在23℃孵育12h。激光扫描显微镜下(LSM410,卡尔蔡司),在拟南芥原生质体分别检测绿色和红色荧光信号。

实施例3：RmNHX2烟草遗传转化

为了能更好地阐明该基因的功能，申请人将其在烟草中超量表达，从转基因植株的表型来验证。通过农杆菌介导的烟草遗传转化方法将其导入到烟草NC89中，经过侵染、共培养、筛选同时具有卡那霉素抗性的转化苗，再通过生根、练苗移栽等常规步骤，得到转基因植株(图4)。

本发明的遗传转化的主要步骤和应用试剂如下所述：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄氨基嘌呤)；NAA(Naphthalene acetic acid，萘乙酸)；Kan(Kanamycin，卡那霉素)；Cef(Cefotaxime，头孢霉素)。

(2)用于烟草遗传转化的培养基配方

表1列出了本发明的各种培养基的成分及其用量。

表1：烟草转化培养基

注：MS培养基的配制参见：Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant，1962，15:473-497报道的方法。

表1中的Kan(Kanamycin，卡那霉素)、Cef(Cefotaxime，头孢霉素)，采用0.45μm滤膜过滤方法灭菌，在上述除Kan、Cef成分以外的培养基经常规121℃高压蒸汽灭菌20min后，待培养基冷却至50-60℃时，在超净工作台上加入。

(1)农杆菌介导的遗传转化步骤

1)农杆菌的培养

首先，在带有对应抗性选择的固体LB培养基(10g/L蛋白胨+5g/L酵母提取物+10g/L氯化钠+Kan100mg/L+琼脂1.5g/L)上预培养农杆菌EHA105 48小时，培养温度28℃；挑取预培养农杆菌单菌落，接种于对应抗性选择的液体LB培养基(10g/L蛋白胨+5g/L酵母提取物+10g/L氯化钠+Kan100mg/L)中，于28℃200rpm摇床培养过夜，至菌液浓度OD₆₀₀值大约为0.6。

2)叶盘转化法

a.剪取烟草无菌苗上部完全展开的幼嫩叶片，将叶片剪成0.8cm×0.8cm大小小块，放入无菌烧杯中；

b.将准备好的菌液倒入烧杯，轻轻摇晃烧杯。叶片在菌液中浸泡10min；

c.将步骤b中的叶片取出，转移至灭好菌的滤纸上吸干；然后放置在如上所述的共培养培养基上暗培养三天，培养温度为28℃；

d.三天后，将叶片转入如表1所述的出芽选择培养基上，光照和暗培养交替(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)下培养，进行Kan和Hyg抗性芽的筛选分化，培养温度为28℃；

e.抗性芽形成后，将其切下，转入如上所述的壮苗选择培养基上，在光照和暗培养交替(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)下培养，进行Kan和Hyg抗性苗的筛选，培养温度为28℃；

f.将筛选得到的抗性苗转入如上所述的生根选择培养基上使其生根，在光照和暗培养交替(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)下培养，培养温度为28℃。

3)移栽

洗掉转基因烟草植株根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的一个周内保持水分湿润。

结果共获得10个株系的PCR检测结果为阳性的转入质粒pCAMBIA2300s-RmNHX2的T₀代转基因烟草。

实施例4：RmNHX2基因转基因T₀代在田间的表型观测与RT-PCR检测

为了验证RmNHX2是否已转入烟草及其表达情况，本发明采用了常用的RT-PCR方法对部分转基因烟草植株中RmNHX2基因表达进行了检测(结果见图5)。具体步骤如下：

采用TRIZOL试剂(购自宝生物工程大连有限公司)从转基因烟草1-3号株系中提取花的总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书操作)，利用反转录酶(购自宝生物工程大连有限公司)将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为65℃5min，42℃50min，70℃10min。先用报道的看家基因EF1α对反转录得到的cDNA进行检测和浓度调整，根据看家基因EF1α的序列设计一对引物P5(见序列表SEQ ID NO：7)正向引物(5-TCCTCTGTTGTCTCGTTGAACCTTT)和P6(见序列表SEQ ID NO：8)反向引物(5-GATGCGAACTTTTTCCTCCACTG)，进行PCR检测，反应条件为：94℃预变性4min；94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，28个循环；72℃延伸10min。试验结果如图3所示，看家基因EF1α在野生型烟草和转基因烟草中均能扩出，并且亮度一致。然后，根据RmNHX2基因的序列，在靠近3’端设计一对引物P3(见序列表SEQ ID NO：5)正向引物(5-TCCTCTGTTGTCTCGTTGAACCTTT-3)和P4(见序列表SEQ ID NO：6)反向引物(5-GATGCGAACTTTTTCCTCCACTG-3)，进行RT-PCR检测，反应条件为：94℃预变性4min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。

试验结果表明，3株转基因烟草内均检测到有RmNHX2基因的表达，结果如图5所示。图5中显示：1-3为转入质粒pCAMBIA2300s-RmNHX2的转基因烟草的RT-PCR扩增结果；4为没有转化的烟草的PCR扩增结果。

实施例5:转RmNHX2烟草耐盐性测定

为了能更好地阐明该基因的功能，申请人选用，OE1、OE7和OE9用半定量RT-PCR鉴定为三个超表达系，设计了一系列的实验来阐明RmNHX2对盐胁迫的响应功能。盆栽30dRmNHX2过表达烟草株系和野生型(WT)，每隔3d喷施200mM NaCl，连续喷施2周(图6)。每次处理重复3次结果一致。盐胁迫后，对其进行了生理生化和基因表达检测。

(1)DAB和NBT组织化学染色分析步骤

对O₂ ^-的检测，叶片浸在1mg ml^-1NBT溶液中(PH7.8磷酸缓冲液)1-2h叶片有明显表型(叶片蓝色)。H₂O₂的检测，叶片浸在1mg ml^-1pH7.8磷酸缓冲液的DAB工作液中(pH7.8)，光下染色8个小时，等有明显表型进行脱色(褐色)，再用无水乙醇将叶片绿色完全脱除后，随后叶片保持在70％乙醇中直到拍照。

盐处理下，NBT结果表明其对照叶片的染色程度都较深，说明其体内的超氧阴离子含量较多，表明叶片在盐处理过程中，叶片受伤害程度加深，体内超氧阴离子含量增加；转基因的超氧阴离子含量较少，表明转RmNHX2基因株系的叶片受到的伤害较小。

将转基因和野生型苗的叶片在盐处理后分别进行DAB染色，盐处理后，转基因和野生型叶片的染色程度都加深，但是转基因植株颜色较对照浅，说明转基因的H2O2含量比野生型的低，表明了转基因株系耐盐性增强。

(2)金属离子测定分析步骤

在盐胁迫后，分别收获转基因植株叶片和根，经蒸馏水浸洗数次后，在80℃高温条件下烘干48h至恒重，用100mM醋酸于90℃恒温水浴箱中提取2h，将提取液分成两组，并用M410型火焰光度计测定叶片Na⁺、K⁺浓度和根部Na⁺、K⁺浓度并进一步计算叶片及根部Na⁺/K⁺

盐处理下，转基因烟草叶片、根中Na⁺含量显著低于野生型植株，而转基因烟草叶片、根中K⁺含量显著高于野生型植株，表明转基因烟草耐盐性显著提高。

(3)叶绿素含量的测定步骤

取一定量的叶片组织的样品研磨均匀后加入80％丙酮放入室温避光15min，粗提液离心，室温，10000g，20min，上清液(叶绿素色素提取液)用分紫外分光仪(Shimadzu UV-1600，Japan)在波长663、645和480nm测其吸光度。计算公式参考李合生植物生理生化学实验原理和技术第2版。

盐处理下，转基因植株叶绿素含量要显著高于野生型植株，说明转基因植株耐盐性增强(图7)；NBT结果表明其对照叶片的染色程度都较深，说明其体内的超氧阴离子含量较多，表明叶片在盐处理过程中，叶片受伤害程度加深，体内超氧阴离子含量增加；转基因的超氧阴离子含量较少，表明转RmNHX2基因株系的叶片受到的伤害较小(图8)。

将转基因和野生型苗的叶片在水处理和盐处理后分别进行DAB染色，图9说明水处理的叶片染色较浅，转基因和野生型之间没有差异，但是盐处理后，转基因和野生型叶片的染色程度都加深，但是转基因植株颜色较对照浅，说明转基因的H₂O₂含量比野生型的低，表明了转基因株系耐盐性增强。

盐处理下，转基因植株叶和根中钠离子含量要显著低于野生型植株，而转基因植株叶和根中钾离子显著高于野生型植株，表明转基因植株积累的较少的钠离子，表现为耐盐性增强(图10)。

序列表

<110> 浙江农林大学

<120> 白花野蔷薇RmNHX2基因及其提高植物耐盐性的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1632

<212> DNA

<213> 白花野蔷薇(Rosa multiflora Thunb)

<400> 1

atggcttctc atttggccat gttgatgacc aagttaccca aattgcaaaa tctatctgct 60

tctgatcact cctctgttgt ctcgttgaac cttttcgtgg cactactttg tgcttgtatt 120

gtgattgggc atcttcttga ggagaatcgg tgggtgaatg agtcaatcac cgcccttttg 180

attggggtgt ctactggagt acttattctt ctgatcagtg gaggaaaaag ttcgcatctt 240

ttagtattca gtgaagatct tttctttatt taccttctac cacctattat ttttaatgcc 300

gggtttcagg tgaaaaagaa gcagtttttc cgtaatttca ttactattgt aatgttcggt 360

gctattggta cattagtatc ctgcaccatc atatcatttg gtgctgcaca aatctttaag 420

aaattggaca ttggttcgct ggacataggg gattatctcg caattggtgc aatatttgct 480

gctacggatt ctgtatgcac gttgcaggtg ctccatcagg atgagactcc tttactgtac 540

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atccagagct ttgatctaac acaccttgat tccagaatcg ccttgaagtt tatgggcaac 660

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tcaagagtca caaccaagca tgcttttgca accttggcat ttgtttgcga gacttttatc 960

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cctggaacgt cagtggcagt gagttcaata ctgctaagtc ttgttatgct tggaagagca 1080

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atagcgcttg cttataatca gtttacaaga tctggtcaca ctcaattgcg agcaaatgca 1260

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acgaaacctc ttattagatt attgctgcct cataaacaat tgaccagcac aaacagcatt 1380

atgtcagacc caccctctcc aaaaccagtc attgttccac ttcttgggca ggattctgaa 1440

gctgatctga gcggtcatga ggtgcgtcgt ccagccagca tacgtgatct tctgacgact 1500

ccaacacaca ctgtacatcg ctactggcgt aagtttgata atgctttcat gcgtccagta 1560

tttggtggtc ggggttttgt tccctttgtt cccggctcac caactgaacg gaacaacacg 1620

caatggcaat ga 1632

<210> 2

<211> 543

<212> PRT

<213> 白花野蔷薇(Rosa multiflora Thunb)

<400> 2

Met Ala Ser His Leu Ala Met Leu Met Thr Lys Leu Pro Lys Leu Gln

1 5 10 15

Asn Leu Ser Ala Ser Asp His Ser Ser Val Val Ser Leu Asn Leu Phe

20 25 30

Val Ala Leu Leu Cys Ala Cys Ile Val Ile Gly His Leu Leu Glu Glu

35 40 45

Asn Arg Trp Val Asn Glu Ser Ile Thr Ala Leu Leu Ile Gly Val Ser

50 55 60

Thr Gly Val Leu Ile Leu Leu Ile Ser Gly Gly Lys Ser Ser His Leu

65 70 75 80

Leu Val Phe Ser Glu Asp Leu Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Pro Pro Ile

85 90 95

Ile Phe Asn Ala Gly Phe Gln Val Lys Lys Lys Gln Phe Phe Arg Asn

100 105 110

Phe Ile Thr Ile Val Met Phe Gly Ala Ile Gly Thr Leu Val Ser Cys

115 120 125

Thr Ile Ile Ser Phe Gly Ala Ala Gln Ile Phe Lys Lys Leu Asp Ile

130 135 140

Gly Ser Leu Asp Ile Gly Asp Tyr Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala

145 150 155 160

Ala Thr Asp Ser Val Cys Thr Leu Gln Val Leu His Gln Asp Glu Thr

165 170 175

Pro Leu Leu Tyr Ser Leu Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala

180 185 190

Thr Ser Val Val Leu Phe Asn Ala Ile Gln Ser Phe Asp Leu Thr His

195 200 205

Leu Asp Ser Arg Ile Ala Leu Lys Phe Met Gly Asn Phe Leu Tyr Leu

210 215 220

Phe Phe Ala Ser Thr Met Leu Gly Val Ile Thr Gly Leu Leu Ser Ala

225 230 235 240

Phe Ile Ile Lys Lys Leu Tyr Phe Ala Arg His Ser Thr Asp Arg Glu

245 250 255

Val Ala Leu Met Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Ile Leu Ala Glu

260 265 270

Leu Phe Tyr Leu Ser Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile Val

275 280 285

Met Ser His Tyr Thr Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg Val Thr

290 295 300

Thr Lys His Ala Phe Ala Thr Leu Ala Phe Val Cys Glu Thr Phe Ile

305 310 315 320

Phe Leu Tyr Val Gly Met Asp Ala Leu Asp Ile Glu Lys Trp Arg Phe

325 330 335

Val Ser Asp Ser Pro Gly Thr Ser Val Ala Val Ser Ser Ile Leu Leu

340 345 350

Ser Leu Val Met Leu Gly Arg Ala Ala Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe

355 360 365

Phe Ser Asn Leu Phe Lys Lys Asn Gln Ser Glu Lys Ile Ser Leu Gln

370 375 380

Gln Gln Val Val Ile Trp Trp Ala Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser

385 390 395 400

Ile Ala Leu Ala Tyr Asn Gln Phe Thr Arg Ser Gly His Thr Gln Leu

405 410 415

Arg Ala Asn Ala Ile Met Ile Thr Ser Thr Ile Ser Val Val Leu Val

420 425 430

Ser Thr Val Val Phe Gly Leu Met Thr Lys Pro Leu Ile Arg Leu Leu

435 440 445

Leu Pro His Lys Gln Leu Thr Ser Thr Asn Ser Ile Met Ser Asp Pro

450 455 460

Pro Ser Pro Lys Pro Val Ile Val Pro Leu Leu Gly Gln Asp Ser Glu

465 470 475 480

Ala Asp Leu Ser Gly His Glu Val Arg Arg Pro Ala Ser Ile Arg Asp

485 490 495

Leu Leu Thr Thr Pro Thr His Thr Val His Arg Tyr Trp Arg Lys Phe

500 505 510

Asp Asn Ala Phe Met Arg Pro Val Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro

515 520 525

Phe Val Pro Gly Ser Pro Thr Glu Arg Asn Asn Thr Gln Trp Gln

530 535 540

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcttctc atttggccat 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcattgccat tgagtgttgt tc 22

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcctctgttg tctcgttgaa ccttt 25

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatgcgaact ttttcctcca ctg 23

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcctctgttg tctcgttgaa ccttt 25

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatgcgaact ttttcctcca ctg 23

Claims

1.一种白花野蔷薇RmNHX2基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种如权利要求1所述白花野蔷薇RmNHX2基因的编码蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种用于获得如权利要求1所述白花野蔷薇RmNHX2基因的引物，其特征在于，包括P1正向引物和P2反向引物等。P1正向引物如SEQ ID NO：3所示，P2反向引物如SEQ ID NO：4所示；利用P1正向引物和P2反向引物进行PCR扩增获得白花野蔷薇RmNHX2基因。

4.一种用于检测如权利要求1所述白花野蔷薇RmNHX2基因在转基因植物中表达的引物，其特征在于，包括P3正向引物和P4反向引物等。P3正向引物如SEQ ID NO：5所示，P4反向引物如SEQ ID NO：6所示；使用P3正向引物和P4反向引物对转化白花野蔷薇RmNHX2基因的植物进行RT-PCR扩增，检测白花野蔷薇RmNHX2基因是否在转基因植物中表达。

5.如权利要求4所述引物，其特征在于，所述植物为烟草。

6.一种如权利要求1所述白花野蔷薇RmNHX2基因的应用，其特征在于，提高植物耐盐性。

7.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述植物为烟草。