CN101824079A - 荞麦Na+/H+逆向转运蛋白FtNHX及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，提供了一种荞麦Na+/H+逆向转运蛋白FtNHX，为具有序列表中的SEQ ID No：2氨基酸残基序列的蛋白质，或序列表中的SEQ ID No：2经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No：2氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No：2衍生的蛋白质。编码此蛋白的基因优选为包括SEQ ID No：1第288～1949位的核苷酸序列；或者是与SEQ ID No：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。本发明还提供了重组载体的构建、转基因植物等方法以应用上述基因和蛋白质，可培育耐盐性更强或其他生物学性状得到改善的转基因植物新品种。

Description

荞麦Na+/H+逆向转运蛋白FtNHX及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种重要的离子转运蛋白及其编码基因与应用，具体是一种Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及荞麦的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

盐害是农作物产量的重要限制因素。了解植物的抗盐机理，克隆抗盐基因并转移到盐敏感的农作物中，培育抗盐的转基因新品种，对于有5亿多亩盐荒地的中国来说，具有十分重要的意义。

植物为了抵御盐胁迫，形成了一系列的耐盐机制，其中主要是通过在细胞质中积累小分子的无毒有机溶质和离子，以及在液泡内区隔化来实现渗透平衡。在高钠盐环境中，植物通常依赖降低Na⁺的吸收、外排Na+和区隔化Na+来保持胞质内低Na⁺浓度，其中的Na⁺的外排和区隔化是间接的主动运输过程，主要由Na+/H+逆向转运蛋白来调节。Na⁺/H⁺逆向转运蛋白(Na+/H+antiporter or exchanger)是细菌、藻类、动物和高等植物的膜系统上普遍存在的一种转运蛋白，参与细胞内的pH、Na⁺浓度调节及细胞体积变化等生命活动。其在细胞质膜和液泡膜上均有分布，质膜上的Na+/H+逆向转运蛋白将胞质中的Na+逆向排出细胞，液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白将胞质中的Na+逆Na+浓度梯度运送到液泡中进而将Na+区隔化集中。该蛋白依赖水解ATP或PPi产生跨质膜或液泡膜的H+电化学势梯度提供能量，使H+顺其电化学势进入细胞质，同时将Na+逆其电化学势排出细胞或区隔进液泡里，从而降低细胞质中Na⁺的浓度，使过多的Na+离开代谢位点，减轻其对酶和膜系统的伤害，同时降低细胞水势，抵抗盐分造成的渗透胁迫。综上所述，Na+/H+逆向转运蛋白对植物解除Na⁺离子毒害，适应盐性环境具有重要作用，是植物耐盐的关键因素。植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的克隆、表达、结构与功能的研究，将有利于在分子水平上更深刻地了解该基因，进而通过基因改造、转基因等手段培育出耐盐性状改良的植物新品种，这对于农业生产、环境保护和生态治理等都具有重要的意义。

植物的耐盐是一个复杂的性状，盐胁迫后出现的一系列差异表达的盐胁迫相关基因的存在也支持和证实了这个观点。一般认为，单一基因一般不能显著提高作物的耐盐水平，需要多个耐盐基因的协同作用植物才能提高耐盐性。然而，最近有研究发现转Na⁺/H⁺antiporter单基因能够明显提高植物的耐盐性。Apse等将AtNHX1转入拟南芥，获得了可在200mmol/L NaCl中正常生长发育的转基因植株；进一步分析转基因植株，发现其Na⁺/H⁺交换率及叶片Na+浓度均比野生型植株高，且转基因植株更高的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白活性和AtNHX1蛋白量的升高相一致。Zhang等又将AtNHX1转入油菜，同样发现过量表达该蛋白的转基因油菜在200mmol/L NaCl的环境中也能够正常生长、开花和结实，而转基因油菜产量和油的品质未受到高盐的影响。这些实验均证实了Na⁺/H⁺antiporter在植物耐盐性方面所具有的重要作用及不可估量的应用潜力与价值。

荞麦起源于中国，栽培历史悠久，营养丰富，是一种重要的粮食作物。另外它抗逆性强，极耐寒瘠，又是一种不可忽视的非常有价值的自然资源。目前关于荞麦的研究多集中在品质营养和栽培管理方面，在分子遗传育种和耐盐基因克隆改造方面还没有相关报道。

发明内容

本发明旨在提供一种新的荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白FtNHX。

本发明另一个目的在于提供荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因FtNHX。

本发明还提供了含有上述基因的重组载体。

本发明另一方面，提供了含有上述基因和重组载体的宿主细胞。

本发明还提供了将上述基因和编码蛋白在培育具有耐盐性的转基因植物新品种方面的应用。

一种荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白FtNHX，为以下蛋白质之一：

(1)具有序列表中的SEQ ID：2氨基酸残基序列的蛋白质，或，

(2)序列表中的SEQ ID：2经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No：2氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No：2衍生的蛋白质。

一种荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的基因FtNHX，为编码上述荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白FtNHX的核苷酸序列。

优选为包括SEQ ID：1第288～1949位的核苷酸序列；或者是与SEQ ID：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

一种重组载体，含上有述荞麦Na⁺/H⁺向转运蛋白的基因FtNHX的完整编码阅读框。

一种宿主细胞，含有上述荞麦Na⁺/H⁺向转运蛋白的基因FtNHX的完整编码阅读框。

上述荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的基因FtNHX可应用于培育抗盐植物，将所述荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的基因FtNHX通过微注射、基因枪、农杆菌介导、花粉管通道的方法转入植物中，培育出耐盐性及生物学性状得到改善的植物新品种。

含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。

本发明的转基因重组载体可作为商业用途的品种、品系或作为基因资源在生产上直接使用或进行农业生物育种和转基因植物以提高作物的抗盐性或改良其他生物学性状。

克隆上述荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的基因FtNHX的方法包括：根据生物中已克隆的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的氨基酸序列，设计简并引物，通过RT-PCR及RACE方法从荞麦中克隆出了Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因FtNHX。可利用RACE(cDNA末端快速分离)技术克隆未知基因，具体步骤为，根据GenBank中Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的保守氨基酸序列设计1对简并性引物：

dpNHXF：5’-CC(A/T)CC(G/C)AT(C/T)AT(A/C)TTCAATGCA GG(C/G/T)TTTCA-3’

dpNHXR：5’-(T/A/C)ACAACACC(C/T)TC(A/G/T)CC(A/G)AA(G/T)AC(A/C)AGACTGTA-3’

以总RNA反转而来的第一链cDNA为模板，通过RT-PCR得到FtNHX的保守片段。根据该片段，分别设计扩增3’和5’端cDNA的基因特异性引物，分别进行RACE反应，最后将得到3’和5’端cDNA，进行拼接，得到FtNHX全长。

将本发明得到的基因FtNHX连接到任何酵母表达载体，如pYPGE15中，利用本领域共知的方法如乙酸锂法，转化酵母Na⁺/H⁺逆向转运蛋白突变体，如双突变株W303Δena1-4Δnhx1，分别点种在含不同浓度的NaCl、KCl、LiCl的APG平板上，以验证FtNHX基因对酵母突变体的互补功能。与盐敏感的酵母双突变体进行的功能互补实验结果表明，该基因能一定程度上恢复其抗盐能力。该基因可以用于本身及其他植物进行遗传转化，为植物的遗传改良、培育植物耐盐新品种提供了新的思路。

以耐盐Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因FtNHX作为目的基因，可以构建在任何植物表达的载体中；通过本领域公知的研究方法如冻融法、电击法等将上述重组载体导入农杆菌中，进行农杆菌转化。可通过微注射、基因枪、农杆菌介导、花粉管通道方法等常规生物技术方法将耐盐Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因FtNHX转入植物中，培育出抗盐品质优良及生物学性状得到改善的植物新的品种。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物，如拟南芥，烟草，番茄，油菜，水稻，小麦，玉米，大豆，蔬菜，树木，花卉，牧草和草坪草等。本发明的基因对于培育抗盐植物品种，提高农作物产量、改善生态环境等具有重要的意义。

附图说明

图1为荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白FtNHX与其他植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的氨基酸序列比对

图2为荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白FtNHX与其他物种的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白亲缘关系的进化树分析

图3为荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因FtNHX转入酵母双突变株W303-1BΔena1-4Δnhx1中功能互补实验比较

其中：I为含有pYPGE15质粒的野生型W303-1B酵母菌株，II为含有pYPGE15质粒的W303-1BΔena1-4Δnhx1::HIS3Δnhx1::TRP1双突变酵母菌株，III为含有PYPGE15-FtNHX重组质粒的W303-1BΔena1-4::HIS3Δnhx1::TRP1双突变酵母菌株。

(A)APG对照组，即三种细胞在pH5.5，不含盐的APG平板上生长情况。

(B)100mMNaCl处理组，即三种细胞在pH5.5，含100mMNaCl的APG平板上生长情况。

(C)1.5MKCl处理组，即三种细胞在pH5.5，含1.5MKCl的APG平板上生长情况。

(D)2.5mMLiCl处理组，即三种细胞在pH5.5，含2.5mMLiCl的APG平板上生长情况。

具体实施方式

实施例1荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白编码基因的获得

1.1简并引物设计

通过比较生物中已克隆的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白氨基酸的序列，寻找保守区域，并根据保守区域序列设计1对简并引物：

dpNHXF：5’-CC(A/T)CC(G/C)AT(C/T)AT(A/C)TTCAATGCA GG(C/G/T)TTTCA-3’

dpNHXR：5’-(T/A/C)ACAACACC(C/T)TC(A/G/T)CC(A/G)AA(G/T)AC(A/C)AGACTGTA-3’

1.2荞麦总RNA的提取

使用RNAiso Reagent试剂盒(TAKARA Code：D312)从荞麦(F.tataricum Gaertn)中提取RNA。采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和质量，用含甲醛的琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性。

1.3荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白特异性小片段的扩增

采用TaKaRa公司AMV反转录酶合成荞麦的第一链cDNA。反转录反应体系为：小于500ng的RNA模板，1μL 10×RT Buffer，2μL MgCl₂，3.75μL RNase FreedH₂O，1μL dNTP(10mM)，0.25μLRNase Inhibitor，0.5μL Oligo dT-AdaptorPrimer，0.5μL AMV逆转录酶，42℃反应60min，95℃变性5min，5℃5min。

利用上述cDNA为模板，用设计的两条简并引物进行PCR反应。PCR反应体系为：5×PCR Buffer10μL，dH₂O 28.75μL，简并引物各0.5μL，TaKaRa Ex TaqH S0.25μL，加入反转录后的10μLcDNA溶液，轻轻混匀，配成50μL反应液。反应条件：94℃变性3min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环35次；72℃延伸5min。取5μL反应产物，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。得到了一条约280bp左右的DNA片段。凝胶回收纯化后，将其与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，利用蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，提质粒，EcoRI酶切质粒鉴定插有预期大小片段(280bp)的阳性克隆，对测序结果进行BLASTp分析表明，获得的288bp cDNA序列与已克隆的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因具有较高的同源性，证实该片段是荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的部分编码基因。

1.4荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白cDNA全长序列的获得

以获得的保守cDNA片段序列为基础，设计用于扩增5’端和3’特异引物：

FTGSP5’：5’-GGAGATCCAGCTCTGTCACACCCAGT-3’

FTGSP3’：5’-CCTTCTGCCTTATCTCCCTTGGTGCT-3’

按照SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)的方法进行RT-PCR。3’RACE和5’RACE反应都采用试剂盒推荐的扩增循环参数：95℃预变性1min；95℃变性30sec，68℃退火延伸3min，32个循环；68℃延伸3min。产物经琼脂糖凝胶电泳检测3’RACE产物大小约为1500bp，5’RACE产物大小约为750bp。产物经回收纯化，连接，转化，酶切鉴定，测序。借助DNA拼接软件contig，获得该基因的cDNA的完整序列，按此序列设计特异引物(两端加有酶切位点，便于构建表达载体)，用常规RT-PCR方法克隆荞麦Na⁺/H⁺Antiporter基因全长cDNA序列。

实施例2荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因FtNHX全序列分析

该序列全长为2052bp，具有SEQ ID No.1的DNA序列，288-1949bp为其完整编码区域，编码的蛋白含有553个氨基酸残基，具有SEQ ID No.2的氨基酸残基序列。

该cDNA包括1662bp的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，287个碱基的5’非翻译区(Non Translated Region，NTR)，75个碱基的3’非翻译区和28个碱基的多聚腺苷酸尾。将该基因命名为FtNHX，所编码的蛋白命名为FtNHX。

FtNHX的氨基酸序列与已克隆的其他Na⁺/H⁺逆向转运蛋白具有较高的同源性。用生物信息学方法预测FtNHX具有所有Na⁺/H⁺逆向转运蛋白共同的结构特点，即含有疏水的N末端，8个跨膜区和一个具有调节功能的C端亲水区，其中LFFIYLLPPI是高度保守的，这是Na⁺/H⁺逆向转运蛋白活力的竞争性抑制剂氨氯吡嗪嘧结合位点。

荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白FtNHX与其他植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的氨基酸序列比对和亲缘关系的进化树分析分别如图1和图2所示。

图1中加黑部分是一致性的氨基酸，黄色虚线框起来的是氨氯吡嗪嘧结合位点。为了分析不同Na⁺/H⁺逆向转运蛋白之间的遗传关系，发明人进行了系统发育分析，用Phylip对氨基酸序列进行分析。从GenBank中查找一些有代表性的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的氨基酸序列，分析FtNHX与它们之间的关系(如图1所示)。FtNHX与IC-NHE即液泡型的I型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的亲缘较近，这类蛋白典型的有AtNHX1-4，Zm NHX1，该类蛋白的功能是在液泡膜上将Na⁺区隔化到液泡中。FtNHX与PE-NHE质膜型的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白亲缘关系较远，可以看出FtNHX是液泡型的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白。上述逆向转运蛋白氨基酸在GenBank登陆号为：AtNHX1_AAF21755；AtNHX2_AAM08403；AtNHX3_NP_200358；AtNHX4_AAM08405；AtNHX5_AAM08406；AtNHX6_AAM08407；AtNHX7_AAF76139；AtNHX8_NP172918[Arabidopsis thaliana]；ZmNHX1_AAP20428[Zea mays]；TANHX1_AAP55209[Triticum aestivum]；InNHX1_BAB16381[Ipomoea nil]；GhNHX1_AAM54141[Gossypium hirsutum]；GmNHX1_AAR27596[Glyc ine max]；AgNHX1_AB038492[Atriplex gmelini]；PeSOS1_ABF60872[Populuseuphratica]；OsNHX6_AAQ74383；OsSOS1_AAW33875[Oryza sativa]；PaSOS1_BAF41924[Phragmites australis]；McSOS1_ABN04858[Mesembryanthemumcrystallinum]。

实施例3表达载体FtNHX-pYPGE15的构建

3.1根据分离出的荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因FtNHX的核苷酸序列，在设计的引两端分别加有Xbal和Sal I的酶切位点序列和几个保护碱基，方便之后与载体的连接：

FTNHX-F：5’-GCTCTAGAATGTCGACCCTCATCGATCTT-3’

FTNHX-R：5’-GCGTCGACATGACTTCACTGAACATGATG-3’

以5’-RACE反应合成的cDNA为模板，进行PCR反应。

3.2PCR反应后的产物经琼脂糖凝胶电泳后用Nucleotrap Gel Extraction Kit(Clontech)回收，回收后的产物取5μL与pGM-T载体进行连接，操作步骤按TIANGEN产品pGM-T克隆试剂盒说明进行。然后转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100mg/ml)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。用碱法提取质粒DNA进行PCR鉴定，所得的阳性克隆再用TIANprep Mini Plasmid Kit提取纯度较高的质粒。

3.3用Xbal和Sal I两个限制性内切酶将FtNHX基因从pGM-T载体上切下，与相同酶酶切的pYPGE15连接，连接产物转化DH5α细胞，然后在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR和质粒DNA酶切鉴定分析。用试剂盒大量抽提pYPGE15-FtNHX阳性重组质粒。

实施例4荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因FtNHX对酵母Na⁺/H⁺逆向转运蛋白缺失突变体的功能互补实验

4.1酵母转化实验

采用乙酸锂法将pYPGE15-FtNHX重组载体转入双突变盐敏感型(W303-1BΔena1-4::HIS3Δnhx1::TRP1，质膜Na⁺泵功能和液泡膜型逆向转运蛋白功能均缺失)酵母菌株中做该基因的功能验证。另将pYPGE15(空载体)分别转入野生型(W303-1B)和双突变盐敏感型(W303-1BΔena1-4::HIS3Δnhx1::TRP1)酵母菌株中，作为阳性和阴性对照。均在含氨苄青霉素的APG选择性培养基(pH6.5)上生长2-3天，挑取单菌落，在液体APG培养基(pH6.5)中生长1-2天，利用E.Z.N.APlasmid Kit(Omega)提取酵母质粒DNA，进行PCR鉴定。

4.2点板

将含有空载体pYPGE15的野生型(W303-1B)、含有空载体pYPGE15的双突变盐敏感(W303-1BΔena1-4::HIS3Δnhx1::TRP1)的酵母菌株及含有pYPGE15-FtNHX的双突变盐敏感(W303-1BΔena1-4::HIS3Δnhx1::TRP1)酵母菌株接入APG液体培养基中(pH6.5)，生长24-36h。分别测量其OD₆₀₀的吸收值，并调节使得OD₆₀₀值为1.0。对菌液以10倍的比例(1∶1，1∶10，1∶100，1∶1000)进行系列稀释。每个稀释样取5μL点在含有不同盐梯度的APG平板上(各平板上从左到右依次为稀释1∶1、1∶10、1∶100、1∶1000的样品)，培养48h，观察其生长情况，结果如图3，其中图(A)、(B)、(C)和(D)依次为不含盐分的APG对照组、APG+1.5M KCl、APG+100mNaCl和APG+2.5mM LiCl，I～III依次为含有空载体pYPGE15的野生型(W303-1B)酵母菌株、含有空载体pYPGE15的双突变盐敏感(W303-1BΔena1-4::HIS3Δnhx1::TRP1)酵母菌株和含有pYPGE15-FtNHX的双突变盐敏感(W303-1BΔena1-4::HIS3Δnhx1::TRP1)酵母菌株。

序列表

 

<110>华东师范大学

<120>荞麦Na+/H+逆向转运蛋白FtNHX及其编码基因和应用

<130>none

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>2052

<212>DNA

<213>荞麦(F.tartaricum Gaertn)

<400>1

 

acatggggga ttcaccacca tccagtcttc cttgctcctg ttcaatggag aaaccaaaga     60

aaagaggaag aaaaaataat acaggcagag agaagattca aatctggaat gaatcaaatg    120

attgattact tgtttccaag ctccaaattt tgcgaatttt gtctcttatt tgtccttcat    180

ttttgtatat gtacacatga tctctatagt tttgggggaa attccacgca aatttcgaat    240

aaacaacttg taaatgccaa gcttacagct ttgaagcagt ggaagagatg tcgaccctca    300

tcgatcttct ctcatctaag cttcagaact catcattcaa caccaccacc gtcatagcaa    360

tcaccgtctt cttttctctc ctatgcgctt gcataatcat cggccatttg ctcgaagagc    420

atcgatgggc caacgaatcc atcaccgctc ttcttctggg tttgatatca ggaggggtag    480

tactgttgtt tagtaaagga cagagctcgc agatattgga gttcagtgag gagttattct    540

tcatttattt actccctcct atcattttca atgctggttt ccaggttaag aaaaaacaat    600

ttttcaagaa tttctccaca attttgttgt ttggagtcct tgggacaata atatccttct    660

gccttatctc ccttggtgct tttctgctgt tcaaaagact gggtgtgaca gagctggatc    720

tccaagacta tttggccgtt ggtgccatat tgtccgcgac agattcagtt tgtacattgc    780

aggttcttag tcaggatgat acaccattgc tttacagtat tgtgtttgga gaaggtgtag    840

ttaatgatgc tacctctata gtgcttttca atgccattca gtcactcgat ttcagtgaag    900

ttagtgccac gacagctttg agcttgattg ggaccttcct ctacctcttc ttcaccagca    960

ctcttcttgg tcttacggtt ggccttttaa gtgctttcat catcaagaca ctttacatcg  1020

gaaggcattc gacagatcgt gaaattgcaa tcatgatgct tatggcatat ctatcttaca  1080

tgataactga gcttattgat cttagcggga ttttgactgt tttcttttgt ggcattgtca  1140

tgtcacacta tacatggcat aacattaccg agagctcaag gattacaacc aagcatgcgt  1200

tcgccacaat gtcattcatt gcagaaacat tcatcttctt gtatgttggc atggatgcct  1260

tggacattga caaatggaaa gacagcaatg caagtgcagg aacgtcgttt gcagtgagtg  1320

caacactgct ggcattagtc ctgataggaa gagcagcgtt tgttttccca cttgcaggca  1380

ttgctaactg gacaaagaga agagaaggtg caaaacttcc ctttcgtaag cagttcatca  1440

tatggtgggc agggctgatg agaggtgcag ttactatagc tttgtcttac aatcagtttt  1500

cggattctga cgatgactca tcaacttcat cagagaattc actgatgata acaagtacca  1560

taattgtagt cctcttcagc actgtggtgt tcgggtcaat aacaaagcca ttgatagagg  1620

cgttgctagg acgcaatgtt ccatttgttt cagatgcgac tgatattccc agccttgaga  1680

gcttgaggta tctgttcatt gaagacggcg gagaaggcaa caataatgat gaggaaaaca  1740

aagagaatag cgaacctcgg agaaatggtt ggtgtttagg gatgctaata aggcatccga  1800

cgtggactgt gcatcatcta tggaggaaat ttgatgacaa gttcatgaga cctgtgtttg  1860

gtggaagagg ttttgtacct taccagcctg gtagtccaac tgaagctccg atacaaagta  1920

acatctttga tgaacatcat gttcagtgaa gtcatacaag aaacaaacac aaaatttgat  1980

gttttgtttg atttgagttt agagcaattc aaagtatttt cagcaaaaaa aaaaaaaaaa  2040

aaaaaaaaaa aa                                                      2052

 

<210>2

<211>553

<212>PRT

<213>荞麦(F.tartaricum Gaertn)

<400>2

 

Met Ser Thr Leu Ile Asp Leu Leu Ser Ser Lys Leu Gln Asn Ser Ser

1               5                   10                  15

Phe Asn Thr Thr Thr Val Ile Ala Ile Thr Val Phe Phe Ser Leu Leu

            20                  25                  30

Cys Ala Cys Ile Ile Ile Gly His Leu Leu Glu Glu His Arg Trp Ala

        35                  40                  45

Asn Glu Ser Ile Thr Ala Leu Leu Leu Gly Leu Ile Ser Gly Gly Val

    50                  55                  60

Val Leu Leu Phe Ser Lys Gly Gln Ser Ser Gln Ile Leu Glu Phe Ser

65                  70                  75                  80

Glu Glu Leu Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Pro Pro Ile Ile Phe Asn Ala

                85                  90                  95

Gly Phe Gln Val Lys Lys Lys Gln Phe Phe Lys Asn Phe Ser Thr Ile

            100                 105                 110

Leu Leu Phe Gly Val Leu Gly Thr Ile Ile Ser Phe Cys Leu Ile Ser

        115                 120                 125

Leu Gly Ala Phe Leu Leu Phe Lys Arg Leu Gly Val Thr Glu Leu Asp

    130                 135                 140

Leu Gln Asp Tyr Leu Ala Val Gly Ala Ile Leu Ser Ala Thr Asp Ser

145                 150                 155                 160

Val Cys Thr Leu Gln Val Leu Ser Gln Asp Asp Thr Pro Leu Leu Tyr

                165                 170                 175

Ser Ile Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Ile Val

            180                 185                 190

Leu Phe Asn Ala Ile Gln Ser Leu Asp Phe Ser Glu Val Ser Ala Thr

        195                 200                 205

Thr Ala Leu Ser Leu Ile Gly Thr Phe Leu Tyr Leu Phe Phe Thr Ser

    210                 215                 220

Thr Leu Leu Gly Leu Thr Val Gly Leu Leu Ser Ala Phe Ile Ile Lys

225                 230                 235                 240

Thr Leu Tyr Ile Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Ile Ala Ile Met

                245                 250                 255

Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Met Ile Thr Glu Leu Ile Asp Leu

            260                 265                 270

Ser Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile Val Met Ser His Tyr

        275                 280                 285

Thr Trp His Asn Ile Thr Glu Ser Ser Arg Ile Thr Thr Lys His Ala

    290                 295                 300

Phe Ala Thr Met Ser Phe Ile Ala Glu Thr Phe Ile Phe Leu Tyr Val

305                 310                 315                 320

Gly Met Asp Ala Leu Asp Ile Asp Lys Trp Lys Asp Ser Asn Ala Ser

                325                 330                 335

Ala Gly Thr Ser Phe Ala Val Ser Ala Thr Leu Leu Ala Leu Val Leu

            340                 345                 350

Ile Gly Arg Ala Ala Phe Val Phe Pro Leu Ala Gly Ile Ala Asn Trp

        355                 360                 365

Thr Lys Arg Arg Glu Gly Ala Lys Leu Pro Phe Arg Lys Gln Phe Ile

    370                 375                 380

Ile Trp Trp Ala Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Thr Ile Ala Leu Ser

385                 390                 395                 400

Tyr Asn Gln Phe Ser Asp Ser Asp Asp Asp Ser Ser Thr Ser Ser Glu

                405                 410                 415

Asn Ser Leu Met Ile Thr Ser Thr Ile Ile Val Val Leu Phe Ser Thr

            420                 425                 430

Val Val Phe Gly Ser Ile Thr Lys Pro Leu Ile Glu Ala Leu Leu Gly

        435                 440                 445

Arg Asn Val Pro Phe Val Ser Asp Ala Thr Asp Ile Pro Ser Leu Glu

    450                 455                 460

Ser Leu Arg Tyr Leu Phe Ile Glu Asp Gly Gly Glu Gly Asn Asn Asn

465                 470                 475                 480

Asp Glu Glu Asn Lys Glu Asn Ser Glu Pro Arg Arg Asn Gly Trp Cys

                485                 490                 495

Leu Gly Met Leu Ile Arg His Pro Thr Trp Thr Val His His Leu Trp

            500                 505                 510

Arg Lys Phe Asp Asp Lys Phe Met Arg Pro Val Phe Gly Gly Arg Gly

        515                 520                 525

Phe Val Pro Tyr Gln Pro Gly Ser Pro Thr Glu Ala Pro Ile Gln Ser

    530                 535                 540

Asn Ile Phe Asp Glu His His Val Gln

545                 550

Claims (8)

1.一种荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白FtNHX，其特征在于，为以下蛋白质之一：

(1)具有序列表中的SEQ ID：2氨基酸残基序列的蛋白质，或，

(2)序列表中的SEQ ID：2经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No：2氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No：2衍生的蛋白质。

2.一种荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的基因FtNHX，其特征在于，为编码权利要求1所述荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白FtNHX的核苷酸序列。

3.权利要求2所述荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的基因FtNHX，其特征在于，其核苷酸序列包括SEQ ID：1第288～1949位。

4.权利要求2所述荞麦Na⁺/H⁺⁺逆向转运蛋白的基因FtNHX，其特征在于，是与SEQ ID：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

5.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2～4任一项所述荞麦Na⁺/H⁺向转运蛋白的基因FtNHX的完整编码阅读框。

6.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求2～4任一项所述荞麦Na⁺/H⁺向转运蛋白的基因FtNHX的完整编码阅读框。

7.权利要求2～4任一项所述荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的基因FtNHX在培育抗盐植物方面的应用，其特征在于，将所述荞麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的基因FtNHX通过微注射、基因枪、农杆菌介导或花粉管通道的方法转入植物中，培育出耐盐性及生物学性状得到改善的植物新品种。

8.权利要求5所述重组载体在培育抗盐植物方面的应用。

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