CN104178495A - 耐盐抗旱基因及其编码的蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离的多核苷酸，包含该多核苷酸的载体，核酸构建体，细胞，植物材料等，本发明还涉及耐盐和/或抗旱蛋白，本发明还涉及一种提高耐盐和/或抗旱植物的方法，以及本发明的多核苷酸及其编码的蛋白的用途。

Description

耐盐抗旱基因及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明涉及植物中与抗胁迫相关的基因及其编码蛋白与应用，特别是涉及耐盐和/或抗旱基因及其编码的蛋白和应用。

背景技术

水资源短缺以及土壤盐渍化是目前制约农业生产的一个全球性问题。据不完全统计，世界上有至少20%的耕地和超过50%的灌溉土地在不同程度上受到盐害的影响。一些干旱或半干旱地区，由于蒸发量大，降水量小，致使土壤中盐分（主要是NaCl和NaCO₃）的大量积累。一些滨海地带，地下水位较高或海水倒灌，也会导致土壤表层积累较多盐分（主要是NaCl和MgSO₄）。而不合理的灌溉方式以及长期的淡水洗盐又造成了大量农田的次生盐渍化。随着世界人口的剧增，发展中国家城市化进程的加剧，以及水资源匮乏造成的可灌溉土地面积的急剧下降，充分开发和利用盐碱地已经成为关系人类生存和发展的重要课题。

干旱和盐渍化是影响植物生长发育的重要逆境因子。根据植物对于盐胁迫的耐受性差异，将植物分成盐生植物和甜土植物两类。盐生植物是能在渗透势低于-3.3MPa的土壤环境中生长并完成生活史的天然植物群体，反之，则是甜土植物。

大多数植物尤其是农作物属于甜土植物，对盐胁迫敏感。它们在盐碱地生长时，由于受盐胁迫作用，生长缓慢，往往叶片变黄、死亡、脱落，严重影响光合作用，有时甚至整株植物枯萎死亡，从而造成农作物减产。盐胁迫已经严重的影响了全球的粮食产量，因此，揭示植物应对盐胁迫的机制，并据此提高植物的抗盐能力，已经成为促进农业生产的重要基础。

盐胁迫对植物生长的影响主要表现在以下几个方面：第一，土壤中盐分过高，使土壤的渗透势降低，会造成植物根系吸水困难，导致植物水分亏缺；第二，钠离子、氯离子及硫酸盐的累积造成的离子毒害，并且导致钾、钙、磷、氮摄入量不足，从而造成的营养胁迫；第三，当植物受到盐胁迫时，细胞中会大量积累活性氧，而高浓度的活性氧则会造成膜脂、蛋白质及核酸的破坏。

干旱和盐害是两个相关的性状，它们严重影响植物的生长发育，造成作物减产，并且日益恶化生态环境。提高作物的抗盐，抗旱能力已经成为现代植物育种工作急需解决的关键问题之一。研究植物对于盐胁迫和干旱胁迫的响应及耐受的分子机制，提高作物的耐盐、抗旱能力，寻找抗旱抗盐相关基因是近些年来的热点，对于农作物改良和培育耐盐作物具有重要的意义。

小盐芥（Thellugiella halophila）是近些年来发现的一种盐生植物，与拟南芥具有较高的亲缘关系。但是与甜土植物拟南芥相比，小盐芥具有极高的耐盐能力。拟南芥能完成生活史的最高NaCl浓度为75mM,而盐芥能够在300mM NaCl的条件下完成生活史。并且小盐芥生活史短、基因组简单、自花授粉、易转化、种子量大，符合模式植物的标准，是研究植物耐盐，抗盐，抗旱的重要资源之一。

发明内容

本发明分离了植物耐盐和/或抗旱基因的多核苷酸（将其命名为ThST0305和ThST306（Salt tolerant0305and Salt tolerant306）），包含该多核苷酸的载体，核酸构建体，细胞，植物材料等，本发明还涉及耐盐和/或抗旱蛋白，本发明还涉及一种提高耐盐和/或抗旱植物的方法，以及本发明的多核苷酸及其编码的蛋白的用途。

基于上述，本发明的目的之一是提供一种分离的多核苷酸，其包含或由选自下组之一的多核苷酸组成：

a)具有选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示序列的多核苷酸;

b)多核苷酸，其编码具有选自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示序列的氨基酸序列，或编码具有在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中经过取代，缺失或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列；

c)多核苷酸，其编码的蛋白质氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2或SEQID NO:4所示序列具有至少60%序列同一性，优选至少70%的序列同一性，优选至少80%的序列同一性，优选至少90%的序列同一性，优选至少95%的序列同一性，还优选至少99%的序列同一性；

d)多核苷酸，其在严谨条件下，优选中等严谨条件下，还优选高等严谨条件下与a)或b)或c)之一杂交;上述严谨/严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

e)多核苷酸，其为a)-d)之一的片段。

优选地，本发明的多核苷酸由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的序列组成或由编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所述多肽序列的序列组成。

更优选地，本发明的多核苷酸编码耐非生物胁迫的蛋白，最优选编码耐盐和/或抗旱的相关蛋白质。

本发明进一步提供载体或核酸构建体，其包含本发明的至少一种多核苷酸。

本发明进一步提供植物细胞，其包含本发明的核酸构建体。

本发明还提供植物，其包含本发明的细胞。优选地，本发明的植物是单子叶植物或双子叶植物，其中所述单子叶植物优选选自：玉米,稻,小麦,大麦或棕榈；其中所述双子叶植物优选选自：拟南芥，大豆,油菜,花生,向日葵,红花,棉花,烟草,番茄,马铃薯和可可。特别优选地，所述植物为玉米，小麦，大麦，大豆或稻。

本发明进一步提供一种植物材料，包括上述植物的后代，克隆，繁殖材料，种子，荚果，果实，植物组织，植物细胞培养物，植物表达盒、植物器官或植物部分，优选为种子。

进一步地，本发明还提供由上述植物材料制备的组合物，包括食品，粉，饲料。

本发明的另一目的是提供一种耐盐和/或抗旱蛋白，其由本发明上述任一多核苷酸编码，所述蛋白优选具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

本发明的另一目的是提供一种培育耐盐和/或抗旱植物的方法，包括将本发明的多核苷酸导入植物细胞中的步骤，或者包括使用本发明的载体或核酸构建体或者使用本发明的植物细胞的步骤，其中所述植物优选为玉米，小麦，大麦，大豆或稻。

本发明的另一目的是提供一种提高植物耐盐和/或抗旱的方法，包括在植物中使本发明的多核苷酸过表达的步骤，所述植物优选为玉米，小麦，大麦，大豆或稻。

另一方面，本发明提供了本发明的多核苷酸及其编码的蛋白质在提高植物耐盐和/或抗旱中的用途，所述植物优选为玉米，小麦，大麦，大豆或稻。

另一方面，本发明提供了本发明的多核苷酸及其编码的蛋白质在调控植物的生长发育中的用途，诸如在调控植物对盐胁迫和/或干旱胁迫的反应中的用途。

本发明进一步提供了一种培育耐盐和/或抗旱植物的方法，包括将本发明的植物，或者使用本发明的方法得到的植物与待培育植物嫁接，从而得到耐盐和/或抗旱植物。

为了使ThST0305和/或ThST306蛋白质便于纯化，可在由序列表中所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

本文中的ThST0305和/或ThST306蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。本文的经过取代，缺失或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列、和/或连接有表1所示的标签序列的氨基酸序列也可以人工合成，或先合成其编码基因，再进行生物表达得到，所述编码基因可通过将序列表中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

含有ThST0305和/或ThST306基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系及重组菌以及其中所使用的引物均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有ThST0305和/或ThST306基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用ThST0305和/或ThST306构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。各种翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明所提供的培育耐盐和/或抗旱植物的方法，可将所述植物耐盐和/或抗旱相关蛋白的编码基因导入植物细胞中，得到耐盐和/或抗旱植物；具体来说，可以将所述含有ThST0305和/或ThST306基因的重组表达载体导入植物细胞中，得到耐盐和/或抗旱植物。

本发明所提供的培育耐盐和/或抗旱植物的方法，还可以将上述耐盐和/或抗旱植物与其它植物嫁接，得到新的耐盐和/或抗旱植物。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的ThST0305和/或ThST306的编码基因导入植物细胞，可获得盐耐受力和/或干旱耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，诸如：百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等以及下文中所描述的。

本领域技术人员了解通过常规的生物学方法可以使本发明的多核苷酸在植物中表达和/或过表达。

通过本发明人的研究，本领域技术人员可以相信，通过用本发明的多核苷酸转化目标植物，并使所述多核苷酸在目标植物中表达，特别是过表达，使得植物耐盐和/或抗旱能力得以提高。转化植物并使本发明的多核苷酸在被转化的植物中表达的方法是本领域普通技术人员所熟知的。

本领域技术人员基于现有技术和本说明书公开的内容可以得知，可利用本发明的载体的植物包括诸如上面所述的双子叶和单子叶植物，优选禾谷类作物。本发明的植物包括但不限于稻，玉米，小麦，大麦等。

本发明的其它目的见于本发明的下面详细描述之中。

本发明中所用的术语为本领域常用含义，诸如下述术语。

“相关”/“可操作地连接”指两个物理或功能相关的核酸序列。例如，如果启动子或调节DNA序列和编码RNA或蛋白质的DNA序列可操作地连接或定位以至于调节DNA序列将影响编码或结构DNA序列的表达水平，那么称启动子或调节DNA序列与编码RNA或蛋白质的DNA序列“相关”。

“编码序列”是诸如转录为RNA如mRNA，rRNA，tRNA，snRNA，有义RNA或反义RNA的核酸序列。优选地，随后在生物体中翻译RNA以产生蛋白质。

这里所用的“表达盒”意指能指导适合宿主细胞中特定核苷酸序列表达的核酸序列，包含与目的核苷酸序列可操作地连接的启动子，所述目的核苷酸序列可操作地连接终止信号。通常，它也包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少其成分之一相对于至少它的其它成分之一是异源的。表达盒也可以是天然存在的，但以重组形式获得用于异源表达的表达盒。然而，通常，表达盒相对于宿主是异源的，即，表达盒的特定核酸序列不天然出现在宿主细胞中，必须通过转化事件将其引入宿主细胞或宿主细胞的前体。表达盒中核苷酸序列的表达可以受组成型启动子或诱导型启动子控制，其中仅当宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时，所述诱导型启动子才起始转录。如果是多细胞生物体的情况，如植物，启动子也可以是对特定组织，或器官或发育阶段特异的。

“基因”是位于基因组内的限定区域，除了前述编码核酸序列外，包含其它主要是调节性的核酸序列，所述调节性核酸序列负责编码部分的表达，即转录和翻译控制。基因也可以包含其它5’和3’非翻译序列和终止序列。进一步可以存在的元件是，例如内含子。

“异源”核酸序列是与其被引入的宿主细胞不天然相关的核酸序列，包含非天然存在的天然存在核酸序列的多拷贝。

“分离的”核酸分子或分离的蛋白质是人工地与其天然环境分离而存在，因此不是天然产物的核酸分子或蛋白质。分离的核酸分子或蛋白质可以以纯化形式存在，或者可以存在于非天然环境，例如重组宿主细胞或转基因植物中。

“核酸分子”或“核酸序列”是可以从任何来源分离的单或双链DNA或RNA的线性片段。在本发明上下文中，优选地，核酸分子是DNA片段。“核酸分子”也称多核苷酸分子。

“植物”是在任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。

“植物细胞”是植物的结构和生理学单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单个细胞或培养细胞形式，或作为高等有组织的单位如，例如植物组织，植物器官或整个植物的一部分。

“植物细胞培养物”意指各种发育阶段的植物单位如，例如原生质体，细胞培养细胞，植物组织中的细胞，花粉，花粉管，胚珠，胚囊，合子和胚的培养物。

“植物材料”指叶，茎，根，花或花的部分，果实，花粉，卵细胞，合子，种子，插条，细胞或组织培养物，或植物的任何其它部分或产物和诸如权利要求中所述到的。

“植物器官”是植物清楚的和明显结构化和分化的部分，如根，茎，叶，花蕾或胚。

这里所用的“植物组织”意指组织成结构和功能单位的一组植物细胞。包括植物中或培养物中植物的任何组织。该术语包括但不限于整个植物，植物器官，植物种子，组织培养物和组织成结构和/或功能单位的任何植物细胞组。该术语与以上列举的或该定义包含的任何特定类型植物组织的联合应用或单独应用不意味排除任何其它类型植物组织。

“启动子”是编码区域上游非翻译的DNA序列，其包含RNA聚合酶的结合位点，并起始DNA的转录。启动子区域也可以包含作为基因表达调节物的其它元件。

“调节元件”指参与控制核苷酸序列表达的序列。调节元件包含可操作地连接目的核苷酸序列的启动子和终止信号。通常它们也包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。

基本相同（或具有同一性）：在两个核酸或蛋白质序列上下文中的短语“基本相同”指当比较和比对以获得最大对应时，如利用下面序列比较算法之一或目测所测定的，具有至少60％，优选75％，优选80％，更优选85％，更优选90％，甚至更优选95％和最优选至少99％核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或多个序列或亚序列。优选地，基本同一性存在于至少约50个残基长度的序列区域，更优选至少约100个残基的区域上，最优选地，在至少约150残基中的序列基本相同。在特别优选的实施方式中，在编码区整个长度中序列基本相同。而且，基本相同的核酸或蛋白质序列具有基本相同的功能。

为了进行序列比较，通常，一个序列作为参照序列而与检测序列比较。当利用序列比较算法时，将检测和参照序列输入到计算机中，如果必要的话指定亚序列的坐标，并指定序列算法程序的参数。然后，根据选定的程序参数，序列比较算法将计算出检测序列相对于参照序列的百分序列同一性。

例如，通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性检索方法，通过这些算法的计算机化实施(WisconsinGenetics软件包中GAP,BESTFIT,FASTA和TFASTA，Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,WI)或通过目测(通常参见，Ausubel等，下文)可以进行用于比较的序列的最佳比对。

适于测定百分序列同一性和序列相似性的一个算法例子是BLAST算法，在Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中描述了该算法。通过国家生物技术信息中心(http://www.Ncbi.nlm.nih.gov/)公众可得到进行BLAST分析的软件。该算法包括：通过鉴定出查寻序列中长度为W的短字而首先鉴定出高分值序列对（HSPs），所述短字在与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正值阀值记分T。T称为相邻字记分阈值（Altschul等，1990）。这些最初的邻近字命中作为开始查寻的线索去发现包含它们的更长的HSPs。然后，这些字命中将沿每个序列的两个方向尽可能远的延伸，直到积累比对分值不再增加。对于核苷酸序列，用参数M（成对匹配残基的奖励分值;总是大于零）和N（错配残基的罚分值；总是小于零）计算积累分值。对于氨基酸序列，用记分矩阵计算积累分值。当积累比对分值从获得的最大值回落数量X，由于一个或更多负分值残基比对积累，积累分值达到或低于零，或两个序列的任一个到达终点时，每个方向的字命中延伸停止。BLAST算法的参数W，T和X决定了比对的敏感性和速度。BLASTN程序（对于核苷酸序列）使用字长值（W）11，期望值（E）10，截断值100，M=5，N=－4和两个链的比较为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长值（W）3，期望值（E）10和BLOSUM62记分矩阵(参见，Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))为缺省值。

除了计算百分序列同一性外，BLAST算法也进行两个序列间相似性的统计学分析（参见，例如Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA90:5873-5787(1993)）。BLAST算法提供的一个相似性测定是最小和概率（P（N）），其提供了两个核苷酸或氨基酸序列间偶然出现匹配的概率的指示。例如，如果检测核酸序列与参照核酸序列比较的最小和概率少于约0.1，更优选少于约0.01，最优选少于约0.001，那么认为检测核酸序列与参照序列相似。

两个核酸序列基本相同的另一个指标是两个分子在严格条件下互相杂交。短语“特异性杂交”指当该序列存在于复杂混合物（例如，总细胞的）DNA或RNA中时，在严格条件下，分子仅与特定核苷酸序列结合，形成双螺旋或杂交。“基本结合”指探针核酸和靶核酸间互补杂交，并且包含较少的错配，通过降低杂交介质的严格性可耐受所述的错配，以实现靶核酸序列的期望检测。

在核酸杂交试验如Southern和Northern杂交上下文中“严格杂交条件”和“严格杂交漂洗条件”是序列依赖性的，并且在不同环境参数下是不同的。较长的序列在较高温度特异性杂交。在Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes，第I部分第2章"Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays"Elsevier,NewYork中可以发现核酸杂交的大量指南。一般地，对于在限定离子强度和pH下的特定序列，高严格性杂交和漂洗条件选择为低于热熔点（T_m）约5℃。典型地，在“严格条件”下，探针将与其靶亚序列杂交，而不与其它序列杂交。

T_m是（在限定离子强度和pH条件下）50％靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。对于特定的探针，非常严格的条件选择为等于T_m。在Southern或Northern印迹中在滤膜上有多于100个互补残基的互补核酸杂交的一个严格杂交条件的例子是在42℃，具有1mg肝素的50％甲酰胺，过夜进行该杂交。高严格性漂洗条件的例子是72℃，0.15M NaCl约15分钟。严格漂洗条件的例子是在65℃，0.2x SSC漂洗15分钟（参见，Sambrook，下文，SSC缓冲液的描述）。通常，在高严格性漂洗前进行低严格性漂洗以除去背景探针信号。对于例如多于100个核苷酸的双螺旋而言，中严格性漂洗的例子是45℃，1x SSC漂洗15分钟。对于例如多于100个核苷酸的双螺旋而言，低严格性漂洗的例子是40℃，4-6x SSC漂洗15分钟。对于短探针（例如，约10到50个核苷酸），严格条件通常包括在pH7.0到8.3的少于约1.0M Na离子的盐浓度，通常约0.01到1.0Na离子浓度（或其它盐），通常温度至少是约30℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可以获得严格条件。一般地，在特定杂交测定中，信噪音比就无关探针所观察到的值高2×（或更高）表明特异杂交的检测。在严格条件下不互相杂交的核酸如果它们编码的蛋白质是基本相同的，那么它们仍是基本相同的。例如，当用遗传密码所允许的最大密码子简并性创造核酸拷贝时，就会出现这种情况。本领域技术人员可以根据本领域的普通知识进行调整，诸如本发明还优选的严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

下面是杂交/漂洗条件设置的例子，所述条件可以用于克隆与本发明参照核苷酸序列基本相同的同源核苷酸序列：参照核苷酸序列与参照核苷酸序列优选在50℃，7％十二烷基硫酸钠（SDS），0.5M NaPO₄，1mMEDTA中杂交，在50℃，2X SSC，0.1%SDS中漂洗，更期望在50℃，7％十二烷基硫酸钠（SDS），0.5M NaPO₄，1mM EDTA中杂交，在50℃，1X SSC，0.1%SDS中漂洗，更期望在50℃，7％十二烷基硫酸钠（SDS），0.5M NaPO₄，1mM EDTA中杂交，在50℃，0.5X SSC，0.1%SDS中漂洗，优选地，在50℃，7％十二烷基硫酸钠（SDS），0.5M NaPO₄，1mMEDTA中杂交，在50℃，0.1X SSC，0.1%SDS中漂洗，更优选地，在50℃，7％十二烷基硫酸钠（SDS），0.5M NaPO₄，1mM EDTA中杂交，在65℃，0.1X SSC，0.1%SDS中漂洗。

“转化”是向宿主细胞或生物体中引入异源核酸的过程，特别地，“转化”意指DNA分子稳定整合进入目的生物体基因组中。

“转化的/转基因的/重组的”指已经引入异源核酸分子的宿主生物体，如细菌或植物。核酸分子可以稳定地整合进入宿主基因组或者核酸分子也可以作为染色体外分子存在。这种染色体外分子可以是自主复制的。转化的细胞，组织，或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。“非转化的”，“非转基因的”，或“非重组的”宿主指不含有异源核酸分子的野生型生物体，例如细菌或植物。

本文所用的术语“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“编码序列”、“开放阅读框(ORF)”等包括单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相应的反义链。

生产和操作本文公开的多核苷酸分子及寡核苷酸分子的方法是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的重组技术(参见Maniatis等，1989，分 子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Ausubel等，1989，分子生物学当前技术，Greene Publishing Associates&WileyInterscience，NY;Sambrook等，1989，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Innis等（编），1995，PCR策略，AcademicPress，Inc.，San Diego;和Erlich(编)，1992，PCR技术，牛津大学出版社，New York)完成。

植物转化

在特别优选实施方式中，在高等生物体例如植物中表达至少一种本发明的耐干旱/抗旱蛋白。可将本发明核苷酸序列插入到表达盒中，然后优选地，表达盒稳定整合在所述植物基因组中。在另一个优选实施方式中，核苷酸序列包含在非致病自我复制的病毒中。在另一个优选实施方式中，核苷酸序列包含在农杆菌中。按照本发明转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于玉米，小麦，大麦，黑麦，甘薯，豆，豌豆，菊苣，莴苣，甘蓝，花椰菜，花茎甘蓝,芜菁，萝卜，菠菜，芦笋，洋葱，大蒜，胡椒，芹菜，笋瓜，南瓜，大麻，夏南瓜，苹果，梨，温桲，瓜，李子，樱桃，桃子，油桃，杏，草莓，葡萄，木莓，黑莓，菠萝，鳄梨，蕃木瓜，芒果，香蕉，大豆，番茄，高粱，甘蔗，甜菜，向日葵，菜籽油菜，三叶草，烟草，胡萝卜，棉花，苜蓿，稻，马铃薯，茄子，黄瓜，拟南芥属和木本植物如针叶树和落叶树。特别优选的是水稻、小麦、大麦、玉米、大豆、燕麦、或黑麦。

一旦已将期望的核苷酸序列转化进入特定植物物种中，可以在该物种中繁殖它或用常规育种技术将它转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。

优选地，在转基因植物中表达本发明的核苷酸序列，由此在转基因植物中引起相应耐盐/抗旱蛋白的生物合成。以这种方式，可产生具有改良性状的转基因植物。为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序列，本发明核苷酸序列可能需要修饰和优化。所有生物体都有特定的密码子使用偏爱性，这是本领域已知的，可以在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性。以这种方式可以优化核苷酸序列以便在任何植物中的表达。公认基因序列的所有或任何部分都可以优化或合成。即，也可以利用合成或部分优化的序列。

可将作为其天然序列或作为如上所述优化合成序列的本发明新的耐盐/抗旱基因可操作地与在植物中表达的各种启动子，包括组成型，诱导型，时序调节，发育调节，化学调节，组织优选和组织特异性启动子相融合以制备重组DNA分子，即嵌合基因。启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种。因此，优选在叶，主茎或茎杆，穗，花序（例如，穗状花序，圆锥花序，穗轴等），根，和/或幼苗中表达本发明核苷酸序列。尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达。然而，没有限制所选启动子的起源，只要启动子起作用驱动期望细胞中核苷酸序列的表达就足够了。

除了适合启动子的选择外，植物中耐盐和/或抗旱蛋白表达的构建需要连接在异源核苷酸序列下游的适合的转录终止子。可得到几种这种终止子，并且它们是本领域已知的（例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9）。任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以用在本发明中。

可用于植物转化的大量转化载体是植物转化领域技术人员已知的，并且本发明的核酸分子可以与任何这种载体联合使用。载体的选择将依赖于用于转化的优选转化技术和靶植物物种。对于一些靶物种，可以优选不同的抗生素或除草剂选择性标记。然而，选择性标记的选择对本发明不是至关重要的。

除非有其它说明，本发明的实施使用本领域中的传统分子生物学，细胞生物学，和克隆技术。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。例如，Sambrook and Russell"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"(2001)。利用这些参考文献，本领域熟练技术人员可产生本发明核酸的变体。

在描述本发明示例性的具体实施方案之前，应当明确本发明不局限于描述的具体材料和方法，因为这些可以改变。也应理解这里使用的命名法仅仅以描述具体实施方案为目的，并未打算限制本发明的范围，本发明的范围只由附加的权利要求书限制。这里使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的意义相同。尽管任何与这里描述的相似或相当的材料和方法可被用于实践或试验本发明，优选的材料和方法是这里所描述的。

附图说明

图1处理前及200mM NaCl处理6周后的pGreen-GFP的拟南芥转基因株系和35S-ThST0305转基因拟南芥生长情况。

图235S-ThST306转基因拟南芥及野生型拟南芥在含有100mMNaCl的MS培养基上生长两周后的情况。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来进一步说明本发明。应当理解这里描述的具体实施方式只是作为示例来帮助本领域技术人员更好地理解本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。

实施例1、耐盐和/或抗旱相关蛋白基因ThST0305和ThST306的筛选及其cDNA的克隆

1、ThST0305和ThST306的筛选

将小盐芥（Thellugiella halophila，中国科学院遗传与发育生物学研究所提供）种子播种在MS培养基上，4°C春化21天，移至22°C，光下萌发。两周后，将小苗移至含有400mM NaCl的液体MS培养基中处理48h。提取处理后小盐芥的mRNA并反转录成cDNA，将小盐芥的cDNA文库构建在双元载体pGreen-SA（参见Hellens RP,E.E.,Leyland NR,Bean S,Mullineaux PM.(2000).pGreen:a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediatedplant transformation.Plant Mol Biol.42,819-832.）上，用重组载体转化拟南芥。同时以空载体pGreen-GFP转化拟南芥，获得的拟南芥作为对照。

筛选方法一：将转基因拟南芥在土中生长至3周时，用200mM NaCl处理3周，比较转基因拟南芥株系与对照的生长状况。利用这种方法发现株系NO.0305比对照耐盐，将其命名为ThST0305（Salt tolerant0305）。

筛选方法二：将转基因拟南芥在含有100mM NaCl的MS培养基上萌发、生长，比较转基因拟南芥株系与对照的生长状况。利用这种方法获得株系NO.306比对照耐盐，将其命名为ThST306（Salt tolerant306）。

提取ThST0305株系拟南芥的基因组DNA，用载体pGreen上的引物，通过PCR方法扩增载体上的插入片段，将PCR产物测序。测序结果表明，插入片段为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

提取ThST306株系拟南芥的基因组DNA，用载体pGreen上的引物，通过PCR方法扩增载体上的插入片段，将PCR产物测序。测序结果表明，插入片段为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，编码SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

pGreen载体上的引物：

上游引物:5’-GGAACTACTCACACATTATTATGGAG-3’

下游引物:5’-CATTTGGAGAGGACACGCTG-3’

2、ThST0305和ThST306cDNA的克隆

根据SEQ ID NO:1设计一对ThST0305特异引物如下：

上游引物:5’-ATGGGTGCTTCGATATCCGT-3’；

下游引物:5’-TCAAGGGTTAACACTTGGTA-3’。

根据SEQ ID NO:3设计一对ThST306特异引物如下：

上游引物：5’-ATGGCGTCTTTGGGTGTGTC-3’；

下游引物:5’-TTAGAGAGTGGGAGCTCTCT-3’。

以小盐芥（Thellugiella halophila）（Wang ZI,Li PH,Fredricksen M,GongZH,Kim CS,Zhang CQ,Bohnert HJ,Zhu JK,Bressan RA,Hasegawa PM,ZhaoYX and Zhang H(2004)Expressed sequence tags from Thellungiella halophila,anew model to study plant salt-tolerance.Plant Science166,609-616.）的cDNA为模板进行PCR扩增,对PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，分别得到分子量约为0.52kb（ThST0305）和0.84kb（ThST306）的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN）回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy（Promega）连接，参照Cohen等的方法（Proc Natl AcadSci，69:2110），将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-TEasy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的基因由528个脱氧核糖核苷酸组成(SEQID NO:1)，编码氨基酸序列是序列表中(SEQ ID NO:2)的蛋白质。将SEQ IDNO:2所示蛋白命名为ThST0305，将SEQ ID NO:1所示的基因命名为ThST0305，将含有SEQ ID NO:1所示基因的pGEM-T Easy载体命名为pTE-ThST0305。用同样方法获得ThST306基因序列（SEQ ID NO:3），其编码SEQ ID NO:4所示蛋白序列，命名为ThST306，将含有SEQ ID NO:3所示基因的pGEM-T Easy载体命名为pTE-ThST306.

实施例2、转ThST0305和ThST306基因植株的获得和耐逆性鉴定

一、转基因植株的获得

将ThST0305和ThST306基因分别连到植物表达载体pGreen的35S启动子之后的EcoRⅠ和XhoⅠ位点之间，构建了表达载体pGreen-35S:ThST0305和pGreen-35S:ThST306，并将它们分别与辅助载体pSA用电转法共同转化农杆菌EHA105，之后转化拟南芥野生型植物（Col-0）。在卡那霉素(kanamycin)浓度为50微克/毫升的MS平板上进行筛选，得到ThST0305和ThST306的T0代转基因苗。再继续繁殖，得到T2代纯合的转基因种子。

二、转基因植株的生长及表型测定

1.转ThST0305拟南芥的表型测定

将35S-ThST0305转基因植物种在土壤中，待长至第3周时，以pGreen-GFP的拟南芥转基因株系做对照，将其用含有200mM NaCl的盐溶液进行胁迫处理。图1为盐处理6周后的植物，对照植物只有10%左右存活没有植物抽薹；而35S-ThST0305转基因植物有高过80%的存活率，而且有多于50%的植物抽薹结实。由所述结果可知ThST0305提高了耐盐性。

2.转ThST306拟南芥的表型测定

将35S-ThST306转基因及野生型植物在含有100mMNaCl的MS培养基上萌发生长。两周后，野生型植物的根部生长缓慢，部分叶片开始黄化，并且叶片生长较慢。与野生型植物相比，35S-ThST306转基因植物没有明显的盐敏感表型（图2）。

由上面的实施例可知，本发明的耐盐相关蛋白及其编码基因能显著提高植株的耐盐性。而且我们知道干旱和盐害是两个相关的性状，能够耐盐的植物也具备抗旱的能力，本发明的实验也表明了转化有所述基因的植物具备抗旱能力。本发明的耐盐相关蛋白及其编码基因能显著提高植株的耐盐性。而且本发明的耐盐相关蛋白及其编码基因能显著提高植株的抗旱性。本发明的耐盐和/或抗旱相关蛋白及其编码基因可用于培育耐盐和/或抗旱植物品种，从而提高农作物产量，从而提高农作物产量，具有重要的经济意义和应用前景。

可以理解的是，上面的描述仅是本发明的示例，因而本发明权利要求所保护的范围并不仅仅以此处公开的特定实施方案来限定。任何等同的实施方案将被认为在本发明的范围之内。事实上，根据前面的描述，对本发明进行有关的修改和变化对于本领域技术人员来讲都将是可能的，因而，这种修改和变化也将落在本发明所附的权利要求的范围之内。

Claims (17)

1.分离的多核苷酸，其包含或由选自下组之一的多核苷酸组成：

a)具有选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示序列的多核苷酸;

b)多核苷酸，其编码具有选自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示序列的氨基酸序列，或编码具有在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中经过取代，缺失或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列；

c)多核苷酸，其编码的蛋白质氨基酸序列与选自SEQ ID NO:2或SEQID NO:4所示序列具有至少60%序列同一性，优选至少70%的序列同一性，优选至少80%的序列同一性，优选至少90%的序列同一性，优选至少95%的序列同一性，还优选至少99%的序列同一性；

d)多核苷酸，其在严谨条件下，优选中等严谨条件下，还优选高等严谨条件下与a)或b)或c)之一杂交;上述严谨/严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

e)多核苷酸，其为a)-d)之一的片段。

2.权利要求1的多核苷酸，其由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的序列组成或由编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所述多肽序列的序列组成。

3.权利要求1或2的多核苷酸，其编码耐非生物胁迫的蛋白。

4.权利要求3的多核苷酸，其编码耐盐和/或抗旱的相关蛋白质。

5.载体或核酸构建体，其包含权利要求1-4任一项的至少一种多核苷酸。

6.植物细胞，其包含权利要求5的载体或核酸构建体。

7.一种耐盐和/或抗旱蛋白，其由权利要求1-4任一项的多核苷酸编码。

8.权利要求7的蛋白，所述蛋白具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

9.一种培育耐盐和/或抗旱植物的方法，包括将权利要求1-4任一项的多核苷酸导入植物细胞中的步骤，或者包括使用权利要求5的载体或核酸构建体或者使用权利要求6的植物细胞的步骤。

10.权利要求9的方法，其中所述植物为玉米，小麦，大麦，大豆或稻。

11.一种提高植物耐盐和/或抗旱的方法，包括在植物中使权利要求1-4任一项的多核苷酸过表达的步骤。

12.权利要求11的方法，其中所述植物为玉米，小麦，大麦，大豆或稻。

13.权利要求1-4任一项的多核苷酸及其编码的蛋白质在提高植物耐盐和/或抗旱中的用途。

14.权利要求13的用途，其中所述植物为玉米，小麦，大麦，大豆或稻。

15.权利要求1-4任一项的多核苷酸及其编码的蛋白质在调控植物的生长发育中的用途。

16.权利要求15的用途，其中所述用途为在调控植物对盐胁迫和/或干旱胁迫的反应中的用途。

17.一种培育耐盐和/或抗旱植物的方法，包括将含有权利要求6的细胞的植物，或者使用权利要求9或10的方法得到的植物与待培育植物嫁接，从而得到耐盐和/或抗旱植物。