CN107119068B - 一种获得抗旱性增强的植物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获得耐旱性增强的植物的方法。本发明所提供的获得耐旱性增强的植物的方法，包括如下步骤：将目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因进行突变，从突变后的植物中获得与所述目的植物相比耐旱性增强的植物。本发明利用基因组编辑技术定点突变目的植物中的拟南芥AtCER9同源基因，获得了抗旱能力提高的植物材料。本发明为耐旱植物的开发提供了新的材料。
Description
技术领域
本发明属于生物技术育种领域，涉及一种获得抗旱性增强的植物的方法。
背景技术
地球表面约有70％面积被水覆盖，但是地球上的淡水资源仅占地球总水量的2％左右，可被人类利用的淡水总量只占地球上总水量的十万分之三，占淡水总蓄量的0.34％。并且随着环境污染的日益严重，可被人类利用的淡水资源还在不断减少。农业用水占人类总用水量的60％以上，由于人口增加对粮食产量需求还在不断提高，所以农业缺水问题日益严重。
地球变暖引起地面蒸发量增加，造成大量内陆地区的河流蓄水量减少，甚至干涸；而温室效应也带来短期及长期的极端干旱天气频发。在世界各地，干旱已经成为威胁粮食生产安全的第一大灾害因素。
干旱胁迫严重影响植物生长，在苗期及生殖生长阶段，植物对干旱胁迫最为敏感。干旱胁迫能够抑制植物生长，降低植物的光合效率，影响植物的育性，对农业生产危害严重。因此，培育抗旱植物是农业育种工作的重中之重。
植物自身具有多条途径来应对干旱胁迫，主要分为以下三类。一，减少叶片的蒸腾量，提高植物的保水能力。二，依靠发达的根系，在缺水的土壤中汲取足够的水分。三，提高植物在失水条件下的生存力。失水会对植物造成一系列的次级胁迫，如渗透胁迫、氧化胁迫等，植物细胞可以通过提高渗透调节物质及抗氧化物质的含量，避免或降低次级胁迫对植物造成的损伤。第一类机制在育种应用中的更为重要，因为，它不仅能提高植物的耐旱能力，而且能够降低植物生长过程中对水分的需求量，有利于培育节水植物。
植物叶片的蒸腾主要通过两条途径：一，随着呼吸作用的进行，水分从气孔排除；二，水分从叶片表皮的其他细胞表面蒸腾。在第二条途径中，叶片的表面结构，尤其是蜡质的组成及分布对植物叶片蒸腾速率的影响至关重要。因此，通过基因工程的方法，改变植物叶片的蜡质层结构，可能能培育出优秀的抗旱植物品种。
发明内容
本发明的目的是提供一种获得抗旱性增强的植物的方法。
本发明所提供的获得耐旱性增强的植物的方法，具体包括如下步骤：将目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因进行突变，从突变后的植物中获得与所述目的植物相比耐旱性增强的植物。
其中，所述目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因为：所述目的植物中编码的蛋白质与所述拟南芥AtCER9基因编码的蛋白质的同源性超过50％的基因；
所述拟南芥AtCER9基因编码的蛋白质为序列表中序列19所示的蛋白质。
进一步，所述拟南芥AtCER9基因在拟南芥基因组中的序列如序列表中序列1所示，共由9608个核苷酸组成，其中第1-2000位为promoter区域，第2001-2123位为5’-UTR，第2124-2459位、第2714-3397位、第3504-4265位、第4358-4569位、第4679-5017位、第5177-5337位、第5421-5584位、第5678-5824位、第5907-6398位为外显子，第2460-2713位、第3398-3503位、第4266-4357位、第4570-4678位、第5018-5176位、第5338-5420位、第5585-5677位、第5825-5906位为内含子，第6399-6608位为3’-UTR，第6609-9608位为终止子区域。所述拟南芥AtCER9基因的cDNA序列如序列表中序列7所示，共由3660个核苷酸组成，其中第1-123位为5’-UTR，第124-3450位为AtCER9基因的CDS，第3451-3660位为3’-UTR。所述拟南芥AtCER9基因的CDS序列如序列表中序列13所示，共由3327个核苷酸组成。
在所述方法中，所述将目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因进行突变，为可造成所述目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因编码的蛋白的表达和/或功能发生改变或丧失的突变。
在所述方法中，所述将目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因进行突变，既可为将所述目的植物中的所有与拟南芥AtCER9基因同源的基因均进行突变，也可为将所述目的植物中的部分与拟南芥AtCER9基因同源的基因均进行突变，只要能够获得与所述目的植物相比抗旱性增强的植物即可。
在所述方法中，所述将目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因进行突变，突变的位置可位于所述目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因的如下区域中的至少一种：增强子区、启动子区、外显子区、内含子区、终止子区。
在所述方法中，所述将目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因进行突变，可通过基因编辑的方法实现；
所述基因编辑具体可由核酸酶介导，所述核酸酶能够特异性剪切所述目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因中的靶标片段；所述核酸酶具体可为锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)或CRISPR/Cas9核酸酶。
所述核酸酶对所述靶标片段进行特异性剪切会造成所述靶标片段发生插入突变、缺失突变和/或替换突变，从而使得所述目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因发生突变。其中，所述靶标片段可位于所述目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因的如下区域中的至少一种：增强子区、启动子区、外显子区、内含子区、终止子区。
当所核酸酶为能够特异性剪切所述目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因中的靶标片段的锌指核酸酶或转录激活因子样效应因子核酸酶时，所述将目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因进行突变，是通过如下实现的：向所述目的植物的细胞或组织中导入表达所述锌指核酸酶或所述转录激活因子样效应因子核酸酶的遗传物质，或者直接导入所述锌指核酸酶或所述转录激活因子样效应因子核酸酶，再将导入后的细胞或组织培养成完整植株。
当所核酸酶为能够特异性剪切所述目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因中的靶标片段的CRISPR/Cas9核酸酶时，所述将目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因进行突变，是通过如下实现的：向所述目的植物的细胞或组织中导入表达所述CRISPR/Cas9核酸酶的遗传物质，或者直接导入所述CRISPR/Cas9核酸酶(即Cas9蛋白和向导RNA)，再将导入后的细胞或组织培养成完整植株。
所述遗传物质可为DNA质粒或DNA线性片段或体外转录的RNA；即根据所述核酸酶种类的不同，所述遗传物质可为能表达锌指核酸酶、转录激活因子样效应因子核酸酶、Cas9蛋白、向导RNA、tracrRNA、crRNA的DNA质粒或DNA线性片段或体外转录的RNA；所述向导RNA为crRNA和tracrRNA，或由crRNA和tracrRNA通过部分碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段。
当所核酸酶为CRISPR/Cas9核酸酶时，所述靶标片段为所述目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因序列中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的片段；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数(如X为20)，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。
在所述方法中，所述细胞为任何能作为导入受体并能经过组织培养再生为完整植株的细胞；所述组织为任何能作为导入受体并能经过组织培养再生为完整植株的组织；具体的，所述细胞为原生质体细胞或悬浮细胞等；所述组织为愈伤组织、幼胚、成熟胚、叶片、茎尖，幼穗或下胚轴等。
在所述方法中，所述导入的方法为基因枪法、农杆菌侵染法、PEG诱导原生质体法、电极法、碳化硅纤维介导法、真空渗入法或其他任何导入方法。
在所述方法中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体如玉米、小麦等。
当所述目的植物为玉米时，所述目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因为ZmCER9-1基因和/或ZmCER9-2基因；所述ZmCER9-1基因编码的蛋白质如序列表中序列20所示；所述ZmCER9-2基因编码的蛋白质如序列表中序列21所示。
进一步，所述ZmCER9-1基因在玉米基因组中的序列如序列表中序列2所示，共由10374个核苷酸组成，其中第1-2000位为promoter区域，第2001-2073位为5’-UTR，第2074-2310位、第3323-4000位、第5636-6403位、第6503-6714位、第6804-7175位、第7704-7861位、第7976-8139位、第8288-8434位、第8582-9103位为外显子，第2311-3322位、第4001-5635位、第6404-6502位、第6715-6803位、第7176-7703位、第7862-7975位、第8140-8287位、第8435-8581位为内含子，第9104-9575位为3’-UTR，第9576-10374位为终止子区域。所述ZmCER9-1基因的cDNA序列如序列表中序列8所示，共由3803个核苷酸组成，其中第1-73位为5’-UTR，第74-3331位为ZmCER9-1基因的CDS，第3331-3803位为3’-UTR。所述ZmCER9-1基因的CDS序列如序列表中序列14所示，共由3258个核苷酸组成。
进一步，所述ZmCER9-2基因在玉米基因组中的序列如序列表中序列3所示，共由9938个核苷酸组成，其中第1-2000位为promoter区域，第2001-2078位为5’-UTR，第2079-2315位、第3034-3711位、第4515-5282位、第5376-5587位、第5676-6047位、第6363-6520位、第6636-6799位、第6939-7085位、第7233-7748位为外显子，第2316-3033位、第3712-4514位、第5283-5375位、第5588-5675位、第6048-6362位、第6521-6635位第6800-6938位、第7086-7232位为内含子，第7749-8281位为3’-UTR，第8282-9938位为终止子区域。所述ZmCER9-2基因的cDNA序列如序列表中序列9所示，共由3863个核苷酸组成，其中第1-78位为5’-UTR，第79-3330位为ZmCER9-2基因的CDS，第3331-3863位为3’-UTR。所述ZmCER9-2基因的CDS序列如序列表中序列15所示，共由3252个核苷酸组成。
当所述目的植物为小麦时，所述目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因为TaCER9-a基因和/或TaCER9-b基因和/或TaCER9-d基因；所述TaCER9-a基因编码的蛋白质如序列表中序列22所示；所述TaCER9-b基因编码的蛋白质如序列表中序列23所示；所述TaCER9-d基因编码的蛋白质如序列表中序列24所示。
进一步，所述TaCER9-a基因在小麦基因组中的已知序列如序列表中序列4所示，共由5458个核苷酸组成，其中第3-684位、第1220-1987位、第2093-2304位、第2406-2780位、第3732-3889位、第4005-4168位、第4284-4430位、第4597-5115位为外显子，第685-1219位、第1988-2092位、第2305-2405位、第2781-3731位、第3890-4004位、第4169-4283位、第4431-4596位为内含子，第5116-5458位为3’-UTR。所述TaCER9-a基因的已知cDNA序列如序列表中序列10所示，共由3367个核苷酸组成，其中第1-3024位为TaCER9-a基因的CDS，第3025-3367位为3’-UTR。所述TaCER9-a基因的CDS序列如序列表中序列16所示，共由3024个核苷酸组成。
进一步，所述TaCER9-b基因在小麦基因组中的已知序列如序列表中序列5所示，共由6214个核苷酸组成，其中第300-980位、第1516-2283位、第2389-2600位、第2701-3075位、第3952-4109位、第4225-4388位、第4503-4649位、第4835-5353位为外显子，第981-1515位、第2284-2388位、第2601-2700位、第3076-3951位、第4110-4224位、第4389-4502位、第4650-4834位为内含子，第5354-6214位为3’-UTR。所述TaCER9-b基因的已知cDNA序列如序列表中序列11所示，共由3885个核苷酸组成，其中第1-3024位为TaCER9-b基因的CDS，第3025-3885位为3’-UTR。所述TaCER9-b基因的CDS序列如序列表中序列17所示，共由3024个核苷酸组成。
进一步，所述TaCER9-d基因在小麦基因组中的已知序列如序列表中序列6所示，共由5481个核苷酸组成，其中第299-979位、第1478-2245位、第2351-2562位、第2664-3038位、第3732-3889位、第4005-4168位、第4289-4435位、第4604-5122位为外显子，第980-1477位、第2246-2350位、第2563-2663位、第3039-3731位、第3890-4004位、第4169-4288位、第4436-4603位为内含子，第5123-5481位为3’-UTR。所述TaCER9-d基因的已知cDNA序列如序列表中序列12所示，共由3383个核苷酸组成，其中第1-3024位为TaCER9-d基因的CDS，第3025-3383位为3’-UTR。所述TaCER9-d基因的CDS序列如序列表中序列18所示，共由3024个核苷酸组成。
在本发明的一个实例中，所述目的植物为玉米，所述目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因为所述ZmCER9-1基因和/或所述ZmCER9-2基因，所述靶标片段的序列如序列表中序列25(即所述ZmCER9-1基因和所述ZmCER9-2基因上Cas9蛋白的共有靶序列区域)所示。相应的，所述遗传物质具体为将pBUN411载体的两个限制性内切酶BsaI的切割位点之间的片段替换为序列表中序列25的第1-20位所示DNA片段后得到的重组质粒。
在本发明的另一个实例中，所述目的植物为小麦，所述目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因为所述TaCER9-a基因和/或所述TaCER9-b基因和/或所述TaCER9-d基因，所述靶标片段的序列如序列表中序列26(即所述TaCER9-a基因、所述TaCER9-b基因和所述TaCER9-d基因上Cas9蛋白的共有靶序列区域)所示。相应的，所述遗传物质具体为pU6-TaCer9载体和pJIT163-Ubi-Cas9载体；所述pU6-TaCer9载体为将pU6-gRNA载体的两个限制性内切酶BbsI的切割位点之间的片段替换为序列表中序列26的第2-20位所示DNA片段后得到的重组质粒。
本发明利用基因组编辑技术定点突变目的植物中的拟南芥AtCER9同源基因，获得了抗旱能力提高的植物材料。本发明为耐旱植物的开发提供了新的材料。
附图说明
图1为玉米ZmCER9-1、ZmCER9-2基因结构示意图及利用CRISPR/Cas9技术的靶点的设定。图中，ZmCer9-1和ZmCer9-2即分别表示ZmCER9-1和ZmCER9-2。
图2为小麦TaCER9-a、TaCER9-b、TaCER9-d基因结构示意图及利用CRISPR/Cas9技术的靶点的设定。图中，TaCer9A、TaCer9B和TaCer9D即分别表示TaCER9-a、TaCER9-b和TaCER9-d。
图3为玉米ZmCER9-1/ZmCER9-2双突变体的测序结果及冷冻扫描电镜下的叶片表面蜡质结构图。A为测序结果，其中，WT表示野生型基因序列，“.”表示发生了删除突变的序列“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量。B为冷冻扫描电镜下的叶片表面蜡质结构图。图中，CER9-1和CER9-2即表示ZmCER9-1和ZmCER9-2；cer9-1/cer9-2即表示玉米ZmCER9-1/ZmCER9-2双突变体。
图4为小麦TaCER9-a/TaCER9-b/TaCER9-d三突变体的测序结果及冷冻扫描电镜下的叶片表面蜡质结构图。A为测序结果，其中，WT表示野生型基因序列，“.”表示发生了删除突变的序列“-”后边的数字表示删除的核苷酸的数量。B为冷冻扫描电镜下的叶片表面蜡质结构图。图中，aa、bb和dd即表示TaCER9-a、TaCER9-b和TaCER9-d；Triple mutant:aabbdd即表示小麦TaCER9-a/TaCER9-b/TaCER9-d三突变体。
图5为玉米ZmCER9-1/ZmCER9-2双突变体和野生型植物在干旱处理后的表型图。图中，cer9-1/cer9-2即表示玉米ZmCER9-1/ZmCER9-2双突变体。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
pBUN411质粒：在文献“Hui-Li Xing,Li Dong,Zhi-Ping Wang,Hai-Yan Zhang,Chun-Yan Han,Bing Liu,Xue-Chen Wang,Qi-Jun Chen.BMC plant biology.14:327-338(2014)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，仅可用于重复本发明实验。该质粒可同时用于转录向导RNA和表达Cas9蛋白。
pU6-gRNA质粒：在文献“Shan Q,Wang Y,Li J,Zhang Y,Chen K,etal.2013.Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cassystem.Nature biotechnology 31:686-8”中公开过，公众可从Addgene上购买(产品目录号为：#53062)。该质粒可同时用于转录向导RNA。
pJIT163-Ubi-Cas9质粒：在文献“Wang Y,Cheng X,Shan Q,Zhang Y,Liu J,etal.2014.Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheatconfers heritable resistance to powdery mildew.Nature biotechnology 32:947-51”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，仅可用于重复本发明实验。该质粒可同时用于表达Cas9蛋白。
玉米品种HiII：在文献“Armstrong,C.L.,Green,C.E.Phillips,R.L.Developmentand availability of germplasm with high type II culture formationresponse.Maize Genet.Coop.News Lett.65,92–93(1991)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，仅可用于重复本发明实验。
小麦品种科农199：在文献“李俊明,张相岐,张爱民,王志国,安调过,纪军,王静.高产广适小麦新品种——科农199.麦类作物学报.2007.368-368”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，仅可用于重复本发明实验。本材料也保存于中国科学院遗传发育与生物学研究所农业资源中心。
实施例1、玉米和小麦中与拟南芥AtCER9基因同源的基因的靶位点选择及敲除载体的构建
本发明涉及的拟南芥AtCER9基因的基因组序列如序列表中序列1所示，cDNA序列如序列表中序列7所示，CDS序列如序列表中序列13所示，编码的AtCER9蛋白的氨基酸序列如序列表中序列19所示。将目的植物(玉米或小麦)中编码的蛋白质与AtCER9蛋白的同源性超过50％的基因视为同源基因。
一、玉米中同源基因ZmCER9-1和ZmCER9-2的靶位点的选择
ZmCER9-1基因座位号是GRMZM5G819912，位于玉米第9条染色体，包含9个外显子，8个内含子，共编码1085个氨基酸，构建敲除载体选择的靶位点位于第2外显子中(图1)。ZmCer9-1基因在玉米基因组中的序列如序列表中序列2所示，共由10374个核苷酸组成，其中第1-2000位为promoter区域，第2001-2073位为5’-UTR，第2074-2310位、第3323-4000位、第5636-6403位、第6503-6714位、第6804-7175位、第7704-7861位、第7976-8139位、第8288-8434位、第8582-9103位为外显子，第2311-3322位、第4001-5635位、第6404-6502位、第6715-6803位、第7176-7703位、第7862-7975位、第8140-8287位、第8435-8581位为内含子，第9104-9575位为3’-UTR，第9576-10374位为终止子区域。ZmCER9-1基因的cDNA序列如序列表中序列8所示，共由3803个核苷酸组成，其中第1-73位为5’-UTR，第74-3331位为ZmCER9-1基因的CDS，第3331-3803位为3’-UTR。ZmCER9-1基因的CDS序列如序列表中序列14所示，共由3258个核苷酸组成。序列2、8、14均编码序列表中序列20所示的ZmCER9-1蛋白。
ZmCER9-2基因座位号是GRMZM2G051792，位于玉米第6条染色体，包含9个外显子，8个内含子，共编码1085个氨基酸，构建敲除载体选择的靶位点位于第2外显子中(图1)。ZmCER9-2基因在玉米基因组中的序列如序列表中序列3所示，共由9938个核苷酸组成，其中第1-2000位为promoter区域，第2001-2078位为5’-UTR，第2079-2315位、第3034-3711位、第4515-5282位、第5376-5587位、第5676-6047位、第6363-6520位、第6636-6799位、第6939-7085位、第7233-7748位为外显子，第2316-3033位、第3712-4514位、第5283-5375位、第5588-5675位、第6048-6362位、第6521-6635位第6800-6938位、第7086-7232位为内含子，第7749-8281位为3’-UTR，第8282-9938位为终止子区域。ZmCER9-2基因的cDNA序列如序列表中序列9所示，共由3863个核苷酸组成，其中第1-78位为5’-UTR，第79-3330位为ZmCER9-2基因的CDS，第3331-3863位为3’-UTR。ZmCER9-2基因的CDS序列如序列表中序列15所示，共由3252个核苷酸组成。序列3、9、15均编码序列表中序列3所示的ZmCER9-2蛋白。
利用CRISPR技术敲除的靶标双链中的一条链具有如下结构：5’-NX-NGG-3’，PAM(NGG)中的N表示A、T、C和G中的任一种，Nx中的N表示A、T、C和G中的任一种，x＝20。ZmCER9基因的靶序列如下，带下划线的碱基为PAM(原型间隔序列毗邻基序)。
ZmCER9：5’-AATAATAGGGTTC
ATGG-3’(序列25)；
该敲除载体转化玉米后，在sgRNA的介导下，Cas9蛋白在靶序列区域切割，形成DNA双链断裂，触发机体内的自我损伤修复机制，细胞自发修复该缺口的过程中会引入突变(本处“突变”指的是广义突变，包括插入、缺失、狭义突变等形式，这些突变中绝大多数为基因功能失活突变)。
上述靶序列ZmCER9含有PstI酶切识别序列(方框内的序列)，可以被PstI限制性内切酶切割。靶序列区域被切割后，如果发生了突变，则PstI酶切识别序列被破坏，将不能被限制性内切酶PstI切割；如果没有发生突变，将可以被限制性内切酶PstI切割。
二、小麦中同源基因TaCER9-a、TaCER9-b和TaCER9-d的靶位点的选择
TaCER9-a位于小麦7A染色体长臂，现在已知的序列如序列4所示，此序列是不完整的基因序列，共由5458个核苷酸组成(图2)，其中第3-684位、第1220-1987位、第2093-2304位、第2406-2780位、第3732-3889位、第4005-4168位、第4284-4430位、第4597-5115位为外显子，第685-1219位、第1988-2092位、第2305-2405位、第2781-3731位、第3890-4004位、第4169-4283位、第4431-4596位为内含子，第5116-5458位为3’-UTR。现在已知的TaCER9-a基因的cDNA如序列10所示，此序列不是完整的CDS序列，共由3367个核苷酸组成，其中第1-3024位为TaCER9-a基因的CDS，第3025-3367位为3’-UTR。现在已知的TaCER9-a基因的CDS如序列16所示，共由3024个核苷酸组成。序列4、10、16均编码序列表中序列22所示的TaCER9-a蛋白。
TaCER9-b位于小麦7B染色体长臂，现在已知的序列如序列5所示，此序列是不完整的基因序列，共由6214个核苷酸组成(图2)，其中第300-980位、第1516-2283位、第2389-2600位、第2701-3075位、第3952-4109位、第4225-4388位、第4503-4649位、第4835-5353位为外显子，第981-1515位、第2284-2388位、第2601-2700位、第3076-3951位、第4110-4224位、第4389-4502位、第4650-4834位为内含子，第5354-6214位为3’-UTR。现在已知的TaCER9-b基因的cDNA如序列11所示，共由3885个核苷酸组成，其中第1-3024位为TaCER9-b基因的CDS，第3025-3885位为3’-UTR。现在已知的TaCER9-b基因的CDS如序列17所示，共由3024个核苷酸组成。序列5、11、17均编码序列表中序列23所示的TaCER9-b蛋白。
TaCER9-d位于小麦7C染色体长臂，现在已知的序列如序列6所示，此序列是不完整的基因序列，共由5481个核苷酸组成(图2)，其中第299-979位、第1478-2245位、第2351-2562位、第2664-3038位、第3732-3889位、第4005-4168位、第4289-4435位、第4604-5122位为外显子，第980-1477位、第2246-2350位、第2563-2663位、第3039-3731位、第3890-4004位、第4169-4288位、第4436-4603位为内含子，第5123-5481位为3’-UTR。现在已知的TaCER9-d基因的cDNA如序列12所示，共由3383个核苷酸组成，其中第1-3024位为TaCER9-d基因的CDS，第3025-3383位为3’-UTR。现在已知的TaCER9-d基因的CDS如序列18所示，共由3024个核苷酸组成。序列6、12、18均编码序列表中序列24所示的TaCER9-d蛋白。
利用CRISPR技术敲除的靶标双链中的一条链具有如下结构：5’-NX-NGG-3’，PAM(NGG)中的N表示A、T、C和G中的任一种，Nx中的N表示A、T、C和G中的任一种，x＝20。TaCER9基因的靶序列如下，带下划线的碱基为PAM(原型间隔序列毗邻基序)。
TaCER9：AATGAAGCATCTCATGA
(序列26)；
该敲除载体转化玉米后，在sgRNA的介导下，Cas9蛋白在靶序列区域切割，形成DNA双链断裂，触发机体内的自我损伤修复机制，细胞自发修复该缺口的过程中会引入突变(本处“突变”指的是广义突变，包括插入、缺失、狭义突变等形式，这些突变中绝大多数为基因功能失活突变)。
上述靶序列TaCER9含有NcoI酶切识别序列(方框内的序列)，可以被NcoI限制性内切酶切割。靶序列区域被切割后，如果发生了突变，则NcoI酶切识别序列被破坏，将不能被限制性内切酶NcoI切割；如果没有发生突变，将可以被限制性内切酶NcoI切割。
三、重组敲除载体的构建
(一)玉米重组质粒的构建
1、用限制性内切酶BsaI酶切pBUN411质粒，回收约12.5kb的载体骨架，命名为BUN411。
2、根据设计的靶位点ZmCER9序列，合成如下带有粘性末端(下划线部分)的引物：
ZmCer9-1F：5’-GGCGAATAATAGGGTTCCTGCAGA-3’；
ZmCer9-1R：5’-AAACTCTGCAGGAACCCTATTATT-3’。
3、将ZmCER9-1F和ZmCER9-1R进行退火，形成有粘性末端的双链DNA命名为ZmCER9，将其和步骤1中的胶回收产物BUN411连接，得到重组质粒pBUN411-ZmCER9。重组质粒pBUN411-ZmCER9的结构描述为：将pBUN411质粒的两个限制性内切酶BsaI的识别序列之间的片段(约12kb)替换为序列表中序列25的第1-20位所示DNA片段后所得的重组质粒。
(二)小麦重组质粒的构建
1、用限制性内切酶BbsI酶切pU6-gRNA质粒，回收约2.8kb的载体骨架，命名为TaU6-BbsI。
2、根据设计的靶位点TaCER9序列，合成如下带有粘性末端(下划线部分)的引物：
TaCer9-1F：5’-CTTGATGAAGCATCTCATGACCA-3’；
TaCer9-1R：5’-AAACTGGTCATGAGATGCTTCAT-3’。
3、将TaCer9-1F和TaCer9-1R进行退火，形成有粘性末端的双链DNA命名为TaCER9，将其和步骤1中的胶回收产物pU6-gRNA连接，得到重组质粒pU6-TaCer9。重组质粒pU6-TaCer9的结构描述为：将pU6-gRNA质粒的两个限制性内切酶BsaI的识别序列之间的片段替换为序列表中序列26的第2-20位所示DNA片段后所得的重组质粒。
实施例2、转化玉米及小麦
一、转化玉米
将实施例1构建的重组质粒pBUN411-ZmCer9通过基因枪转化的方法导入玉米品种HiII。以HiII未成熟胚及愈伤组织为转化受体，转化后经过组织培养获得完整再生植株。
得到ZmCER9基因功能缺失的转基因植株，即ZmCER9位点发生突变的纯合植株。提取转基因植株基因组DNA，用含有靶位点ZmCER9的特异引物对转化含有pBUN411-ZmCER9的基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物用PstI单酶切。
对纯合突变体的测序结果见图3中A，得到的突变体在ZmCER9-1中含有1bp碱基的插入，最终改变ZmCER9-1基因的阅读框；在ZmCER9-1中含有18bp的缺失，获得ZmCER9-2基因编码的氨基酸发生缺失。
二、转化小麦
将实施例1构建的重组质粒pU6-TaCer9与pJIT163Ubi-Cas9共同转化小麦品种科农119。以科农119未成熟胚为转化受体，转化后经过组织培养获得完整再生植株。
得到TaCER9基因功能缺失的转基因植株，即TaCER9位点发生突变的纯合植株。提取转基因植株基因组DNA，用含有靶位点TaCER9的特异引物对转化含有pU6-TaCer9与pJIT163Ubi-Cas9的基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物用NcoI单酶切。
对纯合突变体的测序结果见图4中A，得到的突变体在TaCER9-a中含有5bp碱基的缺失；在TaCER9-b中含有7bp的缺失；在TaCER9-d中含有5bp碱基的缺失，造成TaCER9-a、TaCER9-b、TaCER9-d同时发生移码突变。
实施例3、突变体植物的表型鉴定
一、冷冻扫描电镜观察
以实施例2中得到的纯合突变体玉米和纯合突变体小麦为材料。分别将突变体材料和相应的野生型植物HiII及科农119进行培养，培养至三周龄，取叶片保存于液氮中。利用冷冻扫描电镜观察叶片表面的蜡质分布情况。
实验结果如图3中B及图4中B所示。可见，无论是玉米还是小麦，其野生型植物叶片表面蜡质呈均匀比较，但在实施例2得到的玉米和小麦突变体中，叶片表面蜡质的分布状态比较类似，呈现出呈簇状分布，而非均匀分布。
二、干旱处理实验
将实施例2中得到的玉米纯合突变体植物与野生型玉米植物HiII共同种植在温室中，生长至6叶期时，停止对植物进行浇水。观察植株的抗旱表型。
结果如图5所示，可见：缺水一周后，野生型玉米植物HiII的所有叶片都出现严重卷曲，这是植物在严重失水后的表型。而实施例2得到的玉米突变体的叶片几乎没有卷曲。说明与野生型玉米植物HiII相比，实施例2得到突变体玉米植物表现出非常强的抗旱能力。
Claims (4)
1.一种获得耐旱性增强的植物的方法，包括如下步骤：将目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因进行突变，从突变后的植物中获得与所述目的植物相比耐旱性增强的植物；
所述将目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因进行突变，是通过基因编辑的方法实现的；
所述基因编辑由核酸酶介导，所述核酸酶能够特异性剪切所述目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因中的靶标片段；所述核酸酶为CRISPR/Cas9核酸酶；
所述将目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因进行突变，是通过如下实现的：向所述目的植物的细胞或组织中导入表达CRISPR/Cas9核酸酶的遗传物质，或者直接导入Cas9蛋白及向导RNA，再将导入后的细胞或组织培养成完整植株；
所述遗传物质为DNA质粒或DNA线性片段或体外转录的RNA；
所述靶标片段为所述目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因序列中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的片段；
N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；
所述目的植物为玉米或小麦；
当所述目的植物为玉米时，所述目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因为ZmCER9-1基因和/或ZmCER9-2基因；所述ZmCER9-1基因在玉米基因组中的序列如序列表中序列2所示；所述ZmCER9-2基因在玉米基因组中的序列如序列表中序列3所示；所述靶标片段的序列如序列表中序列25；
当所述目的植物为小麦时，所述目的植物中与拟南芥AtCER9基因同源的基因为TaCER9-a基因和/或TaCER9-b基因和/或TaCER9-d基因；所述TaCER9-a基因在小麦基因组中的已知序列如序列表中序列4所示；所述TaCER9-b基因在小麦基因组中的已知序列如序列表中序列5所示；所述TaCER9-d基因在小麦基因组中的已知序列如序列表中序列6所示；所述靶标片段的序列如序列表中序列26。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞为任何能作为导入受体并能经过组织培养再生为完整植株的细胞；所述组织为任何能作为导入受体并能经过组织培养再生为完整植株的组织。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述细胞为原生质体细胞或悬浮细胞；所述组织为愈伤组织、幼胚、成熟胚、叶片、茎尖，幼穗或下胚轴。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述导入的方法为基因枪法、农杆菌侵染法、PEG诱导原生质体法、电极法、碳化硅纤维介导法、真空渗入法或其他任何导入方法。
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