CN114574480A - 一种提取水体表面混合摇蚊科昆虫蜕皮总dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取水体表面混合摇蚊科昆虫蜕皮总DNA的方法。本发明主要考察了样本采用蛹皮提取环境DNA，生理盐水处理以及水浴锅保存时间，此外在裂解时对蛹皮的研磨对DNA提取的影响。重点是解决环境DNA提取困难、质量低等问题，传统提取方法与改进后提取方法电泳条带对比，传统方法提取的DNA模糊，较暗，而改进后方法提取的DNA条带亮，且无拖带现象，证明改进后的方法提取的DNA浓度更大，纯度更高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种提取水体表面混合摇蚊科昆虫蜕皮总DNA的方法。
背景技术
摇蚊科属于双翅目，数量众多、分布广泛，在各种水域都有分布，对环境有着极强的适应能力。它的生活史包括卵、幼虫、蛹、成虫四个时期，其中前三个时期都是在水环境中，成虫则是脱离水环境生活。摇蚊的生活史前三个时期都生活在水里，且对水环境有着极强的耐受力，在底栖环境中数量巨大，占底栖生物数量的一半以上，是底栖生物的优势物种。摇蚊科饱含的总很多，有些种喜欢生活在较为干净的水域有的种喜欢生活在水体状态不好的水域中，所以一个水域内摇蚊科物种分布可以反应出此水域的水质情况，近些年来在国内外有很多学者把摇蚊作为环境监测的指示物。以前大多是采集样品鉴定，形态鉴定，现在我们可以提取水环境中的总DNA来确定水域内包含的摇蚊得种，来判断水域内的水体情况。
环境DNA也就是e DNA，是从样本生活的环境（土壤、水体、空气等）中采集，环境中会含有样本脱落的组织、细胞、脱落的皮以及游离的DNA等。环境DNA不仅仅代表样品的DNA，还可以反映出样品在环境中的生存情况。环境DNA可以反映出样品物种分布、物种丰富量，还可以用于生物多样性、物种监测、外来物种监测等许多方面。传统环境DNA的提取方法有氯仿萃取法、细胞溶解的物理破碎法、二氧化硅提取法、试剂盒法等。但传统的提取方法有着提取浓度低，提取纯度低，陈功率不高，耗时长，等弊端。
发明内容
本发明克服了传统提取eDNA的缺陷，提供一种高效提取水体表面混合摇蚊eDNA的方法。本发明的目的是解决较高效提取摇蚊科eDNA方法。为实现此目的，本发明公开的技术内容如下：
一种基于传统提取环境DNA的基础上加以改进得到一种高效提取水体表面混合摇蚊科昆虫蜕皮总DNA的方法。
(1)：去河流、湖泊的下风口处尤其是有少许白色泡沫的岸边，采集摇蚊科蛹皮。
(2)：将采集的摇蚊蛹皮用95%的酒精浸泡5分钟，浸泡两次，之后用蒸馏水冲洗三次，洗去蛹皮上的杂质。
(3)：用生理盐水浸泡蛹皮两个小时，使蛹皮上残存的细胞恢复活性以方便提取DNA。
(4)：将蛹皮放入37°水浴锅恒温保存2小时。
(5)：把处理过的蛹皮放入研钵中，加入解离液充分研磨；所述的解离液（200 ml）的组成如下（W/W）：
CTAB 4g 终浓度2%
SDS 1g 终浓度0.5%
0.5M EDTA 8 ml 终浓度0.02M
1M Tris-HCl 20 ml 终浓度0.1M
5M NaCl 40 ml 终浓度1M
β-巯基乙醇 0.2 ml 终浓度0.1%
后用去离子水补至200 ml。
原料来源：CTAB、SDS，普博欣生物工程有限公司； EDTA、Tris-HCl、蛋白酶K、dNTPs、Taq酶，上海生工生物工程有限公司；RNA酶，北京鼎国生物工程有限公司。
(6)：将样品转移至200ul的试剂盒中（试剂盒中含有缓冲液）使DNA与蛋白质分离并且稳定的核酸结合到硅胶膜上。
(7)：将无水乙醇加入到裂解物中，上样到离心柱上，4°10000转/min离心。
(8)：缓冲液洗涤杂质，低盐洗脱出DNA，干燥处理。
(9)：用100μL的TE (pH8.0) 溶解DNA沉淀, 得到DNA提取液。
(10)：PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分离后检测。
本发明进一步公开了所述方法在用于高效高质量提取水体表面混合摇蚊科昆虫蜕皮总DNA方面的应用。实验结果显示：改进后的方法较传统方法提取的DNA浓度更高，更加高效。该方法主要可用于混合摇蚊科蛹皮DNA的提取，应用PCR技术扩增，琼脂糖凝胶电泳检验，紫外分光光度法测定DNA含量、蜕皮相关基因功能分析、大批量快速提取总DNA进行分子系统学研究、环境生物功能基因组分析、不同质量环境水体中基因响应情况分析及筛选用于生物监测的高效分子信号。
本发明主要考察了样本采用蛹皮提取环境DNA，生理盐水处理以及水浴锅保存时间，此外在裂解时对蛹皮的研磨对DNA提取的影响。重点是解决环境DNA提取困难、质量低等问题，发明的难点在于对于高效时间反应和反应程度的摸索。
本发明的创新点在于用摇蚊蛹皮提取摇蚊科的环境DNA。
本发明公开的传统提取环境DNA的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于更加高效。
本发明的试验方法、实验结果如下：如图1和图2所示，传统提取方法与改进后提取方法电泳条带对比，传统方法提取的DNA模糊，较暗，而改进后方法提取的DNA条带亮，且无拖带现象，证明改进后的方法提取的DNA浓度更大，纯度更高。
试验结论：本专利记载的方法可高效高质量提取水体表面混合摇蚊科昆虫蜕皮总DNA。
附图说明
图1是传统提取方法PCR的结果；
图2是改进后的PCR结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。其中:CTAB、SDS，普博欣生物工程有限公司； EDTA、Tris-HCl、蛋白酶K、dNTPs、Taq酶，上海生工生物工程有限公司；RNA酶，北京鼎国生物工程有限公司。
实施例1
(1)：去河流、湖泊的下风口处尤其是有少许白色泡沫的岸边，采集摇蚊科蛹皮。
(2)：将采集的摇蚊蛹皮用95%的酒精浸泡5分钟，浸泡两次，之后用蒸馏水冲洗三次，洗去蛹皮上的杂质。
(3)：用生理盐水浸泡蛹皮两个小时，使蛹皮上残存的细胞恢复活性以方便提取DNA。
(4)：将蛹皮放入37°水浴锅恒温保存2小时。
(5)：把处理过的蛹皮放入研钵中，加入解离液充分研磨；所述的解离液（200 ml）的组成如下（W/W）：
CTAB 4g 终浓度2%
SDS 1g 终浓度0.5%
0.5M EDTA 8 ml 终浓度0.02M
1M Tris-HCl 20 ml 终浓度0.1M
5M NaCl 40 ml 终浓度1M
β-巯基乙醇 0.2 ml 终浓度0.1%
后用去离子水补至200 ml。
原料来源：CTAB、SDS，普博欣生物工程有限公司； EDTA、Tris-HCl、蛋白酶K、dNTPs、Taq酶，上海生工生物工程有限公司；RNA酶，北京鼎国生物工程有限公司。
(6)：将样品转移至200ul的试剂盒中（试剂盒中含有缓冲液）使DNA与蛋白质分离并且稳定的核酸结合到硅胶膜上。
(7)：将无水乙醇加入到裂解物中，上样到离心柱上，4°10000转/min离心。
(8)：缓冲液洗涤杂质，低盐洗脱出DNA，干燥处理。
(9)：用100μL的TE (pH8.0) 溶解DNA沉淀, 得到DNA提取液。
(10)：PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分离后检测。
实施例2
PCR反应
（1）PCR反应体系：
总体系50 ul：ddH2O 32.4 ul，10ⅹPCR Buffer 5 ul，dNTPs (2.5 mmol/L) 4ul，通用引物LCO和HCO(10 u mol/L ) 各2 ul，Taq酶 ( 500 U，2.5 U /ul)0.6 ul，DNA模板4 ul。
（2）PCR反应条件：
94℃预变性5 min；94℃变性10 s；55℃退火30 s；72℃延伸60s；35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。
（3） 对DNA进行分光光度检验，对PCR产物配置1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。
实验结果：
电泳图见图1和图2。
实验结论：改进后的方法较传统方法提取的DNA浓度更高，更加高效。
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。
Claims (2)
1.一种提取水体表面混合摇蚊科昆虫蜕皮总DNA的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
(1)去河流、湖泊的下风口处尤其是有少许白色泡沫的岸边，采集摇蚊科蛹皮；
(2)将采集的摇蚊蛹皮用95%的酒精浸泡5分钟，浸泡两次，之后用蒸馏水冲洗三次，洗去蛹皮上的杂质；
(3)用生理盐水浸泡蛹皮两个小时，使蛹皮上残存的细胞恢复活性以方便提取DNA；
(4)将蛹皮放入37°水浴锅恒温保存2小时；
(5)把处理过的蛹皮放入研钵中，加入解离液充分研磨；所述的解离液200 ml的组成如下（W/W）：
CTAB 4g 终浓度2%
SDS 1g 终浓度0.5%
0.5M EDTA 8 ml 终浓度0.02M
1M Tris-HCl 20 ml 终浓度0.1M
5M NaCl 40 ml 终浓度1M
β-巯基乙醇 0.2 ml 终浓度0.1%
后用去离子水补至200 ml;
(6)将样品转移至200ul的试剂盒中，使DNA与蛋白质分离并且稳定的核酸结合到硅胶膜上；
(7)将无水乙醇加入到裂解物中，上样到离心柱上，4°10000转/min离心；
(8)缓冲液洗涤杂质，低盐洗脱出DNA，干燥处理；
(9)用100μL的TE (pH8.0) 溶解DNA沉淀, 得到DNA提取液；
(10)PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分离后检测。
2.专利要求1所述方法在用于高效高质量提取水体表面混合摇蚊科昆虫蜕皮总DNA方面的应用。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114574480B (zh) | 2024-03-01 |
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