CN109022427A - 一种提取香菇基因组dna的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取香菇基因组DNA的试剂盒及方法。试剂盒的组成包括：（1）平衡液：2% Na2SiO3·9H2O，2% NaOH；（2）裂解液：5.0M盐酸胍，30%异丙醇和1%PVP K30；（3）洗涤液：20mM NaCl，20mM Tris‑HCl，90%乙醇，pH7.5；（4）洗脱液，10mM Tris‑HCl，pH8.5；（5）DNA吸附柱。本发明提取香菇基因组DNA的试剂无苯酚、氯仿等有毒物质，更安全；提取方法简便、高效，提取时间缩短至10 min；提取产物纯度高、完整性好，能够直接用于分子生物学和遗传学研究。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种提取香菇基因组DNA的试剂盒及方法。
背景技术
DNA是生命体中遗传信息的载体，包含了生物体的遗传性状。高质量、高纯度的总DNA是保证开展PCR扩增、限制性内切酶酶切、遗传图谱分析、分子杂交、遗传多样性分析以及基因组学等分子生物学研究的首要条件。因此，高效、快速制备高纯度、完整性好的总DNA样品显得极为重要。
目前，传统制备真菌总DNA的方法包括CTAB法、SDS法、碱裂解法和常规试剂盒方法等。CTAB法和SDS法采用离子型表面活性剂用于裂解真菌细胞，使基因组释放出来，再通过苯酚/氯仿/异戊醇等的多次抽提使蛋白质等沉淀于有机试剂中，最后经过异丙醇或者乙醇沉淀得到纯度高、完整性好的DNA分子。在这两种方法中存在反复离心、沉淀、等待的工序，操作繁琐且耗时长，其提取过程需要2-3 h；且药品中苯酚、氯仿和异戊醇等有机溶剂具有毒性，对操作人员可能造成一定伤害；其次可能导致有机溶剂残留在总DNA样品中从而造成下游试验无法顺利进行。
常规试剂盒方法是在CTAB法、SDS法等常规方法等基础上结合DNA吸附柱进行优化，解决了DNA样品沉淀时间长和样品纯度低的缺点，且整个实验过程缩短到1h左右。但是，常规试剂盒方法提取过程中依然需要涉及氯仿、苯酚、β-巯基乙醇等有毒试剂。
碱裂解法直接利用强碱NaOH溶液使细胞膜溶解，蛋白变性，释放基因组DNA，再经过TE缓冲液对碱溶液稀释中和，从而得到了DNA溶液直接用于PCR扩增，是目前最为常见的快速简便提取基因组DNA的方法。该方法得到的DNA由于不经过任何纯化处理，含有大量色素、多糖和蛋白等物质，其含量和纯度都低，不利于后续实验，且反应过程中强碱NaOH会打断DNA片段，导致该方法获得的DNA样品扩增上限仅为1000 bp左右的基因，但对于较长的基因片段而言，这种提取方法显然不适用。
香菇又名香蕈、香菌、香菰等，是世界第二大食用菌，我国第一大食用菌。主要产地在我国、日本和韩国等国，在民间素有“山珍”之称。其味道鲜美，香气沁人，营养丰富，是高蛋白、低脂肪的营养保健食品。中医不少古籍记载香菇“益气不饥、治风破血、益胃助食”，现代医学和营养学不断深入研究，香菇的药用价值也不断被发掘。香菇富含维生素B群、铁、钾、维生素D等，其中香菇多糖能增强免疫力，从而抑制肿瘤细胞的生长。随着现代生物技术的发展，香菇分子生物学的研究也逐步深入，但由于香菇子实体和菌丝体中含有大量黏性的多糖类物质等干扰，因此目前香菇基因组DNA的提取方法有的操作复杂用时长，有的用到苯酚、氯仿、β-巯基乙醇等有毒物质，有的DNA完整度差。因此，针对以上不足并通过对现有提取技术的改进发明了本方法，具有安全、快速、简便、高效、产物完整度高、经济等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取香菇基因组DNA的试剂盒及方法。本发明通过多次优化实验流程和试剂配方，总结出一种安全、快速、简单、高效提取香菇基因组DNA的方法。该方法利用硅酸铝陶瓷纤维膜与DNA在不同盐离子浓度和pH条件下的结合程度不同从而达到提取、分离、纯化DNA的目的。本方法操作安全、快速、简单，10 min就能完成整个基因组DNA的制备过程，提取过程中原料用量少、无需β-巯基乙醇抗氧化、酚、氯仿抽提，避免了有毒有机溶剂对操作人员的污染；实验结果显示，基因组DNA完整性好，纯度高，适用于PCR、SSR、ISSR、qPCR等实验。从而解决了现有提取技术样品用量大、耗时长、试剂有毒、提取的DNA片段较短等缺点，以满足香菇等珍贵材料分子生物学实验的需要。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提取香菇基因组DNA的试剂盒，该试剂盒的组成包括：
（1）平衡液（Balance Buffer），包含以下组成成分：2% Na2SiO3·9H2O，2% NaOH；
（2）裂解液（Lysis Buffer），包含以下组成成分：5.0M盐酸胍，30%异丙醇和1%PVP K30；
（3）洗涤液（Wash Buffer），包含以下组成成分：20 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，90%乙醇，pH 7.5；
（4）洗脱液（Elution Buffer），包含以下组成成分：10 mM Tris-HCl，pH 8.5；
（5）DNA吸附柱。
进一步的，所述DNA吸附柱为硅酸铝陶瓷纤维膜DNA吸附柱。
利用上述试剂盒提取香菇基因组DNA的方法，包括如下操作步骤：
（1）向DNA吸附柱中加Balance Buffer 200 μL，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液，对DNA吸附柱进行预处理；
（2）将2-50 mg样品研磨后加入Lysis Buffer 500 µl，混匀，室温 10,000 rpm，离心30s；
（3）将上清转移到处理过的DNA吸附柱，室温10,000 rpm，离心1 min，弃废液；
（4）向DNA吸附柱中加入Wash Buffer 650 µl，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液后将DNA吸附柱套回废液收集管，室温10,000 rpm，离心1 min。
（5）将DNA吸附柱移到新的1.5 mL EP管中，开盖放置1-2 min去除乙醇残留，加入65℃预热的Elution Buffer，30-100µl，静置1-2 min，或在其中加入20 μg/ mL 的RNA酶，37℃孵育30 min，去除RNA；
（6）室温12,000 rpm离心2 min，洗脱DNA，保存备用。
备注：提取的DNA可存放于4℃，如需长期保存，请放置于-20℃中保存。
进一步的，提取步骤（5）中的Elution Buffer，65℃预热。
进一步的，本发明的一种提取香菇基因组DNA的试剂盒在食用菌基因组DNA的提取及ITS分子生物学鉴定中的应用。
本发明的优点和有益效果为：
（1）在DNA分离纯化过程中，本发明使用了硅酸铝陶瓷纤维膜DNA吸附柱，并通过使用本发明研发的平衡液对硅酸铝陶瓷纤维膜进行预处理，可明显增加硅酸铝陶瓷纤维膜与DNA的结合率，从而提高基因组DNA的提取率；
（2）通过优化裂解液和洗涤液的配方，一方面可以充分的去除蛋白、多糖等杂质，另一方面由于不使用苯酚、氯仿等有机试剂，避免了有毒试剂对操作人员造成的毒害和残留有机试剂对下游试验的抑制作用；
（3）在DNA洗脱的步骤中，通过65℃预热Elution Buffer，来加快分子的热运动，使DNA分子更容易与硅胶柱分离，最大程度的保证DNA的洗脱效率。
本发明的一种提取香菇基因组DNA的试剂盒及方法，操作简单、快速，提取时间缩短至10 min；提取产物的提取率高、纯度高、完整度高，能够直接用于PCR、Real-Time PCR、分子标记等下游分子生物学试验；能够从香菇等真菌的子实体、菌丝体及其他发酵产物等多种材料中快速提取基因组DNA，提取产物能更好地满足分子生物学和遗传学的研究。
附图说明
图1为采用本发明方法试剂盒及方法提取的香菇子实体、菌丝体以及平菇、双孢菇、金针菇子实体基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图。图中样品依次为：M，北京全式金公司Trans 15K DNA Marker；1，香菇子实体基因组DNA；2，香菇菌丝体基因组DNA；3，平菇子实体基因组DNA；4，双孢菇子实体基因组DNA；5，金针菇子实体基因组DNA。
图2为以采用本发明试剂盒及方法提取的香菇子实体、菌丝体、干样品DNA以及平菇、双孢菇、金针菇子实体基因组DNA为模板进行ITS序列扩增的琼脂糖凝胶电泳图。图中样品依次为：M，北京全式金公司Trans 15K DNA Marker；1，香菇子实体ITS片段；2，香菇菌丝体ITS片段；3，香菇干样品ITS片段；4，平菇子实体ITS片段；5，双孢菇子实体ITS片段；6，金针菇子实体ITS片段。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明进一步说明
实施例1、采用本发明的试剂盒及方法提取香菇菌丝体和子实体的基因组DNA
试剂盒的组成包括：
（1）Balance Buffer，包含以下组成成分：2% Na2SiO3·9H2O，2% NaOH；
（2）Lysis Buffer，包含以下组成成分：5.0M盐酸胍，30%异丙醇和1%PVP K30；
（3）Wash Buffer，包含以下组成成分：20 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，90%乙醇，pH 7.5；
（4）Elution Buffer，包含以下组成成分：10 mM Tris-HCl，pH 8.5；
（5）DNA吸附柱。
所述DNA吸附柱为硅酸铝陶瓷纤维膜DNA吸附柱。
分别收集同一培养条件下香菇的菌丝体和子实体，具体步骤如下：
（1）向硅酸铝陶瓷纤维膜DNA吸附柱中加Balance Buffer 200 μL，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液，对DNA吸附柱进行预处理；
（2）将50 mg样品研磨后加入Lysis Buffer 500 µl，混匀，室温 10,000 rpm，离心30s；
（3）将上清转移到处理过的DNA吸附柱，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液；
（4）向DNA吸附柱中加入Wash Buffer 650 µl，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液后将DNA吸附柱套回废液收集管，室温10,000 rpm离心1 min。
（5）将DNA吸附柱移到新的1.5 mL EP管中，开盖放置2 min去除乙醇残留，加入65℃预热的Elution Buffer100µl，静置2 min
（6）12,000 rpm离心2 min，洗脱DNA，保存备用。
所提基因组DNA的浓度测定结果为：菌丝体220ng/µl，OD260/OD280=1.915；子实体330ng/µl，260/280=1.923。
实施例2 采用本发明的试剂盒及方法提取食用菌基因组DNA
试剂盒的组成包括：
（1）Balance Buffer，包含以下组成成分：2% Na2SiO3·9H2O，2% NaOH；
（2）Lysis Buffer，包含以下组成成分：5.0M盐酸胍，30%异丙醇和1%PVP K30；
（3）Wash Buffer，包含以下组成成分：20 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，90%乙醇，pH 7.5；
（4）Elution Buffer，包含以下组成成分：10 mM Tris-HCl，pH 8.5；
（5）DNA吸附柱。
所述DNA吸附柱为硅酸铝陶瓷纤维膜DNA吸附柱。
分别收集香菇子实体、香菇菌丝体以及平菇、双孢菇、金针菇子实体样品，利用本发明的试剂盒及方法，提取这些样品的基因组DNA，具体步骤如下;
（1）向DNA吸附柱中加Balance Buffer 200 μL，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液，对DNA吸附柱进行预处理；
（2）将2mg样品研磨后加入Lysis Buffer 500 µl，混匀，室温 10,000 rpm，离心30 s；
（3）将上清转移到处理过的DNA吸附柱，室温10,000 rpm，离心1 min，弃废液；
（4）向DNA吸附柱中加入Wash Buffer 650 µl，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液后将DNA吸附柱套回废液收集管，室温10,000 rpm，离心1 min。
（5）将DNA吸附柱移到新的1.5 mL EP管中，开盖放置1 min去除乙醇残留，加入65℃预热的Elution Buffer，30µl，静置1 min，或在其中加入20 μg/ mL 的RNA酶，37℃孵育30 min，去除RNA；
（6）室温12,000 rpm离心2 min，洗脱DNA，保存备用。
实施例3、香菇ITS序列PCR扩增
采用食用菌ITS片段通用引物ITS-4/5，对提取的香菇子实体、菌丝体、干样品以及平菇、双孢菇、金针菇子实体样品的基因组DNA进行PCR扩增检测。
引物序列为：
ITS-4: 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’
ITS-5: 5’- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG -3’
PCR扩增所用试剂购自北京全式金生物科技有限公司，反应的体系为：
PCR反应的条件为：94℃ 7min → [94℃ 30s → 56℃ 30s → 72℃ 30s] ×34cycles → 72℃ 10min → 4℃。
实施例4、琼脂糖凝胶电泳分析
基因组DNA和PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，上样缓冲液为10×LoadingBuffer，电泳缓冲液为1×TAE，分子量标准Marker为Trans 15K，EB染色，紫外凝胶成像仪在312nm下观察并拍照。
采用本发明试剂盒及方法提取的香菇子实体、菌丝体以及平菇、双孢菇、金针菇子实体基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图，如图1所示。结果表明，以本发明试剂盒及方法提取的香菇子实体和菌丝体两种样品和平菇、双孢菇、金针菇另外三种食用菌子实体样品的基因组DNA，均能得到电泳可见的基因组；图中电泳条带清晰整齐，无拖带现象，表明利用本发明试剂盒及提取方法提取的基因组DNA，纯度高，完整性好，无降解。
以采用本发明试剂盒及方法提取的香菇子实体、菌丝体、干样品以及平菇、双孢菇、金针菇子实体的基因组DNA为模板进行ITS序列扩增的琼脂糖凝胶电泳图，如图2所示。结果表明，用通用引物ITS-4/5做引物，以香菇子实体、菌丝体、干样品基因组DNA及平菇、双孢菇、金针菇另外三种食用菌子实体样品的基因组DNA为模板，进行ITS扩增，所有样品都获得了大小在600bp左右的目的条带，且条带皆明亮、清晰、整齐，表明利用本发明试剂盒及提取方法提取的基因组DNA质量优良，具有广泛的适用性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种提取香菇基因组DNA的试剂盒及方法
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22
Claims (5)
1.一种提取香菇基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组成包括：
（1）平衡液，包含以下组成成分：2% Na2SiO3·9H2O，2% NaOH；
（2）裂解液，包含以下组成成分：5.0M盐酸胍，30%异丙醇和1%PVP K30；
（3）洗涤液，包含以下组成成分：20 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，90%乙醇，pH 7.5；
（4）洗脱液，包含以下组成成分：10 mM Tris-HCl，pH 8.5；
（5）DNA吸附柱。
2.根据权利要求1所述的一种提取香菇基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述DNA吸附柱为硅酸铝陶瓷纤维膜DNA吸附柱。
3.一种利用权利要求1或2所述试剂盒提取香菇基因组DNA的方法，其特征在于，包含以下步骤：
（1）向DNA吸附柱中加平衡液200 μL，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液，对DNA吸附柱进行预处理；
（2）将2-50 mg样品研磨后加入裂解液500 µl，混匀，室温 10,000 rpm，离心30 s；
（3）将上清转移到处理过的DNA吸附柱，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液；
（4）向DNA吸附柱中加入洗涤液650 µl，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液后将DNA吸附柱套回废液收集管，室温10,000 rpm离心1 min；
（5）将DNA吸附柱移到新的1.5 mL EP管中，开盖放置1-2 min去除乙醇残留，加入65℃预热的洗脱液30-100µl，静置1-2 min；或在其中加入20 μg/ mL 的RNA酶，37℃孵育30min，去除RNA；
（6）室温12,000 rpm离心2 min，洗脱DNA，保存备用。
4.根据权利要求3所述的提取香菇基因组DNA的方法，其特征在于，步骤（5）中的洗脱液，65℃预热。
5.如权利要求1 所述的一种提取香菇基因组DNA的试剂盒在食用菌基因组DNA提取及ITS分子生物学鉴定中的应用。
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