CN113025743A - 油菜高抗裂角位点qSRIchrC9及其分子标记和应用 - Google Patents
油菜高抗裂角位点qSRIchrC9及其分子标记和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域,具体涉及油菜高抗裂角位点qSRIchrC9及其分子标记和应用。该位点位于油菜C9染色体上,高抗裂角性状受一对隐性单基因控制。本发明公开三个与该高抗位点紧密连锁的分子标记S10、S13和S15,由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的DNA分子组成。本发明中的位点和标记可应用于油菜育种中抗裂角品种的选育。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域,具体涉及油菜高抗裂角位点qSRIchrC9及其分子标记和应用。
技术背景
油菜是我国重要的油料作物,油菜在我国分布广,种植面积大(郭燕枝等,2016)。油菜能够有效利用长江流域的冬闲耕地,菜籽油营养丰富且均衡,是目前我国最常用的食用油(张哲等,2018)。所以,油菜产业的发展对我国农业发展和人民生命健康有着十分积极的意义。
在我国油菜产业化发展的进程中,机械化是油菜产业现代化的重要制约因素。其中,由于油菜裂角造成的机械化收割问题尤为突出,会造成15%左右的损失,严重时会超过50%(Andrea et al,2016)。解决油菜裂角问题是我国目前油菜产业发展的重要课题。
目前,人类对拟南芥的角果开裂机制已经有十分深入的研究。转录因子SHP1和SHP2正调控转录因子IND和ALC(Sarah J et al.,2000;Sarah J et al.,2004),IND调控离区的木质化层和分离层的形成发育,ALC调控离区的分离层的形成发育(Ballester andFerrán diz,2017;Girinet al.,2011)。FUL和RPL分别在果瓣和胚座框表达,抑制离区向果瓣和胚座框的入侵(Roeder et al.,2003;Kay et al.,2012)。NST1和NST3直接参与内果皮b的木质化(Oda and Fukuda,2012)。果胶酶ADPG1和ADPG2(Mikihiro Ogawa et al.,2009)、纤维素酶CEL6和半纤维素酶MAN7(Hanjun He et al.,2018)对分离层细胞的细胞壁结构进行修饰,使细胞间的联系松弛,在角果皮张力的作用下使分离层裂开。此外,这一调控网络中还有许多其他基因,包括一些激素相关基因的参与(Ballester and Ferrándiz,2017)。
借助拟南芥裂角机制的研究成果及基因编辑、EMS诱变技术的应用,人们成功地获得了BnALC及BnIND的油菜突变植株,同时获得了一些裂角抗性提高了的株系,为油菜裂角性的改良提供了理论基础和育种材料(Braatz et al.,2017,2018)。除此之外,在油菜中定位了一些与抗裂角相关的QTL(Liu et al.,2016),最大的能解释表型变异的20%左右。然而,仍需鉴定出更好的油菜抗裂角资源材料,鉴定出效应值更大的抗裂角位点,并开发出相应的分子标记提供育种利用。
农业部发布的行业标准《油菜抗裂角性鉴定技术规程(NY/T 3066-2016)》中对利用随机碰撞法鉴定抗裂角性的分级标准为:抗裂角指数SRI=0-0.2(极易裂)、0.2-0.4(易裂)、0.4-0.6(低抗)、0.6-0.8(中抗)和0.8-1.0(高抗)。我们对油菜种质资源的大量筛选鉴定,获得了一份高抗裂角油菜品系OR88。利用随机碰撞法,OR88角果的抗裂角指数为0.85,属于高抗类型。通过QTL-seq分析,鉴定出一个单一的控制OR88裂角抗性的遗传位点,位于C9染色体上。进一步对qSRIchrC9进行精细定位,获得了与qSRIchrC9紧密连锁的三个KASP标记S10、S13和S15。这三个标记可以用于对qSRIchrC9的鉴定,辅助抗裂角性品种的选育。
发明内容
本发明提供了一种油菜高抗裂角位点qSRIchrC9,该位点位于油菜C9染色体上,针对该位点开发了三个KASP标记S10、S13和S15,所述标记由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQID No.3所示的DNA分子组成。
本发明的另一个目的在于提供了针对上述三个分子标记开发的引物。
本发明的最后一个目的在于提供油菜高抗裂角位点qSRIchrC9分子标记或其检测引物在油菜育种中的应用,特别是高抗裂角性油菜品种的选育。
为实现上述目的,采取以下技术措施:
将油菜高抗裂角材料OR88(2020年8月23日申报植物新品种权保护,申请号20201004606,该品种已商业流通,可从中国农业科学院油料作物研究所购得)和正常角果类型品系87(该品种已商业流通,可从中国农业科学院油料作物研究所购得)杂交,获得F1代种子后自交,获得F2群体;利用F2群体对抗裂角性进行鉴定,结合QTL-seq分析,获得基因所在候选区域,在候选区域进行标记开发,再一次利用F2群体对目标基因进行精细定位,油菜高抗裂角位点qSRIchrC9,针对该位点开发了与高抗裂角性紧密连锁的KASP分子标记S10、S13和S15,所述标记由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的DNA分子组成。
检测分子标记S10的引物为:
S10HF:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT ACACCACCAACAAAGCAACTC-3’
S10NF:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT ACACCACCAACATAGTAGCCT-3’
S10R:5’-CTTTGTTCTTCGCTTCTTGAG-3’;
检测分子标记S13的引物为:
S13-HF:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT CCTGCTGTATACATATCTCCG-3’
S13-NF:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT CCTGCTGTATACATATCTCCT-3’
S13-R:5’-AATAAGACGCTTACCTGAACC-3’;
检测分子标记S15的引物为:
S15-F:5’-CACGTGATCAGCGTTTCCAT-3’
S15-HR:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT GCGATTCCATCTTGGGAATAG-3’
S15-NR:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT GCGATTCCATCTTGGGAATAC-3’。
本发明的保护范围还包括,上述分子标记在甘蓝型油菜抗裂角性育种中的应用,包括用于甘蓝型油菜抗裂角性育种筛选中的应用;利用上述三个引物中的任何一对、或是两两组合,或是3个一起进行PCR分子检测,均可进行抗裂角油菜的育种筛选。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
本发明开发了油菜高抗裂角位点qSRIchrC9及标记,该标记可以高通量、低成本地筛选出高抗裂角材料。对油菜抗裂角育种具有十分重要的意义。
附图说明
图1为实施例1中qSRIchrC9位点S10标记在87和OR88的F2群体中的KASP分型图;
其中Allele 1为OR88类型,Allele 2为87类型,Heterozygote为杂合子类型,None为空对照。
图2为实施例1中qSRIchrC9位点S13标记在87和OR88的F2群体中的KASP分型图;
其中Allele 1为OR88类型,Allele 2为87类型,Heterozygote为杂合子类型,None为空对照。
图3为实施例1中qSRIchrC9位点S15标记在87和OR88的F2群体中的KASP分型图;
其中:Allele 1为OR88类型,Allele 2为87类型,Heterozygote为杂合子类型,None为空对照。
具体实施方式
本发明所述技术方案,如未特别说明,均为本领域的常规方案;所述试剂或材料,如未特别说明,均来源于商业渠道。下面结合具体实例对本发明进行进一步说明。本发明的甘蓝型油菜高抗裂角材料OR88和甘蓝型油菜正常角果类型品系87,均已进入市场流通体系,可从从中国农业科学院油料作物研究所购得。
实施例1:
qSRIchrC9位点的定位:
(a)OR88与87的F2群体的构建与抗裂角相关的基因的遗传分析
甘蓝型油菜高抗裂角材料OR88和甘蓝型油菜正常角果类型品系87进行杂交获得F1杂交种。之后,将F1进行自交获得F2群体。对F2分离群体的222个单株进行表型鉴定并统计,分别获得161个非高抗裂角单株(0.50<SRI),这些单株具有正常类型角果,和61个高抗裂角单株(SRI>0.8)。卡方分析表明,非高抗裂角(正常类型角果)单株对高抗裂角单株的比例符合3:1分离(χ=0.727,p=0.39),证明高抗裂角性状受一对核隐性单基因控制。
(b)qSRIchrC9的定位与连锁标记的开发
利用F2群体对目标基因进一步定位,通过QTL-seq分析,发现qSRIchrC9位于C9染色体上0-36Mb内。在候选区域进行标记开发,再次利用扩大的F2群体进行定位,发现目标基因与S10(图1)、S13(图2)和S15(图3)三个KASP标记紧密连锁。
针对这三个分子标记设计的引物如下:
分子标记S10的引物为:
S10HF:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT ACACCACCAACAAAGCAACTC-3’、
S10NF:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT ACACCACCAACATAGTAGCCT-3’、
和S10R:5’-CTTTGTTCTTCGCTTCTTGAG-3’;
分子标记S13的引物为:
S13-HF:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT CCTGCTGTATACATATCTCCG-3’、S13-NF:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT CCTGCTGTATACATATCTCCT-3’、和S13-R:5’-AATAAGACGCTTACCTGAACC-3’;
分子标记S15的引物为:
S15-F:5’-CACGTGATCAGCGTTTCCAT-3’、
S15-HR:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT GCGATTCCATCTTGGGAATAG-3’、
和S15-NR:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT GCGATTCCATCTTGGGAATAC-3’。
实施例2:
与油菜高抗裂角位点qSRIchrC9紧密连锁的分子标记在油菜抗裂角育种中的应用:
在本实施例中,所用的分子标记为:
S10标记:
S10HF:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT ACACCACCAACAAAGCAACTC-3’
S10NF:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT ACACCACCAACATAGTAGCCT-3’
S10R:5’-CTTTGTTCTTCGCTTCTTGAG-3’
S13标记:
S13-HF:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT CCTGCTGTATACATATCTCCG-3’
S13-NF:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT CCTGCTGTATACATATCTCCT-3’
S13-R:5’-AATAAGACGCTTACCTGAACC-3’
S15标记:
S15-F:5’-CACGTGATCAGCGTTTCCAT-3’
S15-HR:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT GCGATTCCATCTTGGGAATAG-3’
S15-NR:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT GCGATTCCATCTTGGGAATAC-3’
这三个引物中任何一对或是一对以上都能很好地鉴定qSRIchrC9。
(a)将引物先稀释到100μM,然后,将通用引物(短引物)15μL,两个特异引物(两个长引物)各6μL,补ddH2O到50μL配制成引物混合液。
(b)利用CTAB法(或其他植物基因组抽提方法)获取目标植株的基因组DNA。将所获取的DNA样品统一稀释到10-20ng/μL左右。
(c)配制KASP反应,按仪器型号对应使用96孔PCR板或是384孔PCR板体系如下:
(d)将配好的体系置于荧光定量PCR仪(只要能读取HEX,FAM和ROX信号即可),PCR程序如下:
1.94℃ 15分钟
2.94℃ 20秒
3.61℃ 1分钟每个循环降0.6℃
4.到步骤2 9个循环
5.94℃ 20秒
6.55℃ 1分钟
7.到步骤5 26个循环
8.37℃ 1分钟荧光读取
本实施例中,一共对27份抗裂角性有差异的品系(抗裂角指数低于0.4)和三个OR88单株(抗裂角指数0.85左右)进行检测(表1)。检测结果显示只有OR88具有抗裂角型的S10、S13和S15。
表1:qSRIchrC9与抗裂角关系。
注:灰色背景表示该变异位点来自OR88。
序列表
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 油菜高抗裂角位点qSRIchrC9及其分子标记和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcacatcaa caacatcatg gtcatgatca acaacatcaa catcaacaac aacatgatgg 60
ttatgcatat cagtcacacc accaacaaag caactccctt tttcttcaat cactaactcc 120
tccgtctcaa gaagcgaaga acaaagttag atcttcttgt tctccttcct ctggtgctcc 180
<210> 2
<211> 182
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttttcttgt ctttcggctc acaaactgtg tgatccacag gaattatcct atgtgaactc 60
tggccctgct gtatacatat ctccgtcagg accgaatcct attatggttc aggtaagcgt 120
cttattttct aaacctattt tatactttta agtacatttt ttcctgtttg ttgcagcctt 180
tt 182
<210> 3
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagttccccg cgctagctgc aaccactata tttcttttaa ccgcatgcaa cgctcctatc 60
gcgattccat cttgggaata gggcaaaggg tccgtagtcc cgatggaaac gctgatcacg 120
tgaaccccat caccgatcgc atcatcaatc gcggcaagca tgtcttcttg tagacatacg 180
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tacaccacca acaaagcaac tc 42
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tacaccacca acatagtagc ct 42
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctttgttctt cgcttcttga g 21
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc tcctgctgta tacatatctc cg 42
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat tcctgctgta tacatatctc ct 42
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aataagacgc ttacctgaac c 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cacgtgatca gcgtttccat 20
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaggtgacc aagttcatgc tgcgattcca tcttgggaat ag 42
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaaggtcgga gtcaacggat tgcgattcca tcttgggaat ac 42
Claims (10)
1.一套与油菜高抗裂角性状紧密连锁的分子标记,所述标记由SEQ ID No. 1、SEQ IDNo. 2和SEQ ID No. 3所示的DNA分子组成。
2.权利要求1所述的分子标记在甘蓝型油菜抗裂角性育种中的应用。
3.权利要求1所述的分子标记的引物在甘蓝型油菜抗裂角性育种筛选中的应用。
4.根据权力要求1所述的标记,所述的SEQ ID No. 1DNA分子的引物为:5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACACCACCAACAAAGCAACTC-3’、5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACACCACCAACATAGTAGCCT-3’和5’- CTTTGTTCTTCGCTTCTTGAG-3’。
5.根据权力要求1所述的标记,所述的SEQ ID No. 2 DNA分子的引物为:GAAGGTGACCAAGTTCATGCT CCTGCTGTATACATATCTCCG-3’、5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCTGCTGTATACATATCTCCT-3’和5’- AATAAGACGCTTACCTGAACC-3’。
6.根据权力要求1所述的标记,所述的SEQ ID No. 3DNA分子的引物为:CACGTGATCAGCGTTTCCAT-3’、5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT GCGATTCCATCTTGGGAATAG-3’和5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCGATTCCATCTTGGGAATAC-3’。
7.一种与油菜高抗裂角性状紧密连锁的分子标记引物,所述的引物为:5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACACCACCAACAAAGCAACTC-3’、5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACACCACCAACATAGTAGCCT-3’和5’- CTTTGTTCTTCGCTTCTTGAG-3’。
8.一种与油菜高抗裂角性状紧密连锁的分子标记引物组合,所述的引物组合为:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT ACACCACCAACAAAGCAACTC-3’、5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACACCACCAACATAGTAGCCT-3’、5’- CTTTGTTCTTCGCTTCTTGAG-3’;和5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCTGCTGTATACATATCTCCG-3’、5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCTGCTGTATACATATCTCCT-3’、5’-AATAAGACGCTTACCTGAACC-3’。
9.一种与油菜高抗裂角性状紧密连锁的分子标记引物组合,所述的引物组合为:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACACCACCAACAAAGCAACTC-3’、5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACACCACCAACATAGTAGCCT-3’、5’- CTTTGTTCTTCGCTTCTTGAG-3’;和5’- CACGTGATCAGCGTTTCCAT-3’、5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCGATTCCATCTTGGGAATAG-3’、5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCGATTCCATCTTGGGAATAC-3’。
10.权利要求7所述的引物,或8或9所述的引物组合在甘蓝型油菜高抗裂角性状育种筛选中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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