CN102747080A - 油菜抗裂角性状主效基因位点分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种油菜抗裂角性状主效基因位点分子标记及应用，步骤包括：1）利用在抗裂角性状上有显著差异的甘蓝型油菜品种中双11和73290杂交，后代自交获得抗裂角性状分离的F2和F2:3分离群体；2）利用SSR引物对亲本DNA进行多态性的筛选，通过对F2代分离群体进行SSR分子标记基因型分析构建遗传连锁图谱；3）通过对F2和F2:3分离群体进行田间实验和考种获得抗裂角性状的表型数据；4）结合开发的高密度分子标记遗传连锁图谱，以及分离群体的基因型和表型数据，利用QTLCart2.5软件进行QTL检测，检测到甘蓝型有爱A9连锁群上控制油菜抗裂角的主效基因位点Psr.A9，与该主效基因位点紧密连锁的分子标记BrSF0007-39，利用该标记进行辅助选择可大大提高抗裂角育种的选择效率。

Description

油菜抗裂角性状主效基因位点分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及甘蓝型油菜抗裂角性状主效基因位点及其紧密连锁的分子标记，同时还涉及该分子标记在油菜高抗裂角育种中的应用。

背景技术

油菜是世界第三大油料作物，也是我国继水稻、小麦、玉米和大豆之后的第五大农作物，全世界大约13%的植物油来自于油菜。除了作为食用油的主要原料之外，油菜也是重要的工业原料和欧盟主要成员国可再生能源的主要生物资源。我国油菜的种植面积和总产量均占世界的30%左右，它不仅关系到我国种植业结构的调整、优化和近亿农民的增收，也关系到满足人民生活水平提高、膳食结构改善及保障国家食物安全的需要，因此，加强油菜生产意义重大。

机械化是现代农业发展的方向，而油菜角果易开裂正是目前制约油菜产业机械化收获的瓶颈，严重地影响着油菜产业生产效率的提高。由于目前生产上利用的甘蓝型油菜在成熟时特别容易裂角，一般都会造成产量损失10%左右，机械化收割损失将更加严重。如果遇到成熟期气候比较恶劣，产量损失可高达50%以上，造成丰产不丰收。而且，易裂角除了带来产量损失外还会造成一系列其他的不良影响，如落地籽粒在条件适宜时会萌发形成自生苗，影响下茬作物生长，同时也增加了使用除草剂去除再生苗的成本。未来随着转基因油菜的推广应用，角果开裂种子散落还会带来生态风险。目前生产上为了避免裂角造成的产量损失和对下茬作物的不良影响，通常是提前收获，但这样做会造成油菜籽含油量下降，种子中叶绿素含量过高，影响食用油的品质。因此，选育抗裂角的油菜品种对油菜生产显得极为重要。但一般甘蓝型油菜品种间抗裂角特性变异不大，在其他的近缘种中虽然存在抗裂角特性，但通过远缘杂交很难除去不良农艺性状的影响。虽然目前在拟南芥中已有许多与角果发育和开裂有关的基因被克隆，利用这些基因来抑制油菜角果开裂和防止种子损失已经成为可能，但有关基因转化的结果是导致角果成筒状结构，致使角果完全不能开裂，造成脱粒十分困难。因此，对甘蓝型油菜抗裂角资源的发掘以及对抗裂角性状主效基因位点的开发，有助于我们未来培育适用的抗裂角优异甘蓝型油菜品种。

大多数重要的农艺性状均表现数量性状的遗传特点，如产量性状、含油量、成熟期、品质、抗旱性等。数量性状易受环境条件的影响，因此选择效果不好。传统育种方法周期长，主要是由数量性状造成的。由于分子标记技术的发展，人们已可将复杂的数量性状进行分解，像研究质量性状基因一样对控制数量性状的多个基因进行研究。数量性状基因座（quantitative trait locus，简称QTL）是在高密度的遗传图谱基础上，通过一定实验设计，获得分子标记，借助Mapmaker软件分析确定控制某一性状的基因在染色体上的位置。当目标性状由少数几个基因控制时用标记选择，对发掘遗传潜力非常有效。

本研究通过遗传分析及QTL定位，旨在筛选出对油菜抗裂角具有正向效应的QTL，用于油菜抗裂角的分子标记辅助选择、分子育种及抗裂角基因的克隆。

发明内容

本发明目的是在于提供了一个油菜抗裂角性状的主效基因位点的分子标记BrSF0007-39，该分子标记不仅有助于辅助筛选抗裂角材料，同时也有助于深入了解中双11号高抗裂角性状构成的分子机理，为今后主效QTL的精细定位及克隆奠定基础。

本发明的另一个目的在于一个油菜抗裂角性状的主效基因位点的分子标记的引物，对今后中双11号及其及其衍生品系的抗裂角性状育种提供了极大的便利。

本发明还有一个目的是提供了一个油菜抗裂角性状的主效基因位点的分子标记在油菜产量育种中的应用。分子标记筛选主要优点就是可以在苗期筛选，大大节约成本和筛选工作量。常规筛选方法需要等到油菜完全成熟以后才能选择，不能在苗期淘汰掉绝大部分不抗裂角的材料，进而可以快速筛选出高抗裂角株系用于油菜抗裂角育种。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种油菜抗裂角性状主效基因位点的分子标记，其筛选步骤是：

a)利用在抗裂角指数上有极显著差异的油菜品种中双11（抗裂角指数为0.83）和73290（抗裂角指数为0.48）杂交，杂种F1代自交产生F2和F2:3代分离群体；

b)采用CTAB法提取亲本中双11和73290及F2分离群体的叶片总DNA，过程中所用到的试剂包括提取液（1.4M NaCl，100mM Tris,pH8.0，20mM EDTA,pH8.0，2%CTAB）、氯仿、异戊醇、无水乙醇；

c)合成油菜SSR引物，并对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物；

d)利用多态性引物对F2代分离群体进行基因型分析和遗传图谱的构建，结合其抗裂角指数的性状数据进行QTL定位，检测到油菜第9染色体具有一个QTL位点Psr.A9（见表2），与其性状紧密连锁的SSR标记为BrSF0007-39，该标记位于QTL位点Psr.A9的置信区间内，在中双11号中可扩增出大小为204bp和228bp的两条带，在73290中只能扩出大小为228bp和260bp的两条带（图4），引物序列为BrSF0007-39-F：5’-ACCAAACCAAACCAAACCAA-3’，BrSF0007-39-R：5’-CGATCTTTTGGTGGAAGGAA-3’；Joinmap3.0作图软件用于对所获得的多态性标记位点进行连锁分析，WinQTL cart2.5软件用于QTL分析。

本研究用到的两个亲本材料抗裂角指数相差接近一倍，均由中国农业科学院油料作物研究所油菜生物技术育种课题组科技人员在王汉中研究员带领下育成。中双11号及73290来源详见遗传资源来源披露登记表。油菜两亲本、后代分离群体单株抗裂角指数的测定参照文献（文雁成，甘蓝型油菜抗裂角品种的筛选与分析，作物学报，2008，1）中的随机碰撞法完成，植物叶片总DNA的提取、PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳均为常用的分子生物学技术，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989），和Draper等人，Blackwell，科学出版社，1988中的条件进行。实验过程中涉及的所有试剂[包括CTAB提取液（0.2M Tris－Cl，0.25M NaCl，25mM EDTA，0.5%（质量比）SDS，pH7.5，Taq酶，dNTP，丙烯酰胺，尿素，冰醋酸，AgNO₃，氯仿，异戊醇，RNA酶和无水乙醇]均可从商业途径获得，并按照实验手册中的条件或所用试剂制造厂商所建议的条件使用。

利用上述技术措施，申请人最终获得了一种油菜抗裂角性状主效基因位点的分子标记，具体如下：该标记位于QTL位点Psr.A9的置信区间内，其引物序列为BrSF0007-39-F：5’-ACCAAACCAAACCAAACCAA-3’，BrSF0007-39-R：5’-CGATCTTTTGGTGGAAGGAA-3’。Psr.A9，该主效基因位点位于油菜第9染色体，和分子标记BrSF0007-39紧密连锁，利用QTLCart2.5软件分析测得其对油菜抗裂角性状的贡献率为32.7%,加性效应为0.87，显性效应为0.97，属于完全显性遗传。

一种抗裂角主效基因位点Psr.A9的分子标记BrSF0007-39在油菜产量育种中的应用：

利用Psr.A9位点的分子标记BrSF0007-39对两亲本的F3代进行基因型鉴定，并在收获后进行抗裂角性状的考种。结果表明，通过分子标记辅助选择得到的植株抗裂角指数超过F2:3家系均值（抗裂角指数0.655）的占85.7%，在保留下来的植株再筛选高油、高产的株系。常规筛选方法需要等到油菜完全成熟以后才能选择，不能在苗期淘汰掉绝大部分不抗裂角的材料，通过鉴定上述抗裂角主效基因位点来预测油菜抗裂角性，可迅速提高油菜高抗裂角、高产品种筛选的效率，加快育种进程。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明首次定位了油菜品种中双11控制抗裂角性状的主效基因位点，它对油菜抗裂角性状的贡献率为32.7%，使得油菜抗裂角主效基因位点的定位工作居于同领域世界前列，基于此位点筛选连锁分子标记对目标性状判断的准确性大大提高。

2、在常规育种方法中，抗裂角性状鉴定要等到成熟期收获后考种，受环境影响较大而且费时费力。因此，选择效率低且成本高。通过检测抗裂角性状主效QTL位点，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。

3、本发明中抗裂角主效基因位点位置明确，主效基因位点的检测方法方便快速，不受环境影响。通过检测与抗裂角性状相关的分子标记，即可以预测抗裂角指数的高低，进而可以快速筛选高抗裂角株系，辅助育种选择目标明确，节约成本。

附图说明

图1为一种中双11×73290组合F2和F2:3群体在武汉种植时的抗裂角指数分布图。

结果表明抗裂角表型呈连续性分布，证明抗裂角属于数量性状。

图2为一种A9连锁群标记示意图。

右半部分指示该连锁群上的标记名称，左半部分指示每个标记对应的遗传图距。

图3为一种位于第9连锁群上的抗裂角主效基因位点LOD曲线示意图。

图中横坐标代表连锁群，纵坐标代表LOD值。

图4为一种利用分子标记BrSF0007-39对F3单株进行基因型分析和筛选示意图。

图中1-39为F3单株编号，最后两个P1和P2分别代表亲本中双11和73290。

具体实施方式

实施例1.油菜抗裂角分离群体的构建及性状测定

本实施例中使用的群体为油菜高抗裂角和不抗裂角亲本（中双11：抗裂角指数0.83；73290：抗裂角指数0.48）杂交后代－F2和F2:3群体。亲本、F2和F2:3群体的抗裂角表型在成熟期收获后经考种鉴定。F2和F2:3分离群体抗裂角指数结果表明：两群体抗裂角指数均呈连续分布，但变异分布不呈典型正态分布，证明抗裂角性状属于数量性状且存在主效基因位点（图1）。

实施例2.亲本、F2和F2:3分离群体叶片总DNA的提取

利用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下：

A．取0.1克油菜叶片鲜样放入研磨，加700微升提取液研磨，随即装入1.5毫升离心管中置于65°C恒温水浴60分钟，其间混合2-3次；

B．加等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1，V／V／V），轻轻颠倒使其充分混匀；12000rpm离心10分钟使其分层，轻轻吸取上清液转入另一1.5毫升离心管；加等体积的氯仿：异戊醇（24：1，V／V）重新抽提一次；

C．加入1毫升的-20°C预冷无水乙醇，置于-20°C冷冻不超过30分钟让DNA析出；12000rpm离心10分钟，倒掉离心管中乙醇溶液；用75%乙醇清洗2-3次；倒掉浸泡液，打开离心管盖置于通风橱内吹干；

D．干燥后加入TE（10mM Tris,pH8.0；1mM EDTA,pH8.0）溶解DNA；紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20℃冰箱中保存备用；

实施例3.引物的开发合成及多态性的筛选

我们采用的SSR引物包括两类：一类是已发表文章和芸苔属数据库中公开的引物序列（http://www.brassica.info/resource/markers/ssr-exchange.php），包括CB,CNU，niab,MR,FITO,Ol,BRMS,BRAS,Ni,Na,BN,NGA,MB,BnGMS,BrGMS,BoGMS,BnEMS,等许多系列；另一类是我们根据白菜和甘蓝测序后拼接成的scaffold序列开发的，分别命名为BrSF和BoSF系列，具体的开发方法是先利用SSRHunter软件在每个scaffold搜索SSR，然后用Primer3.0软件设计SSR引物。我们已经通过生物公司合成了公共和新开发的SSR引物共3085对，筛选结果表明，有15％引物的扩增产物在双亲间存在长度多态性差异。多态性筛选程序如下：

（1）从亲本中各随机选择10株DNA等量混合，作为筛选引物的模板。

（2）PCR反应体系：

（3）PCR反应程序：

（3）凝胶电泳

试剂配制：

（1)5×TBE

（2）6%变性PAGE的配制

（3）6%变性聚丙烯酰胺凝胶

（4）粘剂

无水乙醇          500毫升

冰醋酸            5毫升

反硅化剂(Me-T)    5毫升

（5）不粘剂

无水乙醇          500毫升

硅化剂(Dichlordiemthylsilan)14毫升

（6)50×上样缓冲液

甲酰胺        100毫升

二甲苯箐      1.25克

溴酚蓝        1.25克

1×上样缓冲液（用于加到扩增产物中）：2毫升的50×上样缓冲液加上2毫升的0.5摩尔／升的EDTA，再用甲酰胺稀释到100毫升。

（7）固定液

冰醋酸150毫升，用纯水稀释到1.5升

（8）染色液

硝酸银          1.5克

甲醛            2.0毫升

用纯水稀释到    1.5升。

（9）显影液

凝胶制备：

（1）玻璃板用10%（质量比）NaOH溶液浸泡24小时，洗净，凉干。粘板和不粘板分别用滤纸均匀涂抹粘剂和不粘剂。把封条齐平的放在粘板边缘，然后将不粘板放在粘板上面，并在靠近玻璃板底部三分之一处夹上两个卡夹以起到固定的作用。

（2）在烧杯中倒入50毫升变性聚丙烯酰胺，再分别加入350微升过硫酸胺（10%）和25微升TEMED，快速搅拌均匀；

（3）将配制好的凝胶溶液到入注射器中，沿点样口缓缓注入，凝胶注入后，在凝胶顶面插上有齿的梳子（背部插入），在离灌胶口三分之一的玻璃板两侧对称处分别夹上卡夹固定，以保证凝胶聚合后玻璃板、封条以及梳子间紧密接触。

电泳：

（4）移去卡夹和梳子，将玻璃板擦净后固定在电泳槽上，上下槽各加500毫升0.5×TBE缓冲液，接通电源1500伏60瓦预热30分钟。在PCR产物中加入等体积的1×上样缓冲液，95℃变性5分钟，冰浴冷却，上样2.5微升，2000伏60瓦电泳。当二甲苯青达到可视面最底端时即可停止电泳。

染色和显影：

（1）取出粘板面向上放入固定液盆中固定30分钟左右至胶板无色，在蒸馏水盆中漂洗两次，每次2-3分钟。

（2）取出粘板面向上放入染色液盆中染色30分钟。取出粘板，在蒸馏水盆中漂洗10秒钟。

（3）取出粘板面向上放入预冷（4℃）的显影液盆中，轻轻摇动至条带清晰可见。

（4）取出粘板面向上放入固定液盆中，以终止显影。在蒸馏水盆中漂洗3分钟，室温（20－25℃以下相同）下自然凉干，拍照保存。

实施例4.多态性引物在F2群体中的分布及连锁性分析

挑选出在两个亲本中显示出的引物对F2分离群体184个单株进行分子标记基因型分析，获得分子标记基因型数据。利用Joinmap3.0软件对F2群体的分子标记基因型数据进行连锁分析以构建分子标记遗传连锁图谱，获得19个连锁群（含772个分子标记），恰好对应甘蓝型油菜的19条染色体（图2）。基于该遗传图谱、F2群体的基因型数据以及两群体的抗裂角性状数据，利用QTLCart2.5软件进行QTL定位，在A9染色体SSR标记BrSF0007-39附近（表1）检测到了一个重复性很好的主效QTL位点（图3），其LOD值和贡献率都较大（表2）。

表1A9连锁群抗裂角主效QTL连锁标记BrSF0007-39的引物序列

表2A9连锁群抗裂角主效QTL的基本信息

实施例5.分子标记BrSF0007-39在高抗裂角育种中的应用

利用分子标记BrSF0007-39在苗期对中双11号高油品系和高产品系的F3代进行分子鉴定。具体步骤与上述统计多态性引物在F2群体中的分布过程类似，包括F2分离群体叶片总DNA的提取（见实施例2）、聚丙烯酰胺凝胶电泳及分布统计（实施例3和4）等。

利用BrSF0007-39引物对F3不同单株以及两亲本进行基因型分析，仅保留携带有利标记的单株。考种结果表明，分子标记辅助选择挑选出来的单株，其抗裂角指数超过F2:3家系均值(0.655)的占85.7％（表3）。可见在苗期进行淘汰，不仅大大减少生产成本而且节省筛选时间。分子标记筛选主要优点就是可以在苗期筛选，大大节约成本和筛选工作量。常规筛选方法需要等到油菜完全成熟以后才能选择，不能在苗期淘汰掉绝大部分不抗裂角的材料，进而可以快速筛选出高抗裂角株系用于油菜抗裂角育种。

表3利用SSR标记BrSF0007-39辅助选择得到的F3单株的抗裂角考种数据

注：P1和P2分别代表亲本中双11和73290。A、B、H分别代表来源于P1、P2和杂合的分子标记带型。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国农业科学院油料作物研究所

 

<120>  油菜抗裂角性状主效基因位点分子标记及应用

 

<130>  油菜抗裂角性状主效基因位点分子标记及应用

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  甘蓝型油菜

 

<400>  1

accaaaccaa accaaaccaa                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  CGATCTTTTGGTGGAAGGAA

 

<400>  2

cgatcttttg gtggaaggaa                                                 20

 

 

Claims (4)

1.一种油菜抗裂角性状主效基因位点的分子标记，其筛选步骤是：

a)利用在抗裂角指数上有极显著差异的油菜品种中双11和73290杂交，杂种F1代自交产生F2和F2:3代分离群体； 

b)采用CTAB法提取亲本中双11和73290及F2分离群体的叶片总DNA；

c)合成油菜SSR引物，并对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物；

d)利用多态性引物对F2代分离群体进行基因型分析和遗传图谱的构建，结合其抗裂角指数的性状数据进行QTL定位，检测到油菜第9染色体具有一个QTL位点Psr.A9，与其性状紧密连锁的SSR标记为BrSF0007-39，该标记位于QTL位点Psr.A9的置信区间内，在中双11号中扩增出大小为204 bp 和228 bp的两条带，引物序列为BrSF0007-39-F：5’-ACCAAACCAAACCAAACCAA-3’，即SEQ ID NO:1，BrSF0007-39-R：5’-CGATCTTTTGGTGGAAGGAA-3’，即SEQ ID NO:2。

2.根据权利要求1所述的油菜抗裂角性状主效基因位点的分子标记，其特征在于：所述的QTL位点Psr.A9位于油菜第9染色体，对油菜抗裂角性状的贡献率为32.7%,加性效应为0.87，显性效应为0.97，属于完全显性遗传。

3.权利要求1所述的一种油菜抗裂角性状主效基因位点的SSR分子标记，其特征在于：分子标记的引物序列为BrSF0007-39-F：5’-ACCAAACCAAACCAAACCAA-3’，BrSF0007-39-R：5’-CGATCTTTTGGTGGAAGGAA-3’。

4.权利要求1或2所述分子标记在油菜高抗裂角育种中的应用。

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