CN105063020A - 一种利用油菜cms系根组织提取线粒体dna的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用油菜CMS系根组织提取线粒体DNA的方法，以油菜CMS系的苗期至蕾苔期的幼嫩根部组织为材料，通过对根部组织进行前处理和预处理，然后对油菜根部组织进行匀浆和过滤，接着采用差速离心法提取线粒体，再结合蔗糖衬垫法纯化线粒体，最后采用裂解法进一步提取mtDNA。本发明提取的mtDNA含量高，纯度高，质量好；操作简单，减轻了工作量，节约了时间，降低了实验成本，提高了提取效率。本发明不仅适用于油菜CMS系mtDNA的提取，也适用于油菜其它不育系mtDNA的提取，以及适用于除油菜不育系之外的一般油菜材料mtDNA的提取，具有广泛的应用前景。

Description

一种利用油菜CMS系根组织提取线粒体DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种提取油菜mtDNA的新方法，具体涉及一种利用油菜CMS系根组织提取线粒体DNA(mtDNA)的方法。

背景技术

细胞质雄性不育(CMS)是植物界普遍存在的现象。近年来，CMS作为作物杂种优势利用的重要途径，已受到国内外育种者们的广泛关注。一般研究认为，植物CMS的发生与线粒体密切相关，控制CMS的基因存在于线粒体DNA(mtDNA)上，而且mtDNA上控制CMS的基因有多个。进一步研究表明，mtDNA的基因突变或基因重组与CMS有直接关系，是形成CMS的主要原因。

在油菜育种实践中，CMS是油菜杂种优势利用最重要的途径，是提高油菜产量的主要手段。迄今为止，越来越多的证据已经表明mtDNA及其表达产物与油菜CMS直接相关(袁美等，2002)。由此可见，要从分子水平深入研究油菜CMS的不育机理，就必然涉及mtDNA的提取问题。另外，采用分子生物学方法鉴定油菜CMS的异同性也同样会涉及到mtDNA的提取问题。因此，mtDNA的提取是进行CMS分子机理研究的前提和基础，高效可靠的提取方法是提取mtDNA的重要保证。

目前，在油菜CMS的研究中，传统方法提取mtDNA所用的材料一般来源于绿色叶片或者黄化苗。然而，利用油菜的黄化苗或者绿色叶片提取mtDNA还存在一定的不足之处。一方面，在利用黄化苗mtDNA提取法提取油菜mtDNA时：(1)种子发芽缓慢，要培养获得无菌的黄化苗比较费工费时；(2)黄化苗长势弱小、细胞水分含量高、干物质积累少，故要获得足够量的mtDNA就需要耗费大量的不育系种子，也要消耗较多的人力和物力，而且在收获不育系种子时也容易造成混杂现象，以致影响到后续mtDNA提取的质量和纯度；(3)黄化苗也极易见光而出现返绿现象。另一方面，在采用叶片mtDNA提取法提取油菜mtDNA时：(1)绿色叶片组织中一般含有大量的叶绿体、多糖、酚类等成分，分离提取mtDNA时极易发生这些杂质成分的污染，特别是来自叶绿体DNA(cpDNA)的污染，会直接影响mtDNA提取的质量，所提取的mtDNA的得率和纯度常常达不到实验的要求；(2)为了获得较高质量和纯度的mtDNA，还需要通过采用超高速离心机结合密度梯度离心等繁琐步骤来减少叶绿体及其cpDNA等杂质成分的干扰，使提取过程复杂化，而且采用超高速离心机也使提取成本增加。

综上，探索一种有效解决黄化苗mtDNA提取法和叶片mtDNA提取法的不足之处，降低实验成本，提取的mtDNA得率高、纯度高，能够较好地满足后续分子生物学研究需要的提取mtDNA的方法，对深入研究油菜CMS系的分子机理以及培育高产或超高产杂交油菜新品种具有重要的意义。而关于采用油菜根部组织提取mtDNA的方法，国内外至今未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种利用油菜CMS系根组织提取mtDNA的方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种利用油菜CMS系根组织提取mtDNA的方法，包括以下步骤：

(1)油菜根部组织的前处理和预处理：以油菜CMS系的幼嫩根部组织为材料，先清除根部表面附着的土壤颗粒和杂质，用自来水冲洗干净根部，再用蒸馏水漂洗1～3次，然后室温下，将根部进行黑暗预处理48～72h；

(2)油菜根部组织的匀浆和过滤：将处理后的幼根剪成1～2cm的小段，放入预冷的匀浆杯中，然后加入5mL/gFW预冷的提取缓冲液A，匀浆至根细碎；接着将匀浆液用2～4层灭菌纱布过滤，再用1～3层180～230目滤网过滤；

(3)油菜根部组织线粒体的提取与纯化：先采用差速离心法粗提线粒体，然后采用蔗糖衬垫法纯化线粒体，最后采用裂解法精提取线粒体DNA。

进一步，步骤(1)中，所述油菜CMS系幼嫩根部组织材料选自田间油菜CMS系的苗期至蕾苔期的新鲜幼嫩的根部组织。

进一步，步骤(2)中，所述缓冲液A是由Tris-HCl10mmol/L，蔗糖500mmol/L，EDTA2mmol/L，BSA0.2％，β-巯基乙醇0.1％；调pH至7.5制成。

进一步，步骤(3)中，所述差速离心法粗提线粒体是指将经过匀浆和过滤得到的滤液先在1000×g离心10min，取上清液；再以17000×g离心10min，弃上清液；沉淀中加入缓冲液A并悬浮；再以1000×g离心10min，取上清液，得到线粒体粗提液；

所述蔗糖衬垫法纯化线粒体是先在一离心管中加入2mL/gFW的提取缓冲液B，再吸取线粒体粗提液铺于缓冲液B上，然后17000×g离心10min，弃上清液，所得沉淀用缓冲液A悬浮，得到悬浮液；在另一离心管中先加入0.2mL/gFW的缓冲液B，再将悬浮液铺于缓冲液B上，然后17000×g离心15min，所得沉淀即为纯化的线粒体；

所述裂解法提取线粒体DNA是在纯化后的线粒体沉淀中加入0.1mL/gFW的裂解液，悬浮并混匀沉淀，再加入10mg/mL蛋白酶K和10％的SDS，使二者的最终浓度分别为10μg/gFW和2％，然后将线粒体在37℃下裂解4h；接着向裂解液中加入等体积的酚-氯仿/异戊醇，其中氯仿/异戊醇体积比为24:1，混匀，静置5min；在4℃下11000×g离心10min，吸出上清，再用酚-氯仿/异戊醇抽提2次，吸取上清，加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，混匀，在-20℃下放置2h；在4℃下11000×g离心15min，回收DNA沉淀，用70％乙醇洗沉淀2次，吹干，即得线粒体DNA；

所述缓冲液A是由Tris-HCl10mmol/L，蔗糖500mmol/L，EDTA2mmol/L，BSA0.2％，β-巯基乙醇0.1％；调pH至7.5制成；

所述缓冲液B是由Tris-HCl10mmol/L，蔗糖600mmol/L；调pH至7.5制成；

所述裂解液是由Tris-HCl50mmol/L，EDTA20mmol/L；调pH至8.0制成。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)本发明采用油菜的根组织作为提取mtDNA的材料，油菜的根系为直根系，其主根发达粗壮，侧根丰富，而且由于根系生长在土壤中，细胞结构致密，因此干物质得率高，提取的mtDNA含量高、质量好。而且在取材时，通过对油菜植株地上部分(特别是叶片)的形态学观察，可以及时剔除来源于混杂种子的油菜杂株，保证实验材料的纯度和可靠性，避免了油菜收获季节种子易出现混杂致使其纯度难以得到保证的弊端。

(2)相对于黄化苗mtDNA提取法而言，本发明避免了制备大量不育系种子和黄化苗的环节，减轻了工作量，节约了时间。

(3)相对于叶片mtDNA提取法而言，本发明避免了叶绿体等杂质成分对线粒体提取的干扰以及叶绿体DNA(cpDNA)对mtDNA提取的干扰，提高了mtDNA纯度。

(4)本发明不需要超高速离心机和密度梯度离心条件，操作简单，降低了实验成本，提高了提取效率。

(5)本发明不仅适用于油菜细胞质雄性不育(CMS)，也适用于细胞核雄性不育(GMS)、生态雄性不育(EMS)、化杀雄性不育(CHA)等油菜不育系mtDNA的提取，以及适用于除油菜不育系之外的其它一般油菜材料mtDNA的提取。

实验证明，在同等条件下，本发明所提取的包括2个油菜CMS系和2个油菜保持系的mtDNA，其含量为叶片mtDNA提取法和黄化苗mtDNA提取法所提取mtDNA含量的2～5倍，而且所提取的mtDNA纯度高，琼脂糖凝胶电泳检测mtDNA条带清晰，PCR扩增条带的重复性和稳定性好，完全可以满足后续mtDNA分子生物学研究的需要。由此可见，本发明是一种行之有效的提取mtDNA的方法途径，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明技术路线结构图。

图2为陕2ACMS幼根所提取线粒体的镜检观察图。

图3为油菜根mtDNA的电泳检测图。其中M:Marker(DL15000)；1:PolimaCMS(10×)；2:PolimaCMS(1×)；3:陕2ACMS(10×)；4:陕2ACMS(10×)；5:PolB(10×)；6:PolB(20×)；7:陕2B(10×)；8:陕2B(20×)。

图4为油菜mtDNA基因S46795和D13698的PCR扩增结果图。其中M:marker(DL2000)；1,5:PolimaCMS；2,6:陕2ACMS；3,7:PolB；4,8:陕2B；1-4:D13698的PCR结果；5-8:S46795的PCR结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进一步加以说明。

实施例1

关于两个经典实用的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系(陕2ACMS，PolimaCMS)及其保持系(陕2B，PolB)根组织mtDNA的提取。

1、所用油菜材料

甘蓝型油菜(Brassicanapus)细胞质雄性不育系陕2ACMS和PolimaCMS，及其相应保持系陕2B和PolB，各材料的种植和田间管理按常规方法进行，取苗期至蕾苔期的幼嫩根部组织进行mtDNA的提取。

2、提取方法

(1)油菜根部组织的取样和处理：从田间采集新鲜的油菜幼苗，剪取根端部分，清理掉根部表面附着的土壤颗粒和杂质，自来水冲洗干净，再用蒸馏水漂洗2次，室温下暗处理48～72h，称取幼根组织100g备用。

(2)油菜根部组织的匀浆和过滤：将幼根剪成约1～2cm的小段，放入预冷的匀浆杯中，然后加入5mL/gFW预冷的提取缓冲液A，匀浆至根细碎；匀浆液先用3层灭菌纱布过滤，再用2层200目滤网过滤。

(3)油菜根部组织线粒体的粗提与纯化：经过匀浆和过滤得到的滤液采用差速离心法粗提线粒体，即将得到的滤液分装于50mL的离心管，1000×g离心10min；取上清，17000×g离心10min；弃上清，沉淀中加入0.1mL/gFW的缓冲液A[Tris-HCl10mmol/L，蔗糖500mmol/L，EDTA2mmol/L，BSA0.2％，β-巯基乙醇0.1％；pH7.5]，轻轻悬浮后，悬浮液再以1000×g离心10min；取上清，加入DNaseⅠ(5mg/mL)及MgCl₂(1mol/L)，使二者的最终浓度分别为10μg/gFW和10mmol/L，在4℃下反应2h；加入EDTA至100mmol/L，以终止DNaseⅠ反应，即可得到线粒体粗提液。然后再采用蔗糖衬垫法纯化线粒体，即先在备用离心管中加入2mL/gFW的提取缓冲液B[Tris-HCl10mmol/L，蔗糖600mmol/L；pH7.5]，再吸取线粒体粗提液小心缓慢地铺于缓冲液B上，然后17000×g离心10min；弃上清，所得沉淀用0.1mL/gFW的缓冲液A轻轻悬浮，在另一备用离心管中先加入0.2mL/gFW的缓冲液B，再将悬浮液小心缓慢地铺于缓冲液B上，然后17000×g离心15min，所得的沉淀即为纯化的线粒体。

(4)线粒体的染色和镜检：采用詹纳斯绿B(JanusGreenB)染色法，是指采用线粒体的专一性活体染色剂詹纳斯绿B(JanusGreenB)对提取并经纯化后的油菜线粒体进行染色和镜检观察。即在载玻片上滴一小滴用提取缓冲液B制备的线粒体悬液，再加入詹纳斯绿B液一滴，染色15min左右，盖上盖玻片，用滤纸吸掉周围液体，再进行镜检观察和照相。经过染色的线粒体一般呈现为蓝绿色颗粒状，而其周围介质则为无色。

(5)mtDNA的提取与纯化：在纯化的线粒体沉淀中加入0.1mL/gFW裂解液[Tris-HCl50mmol/L，EDTA20mmol/L；pH8.0]，轻轻悬浮并混匀沉淀，再加入蛋白酶K(10mg/mL)和10％的SDS(用裂解液配制)，使二者的最终浓度分别为10μg/gFW和2％，线粒体在37℃下裂解4h，向裂解液中加入等体积的酚-氯仿/异戊醇(V/V＝24:1)，轻轻混匀，静置5min，在4℃下11000×g离心10min，吸出上清，再用酚-氯仿/异戊醇抽提2次，吸取上清，加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，在-20℃下放置2h。在4℃下11000×g离心15min，回收DNA沉淀，用70％乙醇洗沉淀2次，在净化工作台上吹干，-40℃存放备用。

3、mtDNA的含量测定和纯度检测

(1)mtDNA含量的测定：将备用的mtDNA沉淀用200μL无菌ddH₂O溶解，取原液2μL，加入ddH₂O198μL(稀释100倍)，用NANODROP1000核酸蛋白质检测仪测定mtDNA的含量，记录浓度、OD260/280以及OD260/230等数据。

(2)mtDNA电泳检测：采用0.8％(W/V)的琼脂糖凝胶，0.5×TBE电泳缓冲液，85V稳压。样品按原液或稀释液点样电泳，每样品均点样两个泳道，点样量为每泳道5或10μL，采用DL15000DNAMarker，点样量为5μL，电泳完毕后，EB(0.5μg/mL)液中染色，利用凝胶成像系统观察和照相。

4、油菜mtDNA的再纯化：根据油菜mtDNA含量测定结果，可针对性地对根mtDNA制品进一步进行纯化处理。可再次向溶解的mtDNA中加入酚:氯仿:异戊醇(25:24:l,v/v)，按上述mtDNA的纯化方法，取上层液进行重复抽提，还可以根据需要加入RNA酶进行处理等。

5、油菜线粒体基因的PCR扩增：根据GenBank等数据库报道的油菜mtDNA的特异基因序列，利用引物设计软件设计mtDNA特异性引物，以所提取的油菜材料mtDNA为模板，进行线粒体有关基因的特异性扩增。

PCR扩增体系30μL，其中含有10×PCRBuffer(含Mg²⁺20.0mmol/L)3.0μL，特异性引物(10μmol/L)各2.0μL，dNTPs(10.0mmol/L)0.75μL，TaqDNA聚合酶(2.0U/μL)1.0μL，模板mtDNA(120ng)，加ddH₂O补足为30μL。

PCR反应程序为：94.0℃预变性5min后，开始35个温度循环的扩增反应，循环的参数为94.0℃，60s；55.0℃，60s；72.0℃，60s，然后72.0℃延伸10min结束反应，PCR产物在4℃下存放至电泳分析。

采用1.2％的琼脂糖凝胶，1×TAE电泳缓冲液，95V稳压进行电泳，扩增产物和Marker点样量均为每泳道5μL，DNAmarker采用DL2000。电泳完毕后，EB液中染色，利用凝胶成像系统检测和照像。

根据GenBank报道的油菜mtDNA的两个特异基因S46795(atp6)和D13698(orf474andorf159)的序列，利用PrimerPremier5.0软件分别设计1对特异性引物：

基于S46795(atp6)基因的引物：

AW52198:5′-GATTTATAGCATCATTCAAGTAAATACAG-3′；

AW52199:5′-GAATCAAATAGGGCTGGTGG-3′。

基于D13698(orf474andorf159)基因的引物：

AW52188:5′-GCTCTAGACATCCACCCATGGTACAGAG-3′；

AW52189:5′-CGGAGCTCCCCGGCAGTCAACCAAGAAAG-3′。

6、提取结果

(1)油菜线粒体的镜检观察：在显微镜下对提取并纯化的油菜陕2ACMS的线粒体进行观察发现，经过染色的线粒体一般呈现为蓝绿色颗粒状，其周围介质则为无色，其它杂质也很少，见图2。由图2可知，本实施例获得了较纯净的线粒体沉淀。其它三个材料根组织所提取线粒体的镜检结果与其相一致。

(2)油菜mtDNA的含量测定：经用核酸蛋白质含量检测仪测定，油菜幼根所提取的mtDNA的含量如表1所示。由表1可知，四个材料的幼根mtDNA含量为10～23ng/μL,则其原液浓度为1000～2300ng/μL，各原液浓度平均为1625ng/μL。因此，幼根mtDNA的得率平均为3250ng/gFW。样品OD260/280的值较好地介于1.8～2.0之间，说明所提取的幼根mtDNA纯度较高；样品OD260/230的值小于2.0,说明仍然还存在一定程度多糖的污染。根据以上油菜mtDNA含量测定结果，为了解决糖类等物质的污染，对各材料根mtDNA可进行进一步的纯化处理，以降低糖类物质的污染程度。

表1-油菜根mtDNA含量的测定

材料	称重/g	mtDNA浓度/ng.μL-1	OD260/280	OD260/230
					Polima CMS	100.0	14	1.80	1.55
PolB	100.0	10	1.98	1.54
					陕2A CMS	100.0	23	1.89	2.05
陕2B	100.0	18	1.97	1.98

(3)油菜mtDNA的琼脂糖凝胶电泳检测：所提取油菜根组织mtDNA的电泳检测结果如图3所示。由于油菜根组织mtDNA经检测含量高，故采用原液稀释10倍(10×)、20倍(20×)的稀释液点样，四个材料根mtDNA的点样量均为5μL。由图3可知，油菜根组织所提取的mtDNA电泳条带清晰，无明显的降解现象发生，这与mtDNA含量测定的结果是相一致的。采用本实施例提取的mtDNA片段大于15000bp。

(4)油菜线粒体基因的PCR扩增：分别以油菜PolimaCMS及其保持系PolB、陕2ACMS及其保持系陕2B共四个材料所提取的mtDNA为模板，进行线粒体基因PCR扩增的结果如图4所示。可见，以根组织mtDNA作为模板时，基于两个基因的引物在四个油菜材料中分别扩增到稳定一致的目的条带，而且重复性好。因此，PCR扩增的结果也表明用油菜根组织提取mtDNA是一条切实可行的途径。

Claims (4)

1.一种利用油菜CMS系根组织提取线粒体DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)油菜根部组织的前处理和预处理：以油菜CMS系的幼嫩根部组织为材料，先清除根部表面附着的土壤颗粒和杂质，用自来水冲洗干净根部，再用蒸馏水漂洗1～3次，然后室温下，将根部进行黑暗预处理48～72h；

(2)油菜根部组织的匀浆和过滤：将处理后的幼根剪成1～2cm的小段，放入预冷的匀浆杯中，然后加入5mL/gFW预冷的提取缓冲液A，匀浆至根细碎；接着将匀浆液用2～4层灭菌纱布过滤，再用1～3层180～230目滤网过滤；

(3)油菜根部组织线粒体的提取与纯化：先采用差速离心法粗提线粒体，然后采用蔗糖衬垫法纯化线粒体，最后采用裂解法提取线粒体DNA。

2.根据权利要求1所述的利用油菜CMS系根组织提取线粒体DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述油菜CMS系幼嫩根部组织材料选自田间油菜CMS系的苗期至蕾苔期的新鲜幼嫩的根部组织。

3.根据权利要求1或2所述的利用油菜CMS系根组织提取线粒体DNA的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述缓冲液A是由Tris-HCl10mmol/L，蔗糖500mmol/L，EDTA2mmol/L，BSA0.2％，β-巯基乙醇0.1％；调pH至7.5制成。

4.根据权利要求1～3之一所述的利用油菜CMS系根组织提取线粒体DNA的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述差速离心法粗提线粒体是指将经过匀浆和过滤得到的滤液先在1000×g离心10min，取上清液；再以17000×g离心10min，弃上清液；沉淀中加入缓冲液A并悬浮；再以1000×g离心10min，取上清液，得到线粒体粗提液；

所述蔗糖衬垫法纯化线粒体是先在一离心管中加入2mL/gFW的提取缓冲液B，再吸取线粒体粗提液铺于缓冲液B上，然后17000×g离心10min，弃上清液，所得沉淀用缓冲液A悬浮，得到悬浮液；在另一离心管中先加入0.2mL/gFW的缓冲液B，再将悬浮液铺于缓冲液B上，然后17000×g离心15min，所得沉淀即为纯化的线粒体；

所述裂解法提取线粒体DNA是在纯化后的线粒体沉淀中加入0.1mL/gFW的裂解液，悬浮并混匀沉淀，再加入10mg/mL蛋白酶K和10％的SDS，使二者的最终浓度分别为10μg/gFW和2％，然后将线粒体在37℃下裂解4h；接着向裂解液中加入等体积的酚-氯仿/异戊醇，其中氯仿/异戊醇体积比为24:1，混匀，静置5min；在4℃下11000×g离心10min，吸出上清；再用酚-氯仿/异戊醇抽提2次，吸取上清，加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，混匀，在-20℃下放置2h；在4℃下11000×g离心15min，回收DNA沉淀，用70％乙醇洗沉淀2次，吹干，即得线粒体DNA；

所述缓冲液A是由Tris-HCl10mmol/L，蔗糖500mmol/L，EDTA2mmol/L，BSA0.2％，β-巯基乙醇0.1％；调pH至7.5制成；

所述缓冲液B是由Tris-HCl10mmol/L，蔗糖600mmol/L；调pH至7.5制成；

所述裂解液是由Tris-HCl50mmol/L，EDTA20mmol/L；调pH至8.0制成。