CN109234288A

CN109234288A - 油菜BnA9-2基因在提高油菜角果抗裂性中的应用

Info

Publication number: CN109234288A
Application number: CN201811373751.2A
Authority: CN
Inventors: 胡琼; 周日金; 汪文祥; 刘佳; 王会; 李超; 储文; 梅德圣; 成洪涛; 付丽
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2018-11-19
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2019-01-18
Anticipated expiration: 2038-11-19
Also published as: CN109234288B

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体公开了油菜BnA9‑2基因在提高油菜角果抗裂性中的应用，通过油菜转基因功能发现，证明利用该基因的抗裂角等位变异进行转育或对该基因进行突变可以显著提高油菜角果的抗裂性，同时对其它农艺性状没有明显影响，为培育适合机械化收割的抗裂角油菜品种提供了宝贵的基因资源。进一步的，申请人发现BnA9‑2基因中的抗裂角特异性序列，SEQ ID NO.5所示。针对SEQ ID NO.5所示序列设计的引物可用于油菜的抗裂角育种，具有广阔的应用前景。

Description

油菜BnA9-2基因在提高油菜角果抗裂性中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及油菜BnA9-2基因在提高油菜角果抗裂性中的应用。

背景技术

油菜是我国最重要的油料作物之一，占据国产食用植物油产量的一半以上。由于驯化周期较短，甘蓝型油菜仍有很多性状近乎野生状态，其中一个典型的性状就是角果的耐裂性(Morgen et al.,2003)。油菜的角果在成熟后裂开称为裂角，这是一种有利于自身种子散播和繁殖的自然选择性状，但是作为一种为人类提供种子产品的农作物，不受控制的裂角是不受欢迎的，驯化的方向是选择不易裂角的材料。据报道，角果开裂通常造成8％-12％的产量损失(Kadkolet al.,1984)，逆境条件下甚至达到50％(MacLeod,1981)。角果易裂不仅造成不同程度的产量损失，而且还是现阶段制约油菜机械化收割在我国大面积推广应用的重要原因。由于遗传背景狭窄，现阶段在国内外油菜种质资源中鉴定出的抗裂角油菜非常少(Kadkolet al.,1985；Colinet al.,2003；Penget al.,2011)，使得育种家通过常规育种手段改良油菜角果抗裂性难以奏效。因此发掘和创建抗裂角油菜种质资源，明确油菜裂角性遗传调控机理，进而培育适合机械化收割的油菜品种，是实现我国油菜机械化生产的关键技术支撑，对促进我国油菜产业转型升级具有重要意义。

目前人们对油菜角果裂角性这一性状的遗传调控机理所知甚少。但截至目前，尚未有控制油菜角果裂角性相关基因被克隆的报道。通过经典的突变体遗传分析研究人员已经在模式植物拟南芥中挖掘出一个调控角果离层及内果瓣enb层分化的复杂分子网络，核心组分包括FILAMENTOUS FLOWER(FIL),JAGGED(JAG),YABBY3(YAB3),REPLUMLESS(RPL),FRUITFULL(FUL),SHATTERPROOF1/2(SHP1,SHP2),INDEHISCENT(IND),ALCATRAZ(ALC)(Dinneny et al.,2005)。在这个遗传网络中，SHP1/SHP2，IND，ALC处于核心地位并共同调控果瓣边界离区的分化形成，同时也受到上游JAG，FIL，YAB3，FUL，RPL等基因的正向或负向调控。十字花科的几个物种包括芥菜、白菜、甘蓝、油菜等与拟南芥亲缘关系较近，相关遗传调控机理可能比较保守，拟南芥中的已有研究结果对这些物种很有借鉴意义。如等人在芥菜中异位表达拟南芥中的FRUITFULL基因，可以得到抗裂角材料还有研究表明在油菜中通过突变拟南芥ALC或者IND同源基因可以明显提高角果的抗裂角性(Braatz et al.,2018a,Braatz et al.,2018b)。Tao等(2017)通过分析差异表达基因在油菜中克隆了一个BnLATE基因，在拟南芥中超量表达该基因导致角果心皮、胎座框及离区木质化程度下降，角果抗裂角程度提高，推测该基因可能通过负调控角果木质化影响裂角过程，但没有提供直接的证据证明该基因在油菜中也具有类似功能。

在本发明中，申请人利用一个抗裂角品系R1和一个易裂角品系R2构建了一套近等基因系材料，对油菜A09染色体上的抗裂角相关主效QTL进行图位克隆，克隆了油菜中第一个裂角相关基因BnA9-2，该基因的抗裂角等位变异因碱基缺失造成翻译提前终止使基因功能缺失。功能验证证明在油菜中通过CRISPR-Cas9基因编辑技术(Xing et al.,2014)对该基因进行突变可以显著提高转基因株系角果的抗裂性。该基因及其等位变异的鉴定为通过基因编辑技术和常规杂交转育技术快速改良现有油菜品种的抗裂角性提供了技术支撑，具有重要应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供了油菜BnA9-2基因在提高油菜角果抗裂性中的应用。通过油菜转基因功能发现，证明利用该基因的抗裂角等位变异进行转育或对该基因进行突变可以显著提高油菜角果的抗裂性。

本发明的另一个目的在于提供了油菜BnA9-2基因的特异性分子标记，利用该分子标记设计的引物可实现油菜抗裂角育种。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

油菜BnA9-2基因在提高油菜角果抗裂性中的应用，包括利用本领域的常规方式，对油菜SEQ ID NO.2所示序列进行基因突变，或是将SEQ ID NO.1所示基因转育至裂角油菜中，可显著提高油菜角果的抗裂性。

本发明的保护范围还包括油菜BnA9-2基因中的抗裂角特异性序列，所述的序列为SEQ ID NO.5所示。

本发明的保护范围还包括针对SEQ ID NO.5所示序列设计的分子标记引物在油菜育种中的应用。

以上所述的应用，所述的分子标记引物为：A9-2-F:AAACTGTAAACAGCAGCCCG、A9-2-R:GTCATTCCAGACATCCATCT和A9-2-Indel-R:TGAAAAGTCTACAGCAGGTG。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次公开了油菜BnA9-2基因在调控角果抗裂角性的功能中的应用。利用油菜为受体的转基因结果证明，突变BnA9-2基因明显增强了转基因油菜角果的抗裂性。因此本发明提出在油菜中利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对该基因进行突变可以提高油菜的抗裂角性，而不影响其它经济性状，从而用于创建新的抗裂角油菜种质资源和油菜抗裂角育种。

附图说明

图1为构建BnA9-2基因CRISPR-Cas9基因编辑载体gRNA expression cassettePCR扩增结果；

其中第2泳道为Trans 2k Plus DNA Marker。

图2为BnA9-2基因CRISPR-Cas9基因编辑载体连接转化后单克隆检测结果；

其中，第1至23泳道为不同单克隆，第24泳道为空白对照，第25泳道为Trans 2kPlus DNA Marker。

图3为BnA9-2基因CRISPR-Cas9基因编辑T1代转基因材料阳性检测示意图；

其中，第1至23泳道为不同T1代单株，第24泳道为空白对照，第25泳道为Trans 2kPlus DNA Marker。

图4为BnA9-2基因CRISPR-Cas9基因编辑T1代转基因材料目标靶点突变检测示意图；

其中，WT代表野生型材料，M1-1，2，3为T1代3个纯和突变株系。

图5为BnA9-2基因CRISPR-Cas9基因编辑T1代转基因材料抗裂角指数鉴定结果示意图。

图6为R1和R2中BnaA9-2基因结构示意图；

其中方框代表外显子，横线代表内含子，“-”代表R1中BnaA9-2基因存在1处单碱基缺失，倒三角形代表R1中BnaA9-2基因的一段插入序列。

图7为BnaA9-2基因特异性分子标记检测示意图；

图中从左至右第1泳道为R2易裂角基因型，第2泳道为R1抗裂角基因型，第3泳道为空白对照，第4泳道为Trans 2k Plus DNA Marker；

图8为利用BnaA9-2基因特异性分子标记检测育种材料示意图；

共检测143份材料，除了5个杂合体(两条带)外，只有11个含有抗裂角等位变异，其余127个均没有该基因的抗裂角等位变异。

具体实施方案

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

构建油菜BnA9-2基因的guide RNA及其Cas9的转化载体：

本实施例为了保证成功率，构建了两个guide RNA，同时靶向BnA9-2基因，这两条guide RNA通过以下的构建方法，已经构建到最终载体质粒中

针对BnA9-2基因(SEQ ID NO.2所示)，利用设计网站(http://cbi.hzau.edu.cn/)设计sgRNA靶点，两个靶点序列分别为：Target1:AACAACCCCCCAAAACGAT和Target2:AGCGACCACAGTCGGATTC。按照文献[Xing,H.L.,Dong,L.,Wang,Z.P.,Zhang,H.Y.,Han,C.Y.,Liu,B.,Wang,X.C.,and Chen,Q.J.(2014).A CRISPR/Cas9toolkit for multiplexgenome editing in plants.BMC Plant Biol 14,327.]所述方法合成guide RNA(gRNA)。

具体步骤如下：合成四条Oligo序列，4A9-BsF:ATATATGGTCTCGATTGAACAACCCCCCAAAACGATGTT，A9-F0:TGAACAACCCCCCAAAACGATGTTTTAGAGCTAGAAATAGC,A9-R0:AACGAATCCGACTGTGGTCGCTCAATCTCTTAGTCGACTCTAC,BsR:ATTATTGGTCTCGAAACGAATCCGACTGTGGTCGCTCAA。

以质粒pCBC-DT1T2(Addgene plasmid 50590)为模板，利用以上合成的四条引物A9-BsF,A9-F0,A9-R0,A9-BsR进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃ 2min，95℃ 15s，56℃15s，72℃ 30s(30个循环)，72℃ 5min，回收626bpPCR产物。

将pKSE410质粒(Addgene plasmid 62202)用BsaI(NEB,R0535)酶切后，与回收的产物连接。将连接产物转化入感受态大肠杆菌。使用引物U6-26p-F:TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC和U6-29p-R:AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC做PCR以挑出阳性克隆，PCR反应条件同上。

使用U6-26p-F引物进行测序验证。常规方法提取质粒。

实施例2：

根癌农杆菌GV3101的转化

将构建好的阳性克隆菌液扩大培养，按照小量法质粒提取试剂盒的操作说明书提取阳性质粒备用。

使用液氮冻融法转化农杆菌，具体操作如下：

从-70℃冰箱取出一管农杆菌GV3101感受态细胞置于冰上融化；

融化后取30ul感受态细胞加入1ul阳性质粒，冰上静置15min，依次放入液氮中5min，37℃水浴5min，冰上静置5min；

加入500ul空白液体LB培养基，28℃200rpm振荡培养3h；

取100ul菌液涂布于3抗LB固体培养基上(分别添加终浓度为50mg/L的利福平、庆大霉素、卡那霉素)，28℃倒置培养2d；

挑选12个单克隆摇菌，菌落PCR检测是否转化成功，-80℃保存阳性克隆的甘油菌备用。

实施例3：

油菜的遗传转化

1.种子消毒及发芽。挑选200粒饱满的油菜R2品系种子，用75％酒精消毒1min，1.5％的升汞消毒15min，无菌蒸馏水冲洗4次，然后将种子摆放在无菌的M0培养基上(2.2g/L MS粉末，7.5g/L琼脂粉，pH＝6.5)24℃暗培养5-6天，得到无菌苗。切苗前2天将保存的农杆菌菌株取出，接种于LB液体培养基(添加终浓度为均50mg/L的卡那霉素、庆大霉素和利福平)在28℃、180-220r/min的摇床上振荡过夜培养，第二天在用接种环在LB固体培养基上(添加终浓度均为50mg/L的卡那霉素、庆大霉素和利福平)划线，28℃培养1天。

2.侵染及共培养。用接种环刮取微量农杆菌菌体，加入到DM培养基(4.4g/L MS粉末，30g/L蔗糖，pH＝6.5，使用前加入100uM/L的乙酰丁香酮)中，28℃震荡培养30min至OD600为0.3左右；在超净工作台内将暗培养5-6天后的油菜下胚轴切成长约1cm的小段，将切好的下胚轴切段转移至DM培养基中，侵染30min，滤纸吸干多余的菌液，再将下胚轴切段转移至M1培养基(4.4g/L MS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，7.5g/L琼脂糖，25mg/L潮霉素B，0.3mg/L激动素，pH＝6.5，使用前加入100uM/L的乙酰丁香酮)上，24℃暗培养2天。

3.筛选及分化。将共培养2天后的外植体转移至M2培养基(4.4g/L MS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，7.5g/L琼脂糖，25mg/L潮霉素B，0.3mg/L激动素，pH＝6.5，使用前加入25mg/L潮霉素B，20mg/L硝酸银，300mg/L特美汀)，20℃光照培养3周左右，然后将外植体转入M3培养基(4.4g/L MS粉末，10g/L葡萄糖，0.25g/L木糖，0.6g/L MES，7.5g/L琼脂糖，0.2mg/L IAA，pH＝6.5，使用前加入25mg/L潮霉素B，300mg/L特美汀，2mg/L反式玉米素)，20℃光照培养，每2周继代一次，这个阶段可见再分化的幼苗。

4.生根。将再分化的小苗从愈伤组织上切下，转入M4培养基(3.21g/L B5粉末，20g/L蔗糖，8.5g/L琼脂粉，pH＝6.5)中生根培养2-3周，根系长出后即可移栽。

实施例4：

T0及T1代转基因油菜的阳性检测及靶点突变检测

获得T0代转基因幼苗后，使用常规CTAB法提取叶片基因组DNA，再用pKSE401(Kan)载体上的Cas9基因特异引物进行阳性检测；

引物序列为：pKSE401cas9-F:GGCAGGAGGACTTCTACCCT；pKSE401cas9-R:TCAGCTGCATGAAATTGCGG.产物大小为816bp；

进一步使用靶点突变检测引物检测阳性转基因材料中靶点序列的突变情况；

靶点突变检测引物：

A9-Mu-check-F:GGAGGAAGTAGATGGTAATTTTTCA

A9-Mu-check-R:CATCGTCAAGATTAGAGGAGGAAAC

将PCR产物送去武汉天一辉远生物科技有限公司测序，分别使用A9-Mu-check-F/R进行正向和反向测序。将正向或反向测序结果出现双峰的材料的PCR回收产物连接到TA克隆载体上，再挑10个左右的单克隆进一步进行测序；

选取靶点序列发生突变的T0代转基因油菜单株套袋自交，收获种子继续种植T1代。按实施例4的方法对T1代材料进行阳性检测和靶点序列突变检测。

实施例5：

BnA9-2基因突变后可明显提高油菜抗裂角指数

T1代基因编辑转基因油菜的抗裂角指数鉴定及其它农艺性状考察

在T1代转基因油菜种子转色后角果开裂之前，从茎基部割下整个植株，每个株系的单株用包装带捆在一起，倒置悬挂在通风良好的库房，自然晾干2-3周；

每个单株取50-60个发育正常的角果用于抗裂角指数的鉴定，并对株高、有效分枝数、单株有效角果数、角果长、每角粒数、千粒重等农艺性状进行考察；

利用NY/T 3066-2016油菜抗裂角性鉴定技术规程所述的方法对BnA9-2基因CRISPR-Cas9基因编辑T1代转基因株系的角果进行抗裂角指数鉴定。结果表明，许多转基因阳性并且目标靶点发生突变的株系和阴性对照相比，角果的抗裂角指数明显提高，而角果长、每角粒数、千粒重、单株有效角果数及单株产量没有明显变化。

表1 BnA9-2基因编辑T1代转基因油菜3个株系抗裂角指数鉴定结果

	重复1	重复2	重复2
				WT(R2)	0.02	0.06	0.03
A9M1-2	0.21	0.35	0.29
				A9M1-4	0.33	0.36	0.40
A9M1-5	0.5	0.56	0.44

上述结果表明，与野生型R2相比，BnA9-2基因编辑突变材料3个株系的抗裂角指数明显提高，表明对BnA9-2基因进行突变可以明显提高油菜角果的抗裂性。

实施例6：

BnA9-2基因抗裂角等位变异鉴定及特异性标记开发

1、BnA9-2基因序列的克隆

使用常规CTAB法提取亲本R1及R2叶片基因组DNA。根据甘蓝型油菜Darmor参考基因组(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)中BnA9-2基因(BnaA09g39480D)的模板序列，利用NCBI公共数据库中的Primer-BLAST在线程序设计合成一对扩增BnA9-2基因组序列的特异引物g480F1：CCGGGAATTCCATTGGGGAA，R1：CGGGACGGGTATTTATGCCT。利用这对引物，分别以R1、R2叶片gDNA为模板，扩增BnA9-2基因。PCR反应体系为：2×KOD FX buffer10ul,10uM正反向引物各0.6uM，2mM dNTPs 4ul,DNA模板100ng，KOD FX(Toyobo，KFX101)0.5ul，双蒸水补至20ul。PCR反应条件为95℃ 2min；95℃30s，60℃30s(每个循环依次降低1℃)，72℃3min(5个循环)；95℃30s，55℃30s，72℃3min(30个循环)；72℃5min。反应结束后，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根，DP209)回收目的条带，连接pTOPO-Blunt克隆载体(艾德莱，CV1601)，转化T1感受态细胞。第二天从氨苄青霉素抗性平皿上随机挑选12个单克隆，使用M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT及M13R：CAGGAAACAGCTATGACC进行菌落PCR检测，挑选3-5个阳性克隆送到公司测序。测序结果返回后，使用在线序列比对软件Multalin(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)进行序列比对分析。R1中BnA9-2基因组序列如SEQ ID NO.1所示,R2中BnA9-2基因组序列如SEQ ID NO.2所示，R2中BnA9-2基因编码区序列如SEQ ID NO.3所示，R2中BnA9-2基因编码蛋白预测氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2、BnA9-2基因特异性分子标记的开发

经序列分析，与R2相比，R1中的BnaA9-2基因在第二个外显子中存在一处单碱基“C”的缺失，并存在一段629bp的插入序列(SEQ ID NO.5所示)。我们针对BnA9-2基因中这段629bp插入序列的有无差异开发了1个Indel标记，由3条引物组成，包括1条正向引物A9-2-F:AAACTGTAAACAGCAGCCCG和2条结合不同位置的反向引物A9-2-R:GTCATTCCAGACATCCATCT及A9-2-Indel-R:TGAAAAGTCTACAGCAGGTG。利用本领域的常规方式，针对SEQ ID NO.5所示序列设计的其他特异性引物，也能完成本发明。

这个3引物特异分子标记可以分别在R1和R2中扩增出774bp和392bp的条带(图7)。

PCR反应体系：A9-2-F/A9-2-R/A9-2-Indel-R这3条引物各0.2uM，DNA模板1ul，2×Green Taq Mix(诺韦赞，P131)5ul，双蒸水补至10ul。PCR反应程序：95℃ 3min；95℃ 30s，60℃ 30s(每个循环依次降低1℃)，72℃ 1min，循环10次；95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min，循环25次；72℃ 5min。反应结束后，取5ul PCR产物跑胶检测。

实施例7：

BnA9-2基因特异性分子标记在油菜抗裂角育种筛选中的应用

利用本发明提供的分子标记引物，A9-2-F:AAACTGTAAACAGCAGCCCG和2条结合不同位置的反向引物A9-2-R:GTCATTCCAGACATCCATCT及A9-2-Indel-R:TGAAAAGTCTACAGCAGGTG。对待测样品进行PCR扩增，含有R1特有774bp长度片段(R1-774bp)的表示含纯合抗性位点，含有R2特有392bp长度片段(R2-392bp)的表示含纯合不抗位点，两条带都有的表示材料在该位点上为杂合。相同遗传背景下，含有R1-774bp纯合抗性位点和杂合的表现为抗裂角，含有R2-392bp纯合不抗位点的表现为不抗裂角。不同遗传背景下由于受到其他与裂角相关位点的影响，基因型与表型不一定能一一对应，但具有一定的相关性。

本实施例利用上述方法检测了143份材料，除了5个杂合体外，只有11个含有抗裂角等位变异，其余127个均没有该基因的抗裂角等位变异。

利用本发明的分子标记，可用于油菜资源或育种材料进行鉴定，筛选含有BnA9-2抗裂角等位变异的油菜资源或育种材料。或对利用随机碰撞法(彭鹏飞等.油菜抗裂角性鉴定方法的改进及试验.农业工程学报，2013，29(21)：19-25)或钟摆法(Raman,et al.,Genome-wide delineation of natural variation for pod shatter resistance inBrassic a napus.PloS One.2014，9,e101673)鉴定筛选出的抗裂角性油菜资源或育种材料进行BnA9-2抗裂角等位变异基因分子标记鉴定，筛选含有BnA9-2抗裂角等位变异的油菜资源或育种材料。

利用含有抗裂角等位变异的亲本如R1，与不含抗裂角等位变异的亲本如R2杂交，F1代套袋自交，随后或连续自交，或回交结合自交，或结合小孢子培养纯合基因型，或结合BnA9-2抗裂角等位变异的特异性分子标记进行辅助选择，选育含有BnA9-2抗裂角等位变异的油菜品种和品系，提高油菜的抗裂角性。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 油菜BnA9-2基因在提高油菜角果抗裂性中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1940

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaacatat cagtaaacgg acagtcacaa gtgcctcctg gctttaggtt tcacccgact 60

gaggaagagc tcttgcagta ttacctccgc aaaaaaatat ctaacatcaa gattgatctc 120

gatgttattc gtgatgttga tctcaacaag ctcgagcctt gggatattca aggttcatca 180

tatatctttg tcttattaat ataatttcac ataacgtata accagagctg atattaaatt 240

tattaatccg ttcacgttga gtcataattc aaaagcttca actagtgatt tcatcttggt 300

tttaaaaaaa ctagtgattt catctcaggg atattcacaa aataaaatat ataccattgt 360

tcgacttgat ttgcgagatt ctaaggagat gttataatat ttaattgatt tattttttcc 420

gataatacta tttggcagaa gaaataaaat tatacatctt agttacatcc attacgattc 480

atcagttaga acctaacttt tgttttacta tatagagatg tgcaagattg gaacaacccc 540

caaaacgatt ggtacttctt tagccacaag gacaagaagt atcccacggg aacaagaacc 600

aaccgagcga ccacagtcgg attctggaaa gcaaccggac gtgacaagat catatacagc 660

aatggcgata gaatcggtat gcggaaaacg cttgtcttct ataaaggtcg agcccctcat 720

ggtcaaaaat ccgactggat catgcacgaa tatagactcg acgacaatct actagtttcc 780

tcctctaatc ttgacgatga cgtcactcta gaaacgtgtg aagtcatagg aggagacgaa 840

ggatgggtgg tgtgccgtgt tttcatgaag aagagtcttt gcaaaactgt aaacagcagc 900

ccgccgagat cgatcaaaac gccgtcattc aacgaggaga ctataggcca gtttctcgaa 960

gttatggagc aatcttgtaa agaagagacc attctagacc ctttcttgaa actccccaac 1020

ctcgagtgcc ccatgtaagc tcagggatct ggagcttgat atgctggtgc attgacacag 1080

aaagagtgtt gattgacatg gttctttgga gtatggctcg gacagattca aagaatattg 1140

aagtttggcg tgttgctgtt gtgttacaca tggacgataa tgtgtaacac atcgacgtgg 1200

acaaaaggaa ctaagacgtg atgacgtgga gagttcccat tggctgatct tgtttggacg 1260

tgattcacaa actagaagat cctcagatca cgaattggaa gatttggtga tgctgatttt 1320

taggaaaata gatattgcac aattgggaag aattggtggc aatatatagg aaagcttaga 1380

cttaggatta ggtcaagctt tcaacgatat attctcacag aaacacaaac aggggttttg 1440

gggtttcaga aagtgagtga tttgtaaacg tgatcaacag gggttggttc acgcaaaggg 1500

tagattaaga attggtccgt gacaagccgc gtgtggcgtt gtgtaattcg gattagacaa 1560

gtctttgtaa aagattgttt aagtgattct taataaagag acagttggtc ttgaatcctt 1620

tgtgttctta ttggtttcac ctgctgtaga cttttcaccc caacaccgtc gcgagttacc 1680

agcggttgat ggacgaccaa gtcagcaact gccatgtcag taaacttgtg gatcccatca 1740

ctagctgggc ctctttggat cgtctcgttg cctcgcagct aaatgggccc aactcatatt 1800

atgagatccc acaatcaccg ttccatggac taaaccggcc cggttatttc aatactggtt 1860

tgacgcctga ttattatata ccagagatgg atgtctggaa tgacacagat ttcgggagaa 1920

cgacgccatc gtccaactag 1940

<210> 2

<211> 1312

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaacatat cagtaaacgg acagtcacaa gtgcctcctg gctttaggtt tcacccgact 60

gaggaagagc tcttgcagta ttacctccgc aaaaaaatat ctaacatcaa gattgatctc 120

gatgttattc gtgatgttga tctcaacaag ctcgagcctt gggatattca aggttcatca 180

tatatctttg tcttattaat ataatttcac ataacgtata accagagctg atattaaatt 240

tattaatccg ttcacgttga gtcataattc aaaagcttca actagtgatt tcatcttggt 300

tttaaaaaaa ctagtgattt catctcaggg atattcacaa aataaaatat ataccattgt 360

tcgacttgat ttgcgagatt ctaaggagat gttataatat ttaattgatt tattttttcc 420

gataatacta tttggcagaa gaaataaaat tatacatctt agttacatcc attacgattc 480

atcagttaga acctaacttt tgttttacta tatagagatg tgcaagattg gaacaacccc 540

ccaaaacgat tggtacttct ttagccacaa ggacaagaag tatcccacgg gaacaagaac 600

caaccgagcg accacagtcg gattctggaa agcaaccgga cgtgacaaga tcatatacag 660

caatggcgat agaatcggta tgcggaaaac gcttgtcttc tataaaggtc gagcccctca 720

tggtcaaaaa tccgactgga tcatgcacga atatagactc gacgacaatc tactagtttc 780

ctcctctaat cttgacgatg acgtcactct agaaacgtgt gaagtcatag gaggagacga 840

aggatgggtg gtgtgccgtg ttttcatgaa gaagagtctt tgcaaaactg taaacagcag 900

cccgccgaga tcgatcaaaa cgccgtcatt caacgaggag actataggcc agtttctcga 960

agttatggag caatcttgta aagaagagac cattctagac cctttcttga aactccccaa 1020

cctcgagtgc cccaacaccg tcgcgagtta ccagcggttg atggacgacc aagtcagcaa 1080

ctgccatgtc agtaaacttg tggatcccat cactagctgg gcctctttgg atcgtctcgt 1140

tgcctcgcag ctaaatgggc ccaactcata ttatgagatc ccacaatcac cgttccatgg 1200

actaaaccgg cccggttatt tcaatactgg tttgacgcct gattattata taccagagat 1260

ggatgtctgg aatgacacag atttcgggag aacgacgcca tcgtccaact ag 1312

<210> 3

<211> 969

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaacatat cagtaaacgg acagtcacaa gtgcctcctg gctttaggtt tcacccgact 60

gaggaagagc tcttgcagta ttacctccgc aaaaaaatat ctaacatcaa gattgatctc 120

gatgttattc gtgatgttga tctcaacaag ctcgagcctt gggatattca agagatgtgc 180

aagattggaa caacccccca aaacgattgg tacttcttta gccacaagga caagaagtat 240

cccacgggaa caagaaccaa ccgagcgacc acagtcggat tctggaaagc aaccggacgt 300

gacaagatca tatacagcaa tggcgataga atcggtatgc ggaaaacgct tgtcttctat 360

aaaggtcgag cccctcatgg tcaaaaatcc gactggatca tgcacgaata tagactcgac 420

gacaatctac tagtttcctc ctctaatctt gacgatgacg tcactctaga aacgtgtgaa 480

gtcataggag gagacgaagg atgggtggtg tgccgtgttt tcatgaagaa gagtctttgc 540

aaaactgtaa acagcagccc gccgagatcg atcaaaacgc cgtcattcaa cgaggagact 600

ataggccagt ttctcgaagt tatggagcaa tcttgtaaag aagagaccat tctagaccct 660

ttcttgaaac tccccaacct cgagtgcccc aacaccgtcg cgagttacca gcggttgatg 720

gacgaccaag tcagcaactg ccatgtcagt aaacttgtgg atcccatcac tagctgggcc 780

tctttggatc gtctcgttgc ctcgcagcta aatgggccca actcatatta tgagatccca 840

caatcaccgt tccatggact aaaccggccc ggttatttca atactggttt gacgcctgat 900

tattatatac cagagatgga tgtctggaat gacacagatt tcgggagaac gacgccatcg 960

tccaactag 969

<210> 4

<211> 322

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Asn Ile Ser Val Asn Gly Gln Ser Gln Val Pro Pro Gly Phe Arg

1 5 10 15

Phe His Pro Thr Glu Glu Glu Leu Leu Gln Tyr Tyr Leu Arg Lys Lys

20 25 30

Ile Ser Asn Ile Lys Ile Asp Leu Asp Val Ile Arg Asp Val Asp Leu

35 40 45

Asn Lys Leu Glu Pro Trp Asp Ile Gln Glu Met Cys Lys Ile Gly Thr

50 55 60

Thr Pro Gln Asn Asp Trp Tyr Phe Phe Ser His Lys Asp Lys Lys Tyr

65 70 75 80

Pro Thr Gly Thr Arg Thr Asn Arg Ala Thr Thr Val Gly Phe Trp Lys

85 90 95

Ala Thr Gly Arg Asp Lys Ile Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Arg Ile Gly

100 105 110

Met Arg Lys Thr Leu Val Phe Tyr Lys Gly Arg Ala Pro His Gly Gln

115 120 125

Lys Ser Asp Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Asp Asp Asn Leu Leu

130 135 140

Val Ser Ser Ser Asn Leu Asp Asp Asp Val Thr Leu Glu Thr Cys Glu

145 150 155 160

Val Ile Gly Gly Asp Glu Gly Trp Val Val Cys Arg Val Phe Met Lys

165 170 175

Lys Ser Leu Cys Lys Thr Val Asn Ser Ser Pro Pro Arg Ser Ile Lys

180 185 190

Thr Pro Ser Phe Asn Glu Glu Thr Ile Gly Gln Phe Leu Glu Val Met

195 200 205

Glu Gln Ser Cys Lys Glu Glu Thr Ile Leu Asp Pro Phe Leu Lys Leu

210 215 220

Pro Asn Leu Glu Cys Pro Asn Thr Val Ala Ser Tyr Gln Arg Leu Met

225 230 235 240

Asp Asp Gln Val Ser Asn Cys His Val Ser Lys Leu Val Asp Pro Ile

245 250 255

Thr Ser Trp Ala Ser Leu Asp Arg Leu Val Ala Ser Gln Leu Asn Gly

260 265 270

Pro Asn Ser Tyr Tyr Glu Ile Pro Gln Ser Pro Phe His Gly Leu Asn

275 280 285

Arg Pro Gly Tyr Phe Asn Thr Gly Leu Thr Pro Asp Tyr Tyr Ile Pro

290 295 300

Glu Met Asp Val Trp Asn Asp Thr Asp Phe Gly Arg Thr Thr Pro Ser

305 310 315 320

Ser Asn

<210> 5

<211> 629

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgtaagctca gggatctgga gcttgatatg ctggtgcatt gacacagaaa gagtgttgat 60

tgacatggtt ctttggagta tggctcggac agattcaaag aatattgaag tttggcgtgt 120

tgctgttgtg ttacacatgg acgataatgt gtaacacatc gacgtggaca aaaggaacta 180

agacgtgatg acgtggagag ttcccattgg ctgatcttgt ttggacgtga ttcacaaact 240

agaagatcct cagatcacga attggaagat ttggtgatgc tgatttttag gaaaatagat 300

attgcacaat tgggaagaat tggtggcaat atataggaaa gcttagactt aggattaggt 360

caagctttca acgatatatt ctcacagaaa cacaaacagg ggttttgggg tttcagaaag 420

tgagtgattt gtaaacgtga tcaacagggg ttggttcacg caaagggtag attaagaatt 480

ggtccgtgac aagccgcgtg tggcgttgtg taattcggat tagacaagtc tttgtaaaag 540

attgtttaag tgattcttaa taaagagaca gttggtcttg aatcctttgt gttcttattg 600

gtttcacctg ctgtagactt ttcacccca 629

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 1

<400> 6

aaactgtaaa cagcagcccg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 1

<400> 7

gtcattccag acatccatct 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 1

<400> 8

tgaaaagtct acagcaggtg 20

Claims

1.油菜BnA9-2基因在提高油菜角果抗裂性中的应用。

2.针对SEQ ID NO.2所示序列，进行诱变使该基因及其同源基因失去功能，在提高油菜角果抗裂性中的应用。

3.油菜BnA9-2基因中的抗裂角特异性等位基因，所述基因的序列为SEQ ID NO.5所示。

4.针对SEQ ID NO.5所示序列设计的分子标记引物在油菜育种中的应用。

5.根据权利要求3所述应用，所述的油菜育种指得是油菜抗裂角育种。

6.根据权利要求3所述的应用，所述的分子标记引物为：A9-2-F:AAACTGTAAACAGCAGCCCG、A9-2-R: GTCATTCCAGACATCCATCT和A9-2-Indel-R:TGAAAAGTCTACAGCAGGTG。