CN113999932B - 一种用于鉴定甘蓝耐裂球性状的InDel分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定甘蓝耐裂球性状的InDel分子标记及其应用。本发明具体公开了甘蓝耐裂球性状InDel分子标记或检测所述甘蓝耐裂球性状InDel分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定甘蓝耐裂球性状中的应用，其中，所述甘蓝耐裂球性状InDel分子标记是核苷酸序列SEQ ID No.1第782‑826位所示的DNA分子。本发明设计了该InDel分子标记的引物，并提供一种鉴定或辅助鉴定甘蓝耐裂球性状的方法。本发明的甘蓝耐裂球性状InDel分子标记准确性高、稳定性好，检测操作简单易行，加快了甘蓝选择育种进程，可广泛应用于甘蓝种质资源分析与分子辅助遗传育种等方面。

Description

一种用于鉴定甘蓝耐裂球性状的InDel分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体地涉及一种用于鉴定甘蓝耐裂球性状的InDel分子标记及其应用。

背景技术

结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)，简称甘蓝，是十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)二年生蔬菜作物，在蔬菜周年供应中占有十分重要的地位。

裂球是甘蓝栽培过程中常见的主要生理障害之一。在甘蓝结球后期，叶球的外层叶片已接近成熟，生长缓慢，如果内层叶片继续快速生长，外层叶片便会在机械力的作用下裂开。最常见的是叶球顶部开裂，有时侧面也开裂，轻者仅叶球外部几层叶片开裂，重者开裂可深至短缩茎。甘蓝裂球不仅严重地影响叶球外观品质和商品性，还极易引发虫害及病害，导致甘蓝产量、耐贮运性大幅度降低，给生产造成巨大的经济损失。甘蓝裂球的发生是受遗传、生理及环境等多种因素的影响，但遗传是主要因素，因此传统农艺防止措施如控制结球期肥水等效果不明显，只有培育耐裂球的甘蓝品种，才能从根本上解决甘蓝裂球问题。

常规杂交育种方法选育耐裂球品种时，育种家需要在甘蓝结球期对耐裂球性状进行田间鉴定，周期相对较长，易受环境条件影响，费时且选择效率较低。因此，本领域亟需开发出一种分子标记用于辅助筛选甘蓝耐裂球材料，加速育种进程。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定甘蓝耐裂球性状和/或加快甘蓝选择育种进程。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了甘蓝耐裂球性状InDel分子标记或检测所述甘蓝耐裂球性状InDel分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定甘蓝耐裂球性状中的应用，所述甘蓝耐裂球性状InDel分子标记是核苷酸序列如SEQ ID No.1的第782-826位所示的DNA分子。

其中，SEQ ID No.1的第782-826位由45个核苷酸组成。

上述应用中，所述检测所述甘蓝耐裂球性状InDel分子标记的物质可含有扩增包含所述甘蓝耐裂球性状InDel分子标记在内的甘蓝基因组DNA片段的PCR引物。

进一步地，所述PCR引物可为引物对，所述引物对由正向引物和反向引物组成，所述正向引物为与甘蓝基因组DNA中SEQ ID No.1第782-826位所示双链DNA的上游特异结合的单链DNA，所述反向引物为与甘蓝基因组DNA中SEQ ID No.1第782-826位所示双链DNA的下游特异结合的单链DNA。

进一步地，所述正向引物序列具体可为如SEQ ID No.3所示的单链DNA，所述反向引物具体可为如SEQ ID No.4所示的单链DNA。

上述应用中，所述甘蓝可为甘蓝自交系。

本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定甘蓝耐裂球性状的方法，包括以下步骤：

(1)以待鉴定甘蓝材料基因组DNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

(2)根据所述PCR产物是否含有所述甘蓝耐裂球性状InDel分子标记来鉴定甘蓝耐裂球性状：

所述PCR产物含有所述甘蓝耐裂球性状InDel分子标记的所述待鉴定甘蓝的耐裂球性强于所述PCR产物不含有所述甘蓝耐裂球性状InDel分子标记的所述待鉴定甘蓝。

上述方法中，所述待鉴定甘蓝可为甘蓝自交系。

进一步地，所述PCR的扩增程序可为：94℃预变性2min；94℃变性30s，46℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。

所述甘蓝耐裂球性状InDel分子标记也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了所述甘蓝耐裂球性状InDel分子标记在甘蓝种质资源分析或分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供了含有扩增包含所述甘蓝耐裂球性状InDel分子标记的PCR引物在甘蓝种质资源分析或分子标记辅助育种中的应用。

上文中，所述分子标记辅助育种的目的包括培育耐裂球的甘蓝。

本发明提供了一种鉴定甘蓝耐裂球性状的InDel分子标记，使用该分子标记对甘蓝耐裂球性状辅助筛选操作简单易行，只需提取待测甘蓝任一发育阶段的基因组DNA，采用特异性引物PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物特征条带的长度，即可判断出待测植株是否具有耐裂球性，提高育种效率。

附图说明

图1为本发明实施例1中“Laohongganlan”(老红甘蓝)和“Shuanghuan”(双环)的Bol016058基因比较差异位点的结果图。图中，Bol016058为Phytozome中的甘蓝02-12参考基因组Bol016058基因序列，Bol016058-G274为“Shuanghuan”(双环)的Bol016058基因序列，Bol016058-G279为“Laohongganlan”(老红甘蓝)的Bol016058基因序列。

图2为本发明实施例1中以InDel1分子标记检测耐裂球甘蓝材料“Laohongganlan”(老红甘蓝)和易裂球甘蓝材料“Shuanghuan”(双环)的琼脂糖凝胶电泳结果图。其中，M为Marker，泳道1为“Shuanghuan”(双环)，泳道2为“Laohongganlan”(老红甘蓝)。

图3为本发明实施例2中以多个甘蓝自交系验证InDel1分子标记检测准确性的琼脂糖凝胶电泳结果图。其中，M为Marker，泳道1为“Shuanghuan”(双环)、泳道2为“011-81”、泳道3为“Helan2gunyuan”(荷兰2滚圆)、泳道4为“Dazhengfu”(大争父)、泳道5为“Niuxin”(牛心)、泳道6为“Xiaoshanghai”(小上海)、泳道7为“Eganlan0901”(鄂甘蓝0901)、泳道8为“3haojiangsujinyuan”(3号江苏近圆)、泳道9为“Zhongshu2”(中蔬2)、泳道10为“Laozhouyeganlan”(老皱叶甘蓝)、泳道11为“Hebeichunfeng”(河北春丰)、泳道12为“Changzhengniuxin”(长征牛心)、泳道13为“011-71”、泳道14为“011-83”、泳道15为“Zhengmu”(争母)、泳道16为“011-69”、泳道17为“Yuedongchangzheng”(越冬长征)、泳道18为“Changzhenglvpaodan”(长征绿炮弹)、泳道19为“Dongwushi”(冬武士)、泳道20为“63tianjianqiunailie”(63天尖球耐裂)、泳道21为“Changzheng09”(长征09)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的甘蓝材料“Shuanghuan”(双环)、“Laohongganlan”(老红甘蓝)、“011-81”、“Dazhengfu”(大争父)、“Niuxin”(牛心)、“Xiaoshanghai”(小上海)、“Zhongshu2”(中蔬2)、“Laozhouyeganlan”(老皱叶甘蓝)、“Hebeichunfeng”(河北春丰)、“011-71”、“011-83”、“Zhengmu”(争母)、“011-69”、“Yuedongchangzheng”(越冬长征)、Changzhenglvpaodan”(长征绿炮弹)、“Dongwushi”(冬武士)记载于非专利文献“邰翔、陈锦秀、郭三红、朱晓炜、薄天岳.不同甘蓝自交系品质性状分析.分子植物育种，2021年，第19卷，第9期，第3065-3073页”，公众可以从上海市农业科学院(即申请人)获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

实施例1、开发用于甘蓝耐裂球性辅助筛选的InDel分子标记

1.用于甘蓝耐裂球性辅助筛选的InDel分子标记的筛选

根据Phytozome(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)中的甘蓝02-12参考基因组Bol016058基因序列，设计该基因的全长序列扩增引物，所述引物为：

Bol016058_1F：5’-CCGAGTCCCAATTATTGTTGGTAAA-3’；

Bol0160581R：5’-GGACAAGGCTTCTTAGTCGGTGGTT-3’；

Bol016058_2F：5’-GGTTCCAGTGTACGAGCCACCT-3’；

Bol016058_2R：5’-ATCGCTATGTTTCTTGTAATGGTC-3’；

委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述引物。

采用CTAB法，分别提取耐裂球甘蓝材料“Laohongganlan”(老红甘蓝)和易裂球甘蓝材料“Shuanghuan”(双环)的基因组DNA。

以耐裂球甘蓝材料“Laohongganlan”(老红甘蓝)的基因组DNA为模版，以Bol016058_1F和Bol016058_1R组成的引物对进行PCR扩增，得到“Laohongganlan”(老红甘蓝)Bol016058基因-1片段；以耐裂球甘蓝材料“Laohongganlan”(老红甘蓝)的基因组DNA为模版，以Bol016058_2F和Bol016058_2R组成的引物对进行PCR扩增，得到“Laohongganlan”(老红甘蓝)Bol016058基因-2片段。

以易裂球甘蓝材料“Shuanghuan”(双环)的基因组DNA为模版，以Bol016058_1F和Bol016058_1R组成的引物对进行PCR扩增，得到“Shuanghuan”(双环)Bol016058基因-1’片段；以易裂球甘蓝材料“Shuanghuan”(双环)的基因组DNA为模版，以Bol016058_2F和Bol016058_2R组成的引物对进行PCR扩增，得到“Shuanghuan”(双环)Bol016058基因-2’片段。

上述PCR反应体系均如下：总体积为50μL，甘蓝模板DNA(200ng/μL)1μL，1×PCRbuffer，0.4mM dNTPs，1U KOD FX Neo(Toyobo，Osaka，Japan)，引物0.3μM，补充ddH₂O至50μL，混匀，离心；

PCR反应条件均为：94℃预变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，40个循环；68℃延伸5min；16℃保存。

琼脂糖凝胶电泳检测后，将电泳条带大小符合要求的PCR样品，委托上海擎科生物公司进行PCR胶回收后直接测序。通过将Bol016058基因-1片段和Bol016058基因-2片段拼接，得到“Laohongganlan”(老红甘蓝)的Bol016058基因全长序列，具体见SEQ ID No.1；通过将Bol016058基因-1’片段和Bol016058基因-2’片段拼接，得到“Shuanghuan”(双环)的Bol016058基因全长序列，具体见SEQ ID No.2。

将“Laohongganlan”(老红甘蓝)的Bol016058基因全长序列(SEQ ID No.1)和“Shuanghuan”(双环)的Bol016058基因全长序列(SEQ ID No.2)比较差异位点，结果见图1，确定两份甘蓝材料差异InDel分子标记为SEQ ID No.1的第782-826位，由45个核苷酸组成，具体序列如下：

InDel:5’-TCCGGTTTACAAGCCGCCTCCAAAGGTAGAGCACCCACCTCCAGT-3’(SEQ ID No.1的第782-826位)。

2.用于检测甘蓝耐裂球性辅助筛选的InDel分子的引物

针对步骤1筛选出的InDel分子标记，设计合成两条寡核苷酸引物InDel1_NLQ1F和InDel1_NLQ1R，用于筛选甘蓝耐裂球性状的分子标记，所述分子标记为：

InDel1_NLQ1F:5’-CCTCCTTTTAAGGGATTTGA-3’(SEQ ID No.3)；

InDel1_NLQ1R:5’-GATTGTTGGTGGCTTGTGTA-3’(SEQ ID No.4)。

以InDel1_NLQ1F和InDel1_NLQ1R扩增耐裂球甘蓝材料“Laohongganlan”(老红甘蓝)的基因组DNA，应得到429bp特征条带；以InDel1_NLQ1F和InDel1_NLQ1R扩增易裂球甘蓝材料“Shuanghuan”(双环)的基因组DNA，应得到384bp特征条带。为验证，以InDel1_NLQ1F和InDel1_NLQ1R分别扩增“Laohongganlan”(老红甘蓝)的基因组DNA和“Shuanghuan”(双环)的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2，电泳条带大小符合要求。

实施例2、所开发InDel分子标记筛选甘蓝耐裂球材料的准确性验证

本实施例利用实施例1开发的甘蓝耐裂球性状InDel分子标记进行甘蓝耐裂球性状的鉴定。该甘蓝耐裂球性状InDel分子标记是为SEQ ID No.1的第782-826位所示的双链DNA分子。具体方法如下：

1材料

21份甘蓝自交系，具体如下：

16份易裂球甘蓝：“Shuanghuan”(双环)、“011-81”、“Helan2gunyuan”(荷兰2滚圆)、“Dazhengfu”(大争父)、“Niuxin”(牛心)、“Xiaoshanghai”(小上海)、“Eganlan0901”(鄂甘蓝0901)、“3haojiangsujinyuan”(3号江苏近圆)、“Zhongshu2”(中蔬2)、“Laozhouyeganlan”(老皱叶甘蓝)、“Hebeichunfeng”(河北春丰)、“Changzhengniuxin”(长征牛心)、“011-71”、“011-83”、“Zhengmu”(争母)、“011-69”。

5份耐裂球甘蓝：“Yuedongchangzheng”(越冬长征)、“Changzhenglvpaodan”(越冬长征绿炮弹)、“Dongwushi”(冬武士)、“63tianjianqiunailie”(63天尖球耐裂)、“Changzheng09”(长征09)。

2甘蓝材料基因组DNA的提取

用CTAB法分别提取上述21份甘蓝材料叶片的基因组DNA，具体步骤如下：

①取适量甘蓝叶片于2mL离心管中，加入1粒直径4mm的钢珠，将装有叶片和钢珠的离心管浸入液氮速冻后置于磨样机中将样品磨碎；

②向磨碎的样品加入700μL 2×CTAB提取缓冲液(20g/L CTAB，100mM Tris-HCLpH8.0，50mM EDTApH8.0，82g/L NaCl)，置于65℃水浴中孵育约1h，期间轻轻颠倒混匀数次；

③将样品取出，冷却至室温，加入700μL氯仿，混匀，12000rpm离心10min；

④吸取400μL上清至另外的1.5mL离心管中，加入280μL-20℃提前预冷的异丙醇，放于-20℃低温冰箱中至少1h；

⑤9000rpm 1min离心收集DNA，倒掉上清；

⑥加入1mL 75％乙醇清洗DNA沉淀，重复两次，最后将乙醇彻底吸干，至乙醇完全挥发干净，加入50μL灭菌超纯水溶解DNA，得到基因组DNA。

3鉴定引物InDel1_NLQ1F/R在甘蓝材料中的扩增情况

委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成实例1中所述引物InDel1_NLQ1F和InDel1_NLQ1R。

以步骤2得到的各甘蓝自交系的基因组DNA分别为模板，利用引物InDel1_NLQ1F和InDel1_NLQ1R。进行PCR，反应体系和反应条件如下：

反应体系：总体积为10μL，模板DNA(20ng/μL)1μL，InDel1_NLQ1F 0.2μM，InDel1_NLQ1R0.2μM，2×Taq预混PCR反应体系(含染料)(购于北京康润生物)5μL，ddH2O 3.6μL，混匀，离心；

反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30s，46℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min；16℃保存；

PCR产物用4％琼脂糖凝胶(琼脂糖2g，TAE缓冲液50ml)电泳检测，150V恒压电泳30min，经紫外光凝胶成像仪拍照。

结果如图3所示：所有21个甘蓝品种的PCR扩增产物均为一个在300-500bp的DNA片段，对所有的300-500bp的DNA片段进行检测，所有16个易裂球甘蓝样品的PCR扩增产物均为一个384bp的DNA片段，均未检测出429bp特征条带，而所有甘蓝耐裂球材料“Yuedongchangzheng”(越冬长征)、“Changzhenglvpaodan”(长征绿炮弹)、“Dongwushi”(冬武士)、“63tianjianqiunailie”(63天尖球耐裂)和“Changzheng09”(长征09)的PCR扩增产物均为一个429bp的DNA片段。

综上，本发明建立了一种应用InDel分子标记对甘蓝耐裂球性状辅助筛选的方法，该方法操作简单易行，只需提取待测甘蓝任一发育阶段的基因组DNA，采用特异性引物PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物特征条带的长度或序列，即可判断出待测植株是否具有耐裂球性，提高育种效率。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 一种用于鉴定甘蓝耐裂球性状的InDel分子标记及其应用

<130> GNCSY212889

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1565

<212> DNA

<213> 甘蓝(Brassica oleracea)

<400> 1

atgaggatct taccagaacc tcgaggttcg gttccatgcc tccttctcct cctgtccgtt 60

gtcttttcag cgactctatc tctcgctcgc gtcgtcgaag ttgttggtaa cgccgagagc 120

aagatcaaaa ccccccatgc attctcaggt ataccacatt aatattaaca ttttgtggta 180

tctagtgtca tttttttgta gttatttgat aagtgtggtt gttacttgtc aaaggactcc 240

gagtgacgat tgactgtaag gtgaataaag ggcattttgt tacaaaagct tctggaaaca 300

ttgatgaaga cggaaagttc ggtctgaaag ttcctactca tgacattgtc tccgaggacg 360

gagctttgaa ggaggagtgt tatgctcagc ttcatagcgc ggtaggaaca ccttgcccgg 420

ctcatgacgg cctagagtcc aaccagatcg tgtttctata caaatctgga gacaaacacg 480

ttttgggtct caaacaaaat ctcaaatttt cacctgaact ttgtgtttcc aaattctttt 540

ggcctatgcc taagttccct ccttttaagg gatttgatca ccctttccct ctacctccac 600

ctttggagct tccaccgttt cctaaacctt gcccaccacc tccggttcca gtgtacgagc 660

cacctccaaa ggtggagcat ccaccacctg tcccggttta caagccacct ccaaaggtag 720

agcacccacc tccagttccg gtttacaagc cgcctccaaa ggtagagcac ccacctccag 780

ttccggttta caagccgcct ccaaaggtag agcacccacc tccagtcccg gtttacaagc 840

cacctccaaa ggtagagcac ccacctccag ttccggttta caagccgcct ccaaaggtag 900

agcacccacc tccggttccg gtttacaagc cacctccaaa ggtagagcac ccacctccgg 960

ttccagtaca caagccacca acaatcccca agaagccatg cccgcctaag tcgccaaaga 1020

ttgagcttcc accgccagtg ccagttcaca aaccaccgac taagaagcct tgtccgccca 1080

agccaccaaa gaaagttgat ccgccaccgg ttccagtcca caagccgccg ccgaaaatag 1140

tccttccacc gccggtacca atccacaagc cgccaaagaa gccgtgcccg cctaaagcgc 1200

caaagatcaa gcttccacca ccagtaccgg tttacaagcc accaccgaag atagagcatc 1260

caccaatcta cgtgccaccg gtgatcccga agaagccatg cccgcccaaa gcgccgaagg 1320

tcgatccacc accggttccg gtctacaagc cgccaccgaa gatagagcat ccaccaatct 1380

acgtgccacc agtgatccca aagaagccgt gtcctccgcc ggtaccaatc tacgtgccac 1440

cggtggtgat tccgaagaag ccatgtccgc cacttccacc acttccaaag tttccgcctc 1500

ttcctcctaa atacattcac caccccaagt tcggcaaatg gcctccgttg ccgactcacc 1560

cttga 1565

<210> 2

<211> 1520

<212> DNA

<213> 甘蓝(Brassica oleracea)

<400> 2

atgaggatct tacccgaacc tcgaggttcg gttccatgcc tccttctcct cctgtccgtt 60

gtcttttcag cgactctatc tctcgctcgc gtcgtcgaag ttgttggtaa cgccgagagc 120

aagatcaaaa ccccccatgc attctcaggt ataccacatt aatattaaca ttttgtggta 180

tctagtgtca tttttttgta gttatttgat aagtgtggtt gttacttgtc aaaggactcc 240

gagtgacgat tgactgtaag gtgaataaag ggcattttgt tacaaaagct tctggaaaca 300

ttgatgaaga cggaaagttc ggtctgaaag ttcctactca tgacattgtc tccgaggacg 360

gagctttgaa ggaggagtgt tatgctcagc ttcatagcgc ggtaggaaca ccttgccccg 420

ctcatgacgg cctagagtcc aaccagatcg tgtttctata caaatctgga gacaaacacg 480

ttttgggtct caaacaaaat ctcaaatttt cacctgaact ttgtgtttcc aaattctttt 540

ggcctatgcc taagttccct ccttttaagg gatttgatca ccctttccct ctacctccac 600

ctttggagct tccaccgttt cctaaacctt gcccaccacc tccggttcca gtgtacgagc 660

cacctccaaa ggtggagcat ccaccacctg tcccggttta caagccacct ccaaaggtag 720

agcacccacc tccagttccg gtttacaagc cgcctccaaa ggtagagcac ccacctccag 780

tcccggttta caagccacct ccaaaggtag agcacccacc tccagttccg gtttacaagc 840

cgcctccaaa ggtagagcac ccacctccgg ttccggttta caagccacct ccaaaggtag 900

agcacccacc tccggttcca gtacacaagc caccaacaat ccccaagaag ccatgcccgc 960

ctaagtcgcc aaagattgag cttccaccgc caatgccagt tcacaaacca ccgactaaga 1020

agccttgtcc gcccaagaca ccaaagaaag ttgatccgcc accggttcca gtccacaagc 1080

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ccaaagcgcc gaaggtcgat ccaccaccgg ttccggtcta caagccgcca ccgaagatag 1320

agcatccacc aatctacgtg ccaccagtga tcccaaagaa gccgtgtcct ccgccggtac 1380

caatctacgt gccaccggtg gtgattccga agaagccatg tccgccactt ccaccacttc 1440

caaagtttcc gcctcttcct cctaaataca ttcaccaccc caagttcggc aaatggcctc 1500

cgttgccgac tcacccttga 1520

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctcctttta agggatttga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gattgttggt ggcttgtgta 20

Claims (1)

1.引物组在辅助鉴定甘蓝耐裂球性状中的应用，其特征在于，所述引物组中正向引物的序列如SEQ ID No.3所示，反向引物的序列如SEQ ID No.4所示。

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