CN101845504A - 用于鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列及其鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列及其鉴定方法，引物序列是由序列表中SEQ ID No1、SEQ ID No2所述的核苷酸序列组成；鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法，步骤是(1)提取黄瓜基因组DNA；(2)用序列表中SEQ ID No1、SEQ ID No2所述的核苷酸序列为引物进行PCR扩增；(3)扩增产物的凝胶电泳分析；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜黑斑病的抗性。利用本发明的引物序列对构建的F₂代分离群体和黄瓜种质资源进行黑斑病抗性评价，其结果与人工接种鉴定符合率分别达95.04％和94.74％，与抗黑斑病基因的连锁遗传距离为4.96cM，而且具有快速、准确、不受环境条件影响等优点，在黄瓜育种中进行资源抗性筛选具有很大的应用价值。

Description

用于鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列及其鉴定方法

技术领域

本发明涉及生物技术中的DNA序列，及其利用DNA序列鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法。

背景技术

黄瓜黑斑病[Cucumber alternaria leaf spot，Alternaria cucumerina]俗称“黄点病”，是由瓜链格孢菌引起的真菌性病害，目前已成为为害黄瓜保护地栽培的重要病害之一。该病主要危害叶片，一般先从黄瓜的中、下部叶片开始发生，而后逐渐向上蔓延，病斑沿叶脉两侧的叶肉组织发展，主脉一般不受害。最后仅剩下顶端几片绿叶，病株似火烤状。重病株除心叶外，均可染病。病斑初为褪绿色近圆形斑点，后为边缘清晰的圆形或近圆形病斑，中央灰白色，边缘淡黄色。叶面病斑稍突起，表面粗糙，叶背面病斑常呈水浸状，周围常有褪绿晕圈。病斑多在叶脉之间，在高温高湿条件下，病斑上生稀疏的灰褐色霉层(典型症状)。病斑直径一般为5～6毫水，最大的约10毫米，发病严重时，常数个病斑连片汇合，严重时叶肉组织枯死，病斑连片，叶缘向上卷起，导致叶片焦枯，似火烤状，但不脱落。黄瓜黑斑病一般在4月中旬至5月上、中旬发生，发病率高达60％以上，减产10～20％。

黄瓜黑斑病是黄瓜生产上的重要病害。查阅国内外文献，迄今为止，有关黄瓜黑斑病的抗性遗传规律和分子标记辅助育种研究尚缺乏系统的研究和报道。因而将黄瓜抗黑斑病基因与不抗黑斑病的其它品种的优良品质基因相结合，培育优良抗病的黄瓜新品种和创造黄瓜新种质是生产实践中亟需解决的实际问题。近年来，我国黄瓜遗传育种取得很大成绩，通过常规育种已经育成许多优良品种在生产上推广应用。与常规育种相比，分子标记可以直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题。因此，加强分子标记辅助选择技术在作物育种上的应用研究具有重要的实践意义。它使育种学家能直接从分子水平了解物种间的差异，也使育种过程更直观，目的性更强。这将推动传统的“经验育种”向高效的“精确育种”转变，将会大幅度提升育种效率和技术水平。利用“分子标记辅助选择”(Molecular marker-assistedselection，MAS)，则可在早代对表现优良的基因型进行鉴定，从而大大提高育种效率。将分子遗传技术应用于抗病遗传育种的研究上，为材料的选择提供了全新的手段，苗期即可在DNA水平上对目标性状进行选择，而且稳定可靠，不受环境因素及季节的限制，增强选择的准确性和可靠性，加快育种进程，因此具有广阔的应用前景。

病害对作物的影响在诸多自然逆境因素中占首位，其危害往往造成产量和经济的巨大损失。推广种植抗病品种是安全、环保和高效的控制策略。常规育种实践中，对于抗黑斑病材料的选择比较困难：一方面选育周期长；另一方面黑斑病的发生极易受环境等多种因素的干扰(温度、湿度、病菌等)，鉴定抗性材料的过程不容易控制。分子标记技术在寻找与目标性状连锁的分子标记方面已有诸多报道，但与黄瓜黑斑病抗性相关基因紧密连锁的分子标记目前尚未见报道。在利用分子标记进行抗性鉴定的过程中，特异性的引物序列是关键。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列；

本发明的另一个目的是提供一种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法；

本发明的第三个目的是提供另一种用于鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列；

本发明的最后一个目的是提供另一种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种用于鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物组成，上游引物是序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，下游引物是序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。

一种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法，包括如下步骤：

(1)提取黄瓜基因组DNA；

(2)进行PCR扩增：在PCR扩增专用薄壁管中放入所述黄瓜基因组DNA15～30ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列20～40ng、dNTP0.15～0.25mM、Mg²⁺1.2～2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性180～300秒，94℃变性60秒，54～60℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35个循环，再72℃延伸300～420秒，扩增完成；

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；

(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜黑斑病的抗性。

第二种用于鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物组成，上游引物是序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列，下游引物是序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。

第二种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法，包括如下步骤：

(1)提取黄瓜基因组DNA；

(2)进行PCR扩增：在PCR扩增专用薄壁管中放入所述黄瓜基因组DNA15～30ng、序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列20～40ng、dNTP0.15～0.25mM、Mg²⁺1.2～2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性180～300秒，94℃变性60秒，55～58℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35个循环，再72℃延伸300～420秒，扩增完成；

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；

(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜黑斑病的抗性。

利用本发明的鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列对构建的F₂代分离群体和黄瓜种质资源进行黑斑病抗性评价，其结果与人工接种鉴定符合率分别达95.04％和94.74％，与抗黑斑病基因的连锁遗传距离为4.96cM，而且具有快速、准确、不受环境条件影响等优点，在黄瓜育种中进行资源抗性筛选具有很大的应用价值。

附图说明

图1为第一种鉴定黄瓜黑斑病抗性的扩增产物的电泳图：A为指示DNA标准条带的分子量217bp；B为抗性带，C为感性带，1～3、7-9为抗病单株；4～6、10～12为感病单株，M为DNA标准，纯合抗性株仅有抗性带，纯合感性株仅有感性带，杂合类型则同时具有抗性带和感性带。

图2为第二种鉴定黄瓜黑斑病抗性的扩增产物的电泳图：A为指示DNA标准条带的分子量217bp；B为抗性带，C为感性带，1～3、7-9为抗病单株；4～6、10～12为感病单株，M为DNA标准，纯合抗性株仅有抗性带，纯合感性株仅有感性带，杂合类型则同时具有抗性带和感性带。

图3为利用第二种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法，获得的黄瓜感黑斑病母本P62-1-1和抗黑斑病父本W43-1-2杂交后代F₂代分离情况图谱：5，9，11，12，16，25，26，29，36，38，43，44，47为抗病单株；7，8，13-15，18-20，27，31，33，42，45，46为感病单株；1-4，6，10，17，21-24，28，30，32，34，35，37，39，40，41为杂合类型单株；M为DNA标准，纯合抗性株仅有抗性带，纯合感性株仅有感性带，杂合类型则同时具有抗性带和感性带。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步的说明，下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

一种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法

(1)提取黄瓜基因组DNA；

(2)进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入所述黄瓜基因组DNA20ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列30ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列30ng、dNTP0.2mM、Mg²⁺1.5mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶1.0单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性200秒，94℃变性60秒，57℃退火50秒，72℃延伸90秒，30个循环，再72℃延伸350秒，扩增完成；

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，于95℃变性300秒，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；

(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜黑斑病的抗性。由于抗病单株、感病单株或中间类型单株经扩增以后产生不同分子量的DNA片段，在凝胶上分离时其在凝胶上的迁移速率不同，从而形成位置上存在差异的条带，通过条带在凝胶上的相对位置就可对黄瓜黑斑病材料的抗性进行快速鉴定。

实施例2

一种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法

(1)提取黄瓜基因组DNA；

(2)进行PCR扩增：在PCR扩增专用薄壁管中放入所述黄瓜基因组DNA15ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列20ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列20ng、dNTP0.15mM、Mg²⁺1.2mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性180秒，94℃变性60秒，60℃退火40秒，72℃延伸60秒，25个循环，再72℃延伸300秒，扩增完成；

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，于95℃变性300秒，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；

(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜黑斑病的抗性。

实施例3

一种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法

(1)提取黄瓜基因组DNA；

(2)进行PCR扩增：在PCR扩增专用薄壁管中放入所述黄瓜基因组DNA30ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列40ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列40ng、dNTP0.25mM、Mg²⁺2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性300秒，94℃变性60秒，54℃退火60秒，72℃延伸120秒，35个循环，再72℃延伸420秒，扩增完成；

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，于95℃变性300秒，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；

(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜黑斑病的抗性。

实施例4

第二种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法

(1)提取黄瓜基因组DNA；

(2)进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入所述黄瓜基因组DNA20ng、序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列30ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列30ng、dNTP0.2mM、Mg²⁺1.5mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶1.0单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性200秒，94℃变性60秒，57℃退火50秒，72℃延伸90秒，30个循环，再72℃延伸350秒，扩增完成；

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，于95℃变性300秒，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；

(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜黑斑病的抗性。由于抗病单株、感病单株或中间类型单株经扩增以后产生不同分子量的DNA片段，在凝胶上分离时其在凝胶上的迁移速率不同，从而形成位置上存在差异的条带，通过条带在凝胶上的相对位置就可对黄瓜黑斑病材料的抗性进行快速鉴定。

实施例5

第二种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法

(1)提取黄瓜基因组DNA；

(2)进行PCR扩增：在PCR扩增专用薄壁管中放入所述黄瓜基因组DNA15ng、序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列20ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列20ng、dNTP0.15mM、Mg²⁺1.2mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性180秒，94℃变性60秒，60℃退火40秒，72℃延伸60秒，25个循环，再72℃延伸300秒，扩增完成；

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，于95℃变性300秒，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；

(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜黑斑病的抗性。

实施例6

第二种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法

(1)提取黄瓜基因组DNA；

(2)进行PCR扩增：在PCR扩增专用薄壁管中放入所述黄瓜基因组DNA30ng、序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列40ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列40ng、dNTP0.25mM、Mg²⁺2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性300秒，94℃变性60秒，40℃退火60秒，72℃延伸120秒，35个循环，再72℃延伸420秒，扩增完成；

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，于95℃变性300秒，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；

(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜黑斑病的抗性。

利用本发明的鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列对构建的F₂代分离群体和黄瓜种质资源进行黑斑病抗性评价，其结果与人工接种鉴定符合率分别达95.04％和94.74％，与抗黑斑病基因的连锁遗传距离为4.96cM，而且具有快速、准确、不受环境条件影响等优点，在黄瓜育种中进行资源抗性筛选具有很大的应用价值。

序列表

<110>天津科润农业科技股份有限公司

<120>用于鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列及其鉴定方法

<160>3

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>mutation

<222>(1)…(22)

<400>1

tcacctcatt cctctctgtt at   22

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>mutation

<222>(1)…(23)

<400>2

cctgagtaat ctataaagcg tcg  23

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>mutation

<222>(1)…(18)

<400>3

gccggcgact aataatca        18

Claims (4)

1.一种用于鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物组成，所述上游引物是序列表中SEQ ID No1所示的核苷酸序列，所述下游引物是序列表中SEQ IDNo2所示的核苷酸序列。

2.一种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法，它包括如下步骤：

(1)提取黄瓜基因组DNA；

(2)进行PCR扩增：在PCR扩增专用薄壁管中放入所述黄瓜基因组DNA15～30ng、序列表中SEQ ID No1所示的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ ID No2所示的核苷酸序列20～40ng、dNTP0.15～0.25mM、Mg²⁺1.2～2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性180～300秒，94℃变性60秒，54～60℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35个循环，再72℃延伸300～420秒，扩增完成；

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；

(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜黑斑病的抗性。

3.一种用于鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物组成，所述上游引物是序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列，所述下游引物是序列表中SEQ IDNo2所述的核苷酸序列。

4.一种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法，它包括如下步骤：

(1)提取黄瓜基因组DNA；

(2)进行PCR扩增：在PCR扩增专用薄壁管中放入所述黄瓜基因组DNA15～30ng、序列表中SEQ ID No3所示的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ ID No2所示的核苷酸序列20～40ng、dNTP0.15～0.25mM、Mg²⁺1.2～2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性180～300秒，94℃变性60秒，55～58℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35个循环，再72℃延伸300～420秒，扩增完成；

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；

(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜黑斑病的抗性。

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