CN111426838A - 一种玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素复合前处理试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素复合前处理试剂盒，该试剂盒以免疫磁珠为固相载体，经过免疫化学反应，使免疫磁珠上偶联有玉米赤霉烯酮单克隆抗体和赭曲霉毒素单克隆抗体。本发明免疫磁珠上偶联的抗体可准确识别玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素的特征基团，可在短时间迅速、有选择地分离样品中的玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素，从而减少漏检的情况，具有高分离性、高特异性、高稳定性的特点，有效地减少了背景物质的干扰，提高了检测的准确性和精准性。
Description
技术领域
本发明属于一种食品安全检测分析领域，具体涉及一种玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素复合前处理试剂盒。
背景技术
玉米赤霉烯酮是由镰刀菌属真菌产生的有毒代谢物，其在结构上与内源性雌激素相似， 能与雌激素受体相结合，激活雌激素反应元件，从而发生一系列拟雌激素效应，同时其具有较强的生殖毒性、遗传毒性和细胞毒性等，会引起很多种类雌性动物的雌激素过多症和生殖障碍。赭曲霉毒素是由青霉素和曲霉素的某些菌种形成的真菌毒素，主要污染谷物及其制品，被国际癌症研究机构列为2B类致癌物质。基于赭曲霉毒素和玉米赤霉烯酮对人类健康的多重威胁，为了降低食物摄入所带来的风险，许多国家、地区及国际组织都对食品的赭曲霉毒素和玉米赤霉烯酮制定了严格的限量标准，因而必须加强对生产、销售、运输等过程中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素的合理有效监控。
免疫磁珠分离技术是近年来迅速发展起来的免疫学技术，其为免疫学和磁性载体技术结合而成的纳米级材料，在磁珠表面为带有氨基、羧基、羟基或巯基等多种化学官能团，便于其反应。包被抗体的免疫磁珠作为固相载体，其表面的抗体与相应抗原发生特异性结合形成抗原-抗体-磁珠复合物，这种复合物在磁场作用下，迅速向磁场移动，使复合物与其他物质分离，达到迅速分离目的。
发明内容
本发明目的是为了提供一种玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素复合前处理试剂盒，用于样本中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素的痕量富集和净化，以解决当前样品前处理净化分离操作复杂、分离效率低的等技术问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素复合前处理试剂盒，其以免疫磁珠为固相载体，经过化学反应活化，使得磁珠表面带有亲和配基，活化后磁珠与玉米赤霉烯酮抗体和赭曲霉毒素抗体偶联，制得能够对玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素实现快速富集和纯化的样本前处理试剂盒，以便后续HPLC或酶联免疫吸附法的测量。
优选地，所述试剂盒的具体步骤如下：将偶联有玉米赤霉烯酮抗体、赭曲霉毒素抗体的免疫磁珠从冰箱中取出恢复至室温，旋转混匀，将预先处理的样本溶液放入试管中，后将免疫磁珠转移至试管中，充分旋转重悬，室温下旋转捕获20min，以实现最大程度地捕获样本中的玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素，利用磁架进行磁分离，缓慢弃去上清液；将已捕获过样本的免疫磁珠利用清洗液清洗数次，轻摇重悬磁分离，已实现玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素的样本富集净化；将富集净化好的样本液使用洗脱液进行洗脱，室温震荡几秒钟，磁分离，上清液即为待检测的玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素样本，可用于后续的HPLC测定。
优选地，每个免疫磁珠净化试剂盒中所含抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体、抗赭曲霉毒素单克隆抗体分别为：0.5mg-1.5mg和0.5mg-2mg。
优选地，免疫磁珠浓度为5-60mg/mL。
优选地，洗脱液位甲醇；
本发明提供的一种玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素复合前处理试剂盒具体制备方法为：
（1）抗体预处理：将已纯化好的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体及抗赭曲霉毒素抗体置于pH6.5 50mmol/L缓冲液透析过夜12h；
（2）活化：取一定量的磁珠于离心管中，超声分散重悬混匀，分别加入配制的EDC和NHS，在室温下放置于血液混匀仪进行活化反应2h，使溶液一直保持着悬浮混匀状态；
（3）偶联：用磁架进行磁分离，缓慢倒出上清液，同上PBS缓冲液洗涤三次，混匀仪上重悬。将已预处理好的抗玉米赤霉烯酮抗体及抗赭曲霉毒素抗体加入到已活化好的的免疫磁珠中，室温下反应过夜，放置于混匀仪上旋转保持悬浮状态；
（4）封闭：用磁架进行磁分离，倒出上清液，加入60μL的乙醇胺溶液和BSA封闭液，37℃封闭2h，保持悬浮状态；
（5）保存：用PBS清洗免疫磁珠3次，磁分离，弃上清液，于4℃保存于免疫磁珠保存液中；
与现有技术相比，其有益效果为：
本发明可在短时间迅速、有选择地分离内将样品中的玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素的富集与纯化，磁珠上偶联的抗体可准确识别玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素的特征基团，从而减少漏检，具有高分离性、高特异性、高稳定性的特点，有效地减少了背景物质的干扰，提高了检测的准确性和精准性；利用免疫磁珠分离技术，可避免免疫亲和柱法、有机溶剂萃取法提取时需要使用大量有机溶剂的缺点，且不需要多加纯化步骤去除杂质，可直接对毒素分离纯化，操作简便，便于实现自动化。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围，本发明具体实施方式如下。
实施例1一种玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素复合前处理试剂盒，其以免疫磁珠为固相载体，经过化学反应活化，使得免疫磁珠表面带有亲和配基，活化后磁珠与玉米赤霉烯酮抗体和赭曲霉毒素抗体偶联，制得能够对玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素实现快速富集和纯化的样本前处理试剂盒，以便后续HPLC或酶联免疫吸附法的测量。
试剂盒的使用具体步骤为：将偶联有玉米赤霉烯酮抗体、赭曲霉毒素抗体的免疫磁珠从冰箱中取出恢复至室温，旋转混匀，将预先处理的样本溶液放入试管中，后将免疫磁珠转移至试管中，充分旋转重悬，室温下旋转捕获20min，以实现最大程度地捕获样本中的玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素，利用磁架进行磁分离，缓慢弃去上清液；将已捕获过样本的免疫磁珠利用清洗液清洗数次，轻摇重悬磁分离，已实现玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素的样本富集净化，将得到的免疫磁珠用洗脱液进行洗脱，室温震荡几秒钟，磁分离，上清液即为待测的玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素样本，可用于后续的HPLC测定。
实施例2本发明提供的一种玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素复合前处理试剂盒，具体制备方法为：（1）抗体预处理：将已纯化好的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体及抗赭曲霉毒素抗体置于pH6.5 50mmol/L缓冲液透析过夜12h；（2）活化：取一定量的磁珠于离心管中，超声分散重悬混匀，分别加入配制的EDC和NHS，在室温下放置于血液混匀仪进行活化反应2h，使溶液一直保持着悬浮混匀状态；（3）偶联：用磁架进行磁分离，缓慢倒出上清液，同上PBS缓冲液洗涤三次，混匀仪上重悬。将已预处理好的抗玉米赤霉烯酮抗体及抗赭曲霉毒素抗体加入到已活化好的的免疫磁珠中，室温下反应过夜，放置于混匀仪上旋转保持悬浮状态；（4）封闭：用磁架进行磁分离，倒出上清液，加入40μL的乙醇胺溶液和BSA封闭液，37℃封闭2h，保持悬浮状态；（5）保存：用PBS清洗免疫磁珠3次，磁分离，弃上清液，于4℃保存于免疫磁珠保存液中；
实施例3 实际样品的提取检测
1、称取5.0 g的饲料样品与100mL样品稀释液（甲醇-水溶液（7:3））混合，放于震荡器震荡10分钟，离心取上清液，上清液放入样本管中；
2、将免疫磁珠试剂盒加入样品稀释液中，充分混匀后于37℃孵育30分钟，作用完毕后，置于磁力架上捕获磁珠，除去上清液，用缓冲液清洗3次，清洗结束后以无水甲醇洗脱出免疫磁珠上的玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素，所得样品即为富集纯化后的玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素，留待用ELISA、HPLC对玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素进行含量检测。
以上的实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解对专利范围的限制，应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都是属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素复合前处理试剂盒，其以免疫磁珠为载体，经过化学反应活化，活化后磁珠与玉米赤霉烯酮抗体、赭曲霉毒素抗体偶联，制得能够对玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素实现快速富集和纯化的样本前处理试剂盒。
2.根据权利要求1所述的一种玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素复合前处理试剂盒，其特征在于每个免疫磁珠净化试剂盒中所含抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体、抗赭曲霉毒素单克隆抗体分别为：0.5mg-1.5mg和0.5mg-2mg。
3.根据权利要求1所述的一种玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素复合前处理试剂盒，其特征在于所述的免疫磁珠浓度为5-60mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素复合前处理试剂盒，其特征在于使用具体步骤以下：
将偶联有玉米赤霉烯酮抗体、赭曲霉毒素抗体的免疫磁珠从冰箱中取出恢复至室温，旋转混匀，将预先处理的样本溶液放入试管中，后将免疫磁珠转移至试管中，充分旋转重悬，室温下旋转捕获20min，以实现最大程度地捕获样本中的玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素，利用磁架进行磁分离，缓慢弃去上清液；将已捕获过样本的免疫磁珠利用清洗液清洗数次，轻摇重悬磁分离；已实现玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素的样本富集净化；
将上述得到的免疫磁珠用洗脱液进行洗脱，室温震荡几秒钟，磁分离，上清液即为待测的玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素样本，可用于后续测定。
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